の単離のための最適化された濃縮技術アルスロバクテリオファージ種土壌サンプルの分離株から

この手順の全体的な目標は、濃縮プロトコルを使用して土壌サンプルからアルスロバクター細菌の相を分離することです。これは、最初に土壌サンプルを収集し、汚染された土壌微生物から生存可能なファージ粒子を分離することによって達成されます。2番目のステップは、宿主のアースロバクター細菌細胞に単離されたファージ粒子を感染させることです。

次に、感染した細菌細胞をオーガープレートに播種して、プラーク形成によって証明されるファージを特定します。最後のステップは、ストリークプレート法を使用して、明確に分離されたプラークから目的のファージを精製することです。最終的に、この濃縮技術は、アルスロバクター種KY 3 9 0 1からのアースロバクターファージの比較的容易な単離に最適化されています。

この技術が既存の濃縮方法よりも優れている点は、宿主細菌の純粋な培養物に細かくろ過された土壌サンプルを添加することで、競合する細菌の増殖を防ぐことができる点です。この方法は、アルスロバクターファージの単離に有効であることが証明されていますが、他の細菌宿主からのファージの単離にも適用できるはずです。この方法を思いついたのは、他の研究者がアースロバクターファージを見つけるのに苦労していることを知ったときでした。

伝統的なエンリッチメント技術で。私の生徒たちは、関節ファジを成功裏に分離するために使用される技術を実演します。Arthrobacter細胞は、LBオーガープレート上に縞模様のコロニーから培養され、摂氏30度で2〜3日間インキュベートされます。

滅菌ループを使用してコロニーを選び、それを50ミリリットルのlbブロスに加えます。困惑した培養物では、フラスコは振とうインキュベーターでフラスコを225 RPMで摂氏30度で約24時間インキュベートします。ファージ感染実験のための指数関数的または早期固定期細胞を得るため。

細菌の増殖状態を綿密に監視し、細胞が中期から後期の定常増殖に侵入するのを防ぎます。状態。ファージの分離に理想的なOD 600は、0.5から0.7の間です。Arthrobacter属の細菌は一般的な土壌細菌であるため、それらとそれらに感染するファージは、ほとんどの種類の土壌で見つけることができます。

目的の場所から200〜400グラムの土を集めます。少なくとも200ミリリットルのファージ緩衝液が上清にあり、土壌が懸濁するまで穏やかに攪拌または渦巻くことによって抽出混合できるように、十分に大きなビーカーで土壌に少なくとも400ミリリットルのファージ緩衝液を土壌に加え、土壌沈殿物が通常30分間沈殿するのを待ちます。次に、真空ろ過により土壌抽出物を濾紙に通すことにより、土壌堆積物の破片を取り除きます。

ろ過した土壌抽出物200ミリリットルに4グラムのLB粉末を加え、混合して2%溶液を作ります。溶液を真空ろ過により0.22ミクロンのフィルターに通し、滅菌濾液を得ます。可能であれば、すぐに次のステップに進んでください。

それにもかかわらず、必要に応じて、ろ過されたサンプルは、続行する前に最大1週間摂氏4度で保存することができます。しかし、生存可能なファージ粒子の数は、浄化槽技術として、フィルター滅菌されたLB土壌抽出物混合物の複数の50ミリリットル部分を個々の250ミリリットルに分注して使用して減少します。滅菌した振とう、バッフル培養フラスコは、滅菌された2.0モル塩化カルシウム溶液を最終的な所望の濃度に加えます。

異なるアルスロバクターファージは、異なる塩化カルシウム条件下で最適に増殖するため、この手順は、フィルター滅菌LB土壌抽出物混合物を含むフラスコのそれぞれに、後期指数関数的または早期固定相細菌培養物を1〜2.5ミリリットル加えることから始める。培養物のOD600が0.5〜0.7の場合は、1ミリリットルを使用してください。OD 600が0.7より大きい場合は、2.5ミリリットルを使用してください。

フラスコを250 RPMで摂氏30度で振とうするインキュベーターで約24時間振とうします。24時間のインキュベーション期間の後、振とうインキュベーターから濃縮フラスコを取り出します。濃縮サンプルをファージバッファーで10倍に希釈します。

0.5ミリリットルの後期指数関数的または早期定常の培養チューブをセットアップします。フェーズ細菌培養。希釈した濃縮培養物の5マイクロリットルから500マイクロリットルまでの様々な量を培養チューブに加えます。

培養チューブに塩化カルシウムを添加して、元の濃縮フラスコに存在する濃度と等しい5ミリリットルの最終濃度にします。さまざまな塩化カルシウム濃度を使用して、塩化カルシウムの依存性が異なる多くのファージを選択します。各培養チューブに4.5ミリリットルのLBトップオーガーを加え、混合物をLBオーガープレートに注ぎます。

プレート全体に均等に分散するように穏やかに渦巻き、上部オーガーが約15分間固まるまで待ちます。プレートを反転させ、摂氏30度で一晩から48時間インキュベートします。インキュベーション時間を変化させて、プレート上のプラーク形成について24時間のインキュベーションチェック後に存在するファージを最適化します。

ほとんどの単離されたファージは、24時間のインキュベーション期間後に1〜2.5ミリモルの塩化カルシウム濃度で摂氏30度でインキュベートされたプレートから来ており、この手順の最も困難な部分として木の棒を使用して明確に分離されたプラークから目的のファージを精製します。プラークをオーガープレート全体に穏やかに広げて均一なストリークプレートを作成するには、技術的な専門知識が必要です。木の棒を炎に通して冷まして滅菌します。

滅菌した木製の棒でプラークに少し触れ、図のように穏やかな動きでオーガープレートに棒をこすります。パスごとにきれいなスティックを使用してこれを繰り返します。LBオーガープレートに少なくとも3回の縞模様が入ったら、推定ファージ粒子の濃度が最も低い領域をマークします。

マークされた領域に0.5ミリリットルのアースロバクターと4.5ミリリットルの溶融LBトップオーガーを静かに塗布し、プレート全体に均等に広がるようにします。プレートが固まったら、トップオーガーを少なくとも1時間固化させ、反転させ、一晩インキュベートします。ストリークプラーク法を少なくとも3回繰り返して、純粋なファージ種が単離されていることを確認します。

プレートは、必要に応じて摂氏4度で最大1週間保存でき、ファージの生存率を大幅に損なうことはありません。所望のプラークが成長し、最終ストリークプレート上に単離されたら、マイクロピペットチップで1つのよく分離されたプラークに触れ、100マイクロリットルのファージ緩衝液に再懸濁し、この溶液を180マイクロリットルの新鮮なファージ緩衝液にサンプルの20マイクロリットルを通過させることにより、この溶液を10〜マイナス8希釈に希釈する。各希釈液の10マイクロリットルを、培養チューブ内の0.5ミリリットルの増殖アルスロバクターに室温で5〜10分間加えます。

次に、感染した細菌を、元の土壌サンプルからファージを分離するために使用したのと同じ濃度の塩化カルシウムを含む4.5ミリリットルの溶融LBトップオーガーと混合してプレートします。プレートを一晩インキュベートします。摂氏4度で行ったすべての希釈は翌日まで保存してください。

従来のプラーク力価アッセイを使用して、ウェブパターンを作成するために必要なファージシリアル希釈を決定します。ウェブパターンプレートにはほとんどバクテリアがいないが、まだファージが混入されていないバクテリアの残骸が含まれていることを確認します。5ミリリットルの後期指数関数的または早期定常的な関節症培養物を無菌の50ミリリットル培養フラスコに加えます。

アースロバクター培養物にウェブパターンを与えた希釈液を100マイクロリットル加え、ファージが細菌細胞に5〜10分間感染するのを待ちます。室温で、ファージプレートを最初に同定するために使用したのと同じ濃度の塩化カルシウムを含む溶融lbトップオーガーをフラスコに加えます。.この混合物の5ミリリットルを10枚の新鮮なLBプレートのそれぞれに注ぎます。

トップオーガーをプレートを固化、反転させ、翌日に摂氏30度で一晩インキュベートした後、ウェブパターンプレートにプレートあたり5ミリリットルのファージバッファーを浸水させ、摂氏4度で一晩保存します。0.22ミクロンのシリンジフィルターでファージライセートをろ過します。この最終的なファージストックは、長期保存のために摂氏4度で保存してください。

このビデオで示した濃縮手順で、マイナス80°Cでストックアーカイブ用の小さなバイアル中の滅菌グリセロールに同量のファージ溶解物を添加し、初期濃縮後に純粋なファージ集団を単離するプラークストリーク法とLBオーガーへのプレーティングが示されているものは、室温でのファージDIのプラークの単離からの代表的な結果であり、 摂氏30度と摂氏37度。プレートのうち2つの赤い円は、明確に分離されたプラークを囲んでいます。ファージ・ディランは、3つの異なる温度で同様のプラークを生成します。

あるいは、従来の標準的なプラーク力価アッセイを使用して、純粋なファージ分離物を単離してもよい。このアッセイは、プレート上にウェビングパターンを形成するためのファージ力価数とプラーク形成単位の数を経験的に決定するために使用されました。ファージバナナの段階希釈のセットを、良好なウェブパターンがどのように見えるべきかの例とともに示しています。

これらは、濃縮技術を用いて単離された20のアルスロバクターファージの電子顕微鏡画像です。現在単離されている25のファージのうち、23のファージは、かなり長い尾を持つcifoウイルスです。単離されたファージのうち2つは、尾部と長さが近い頭部の直径を含むMyoウイルスです。

濃縮プレーティングを習得すると、さまざまな土壌サンプルからアルスロバクターファージを成功裏に分離できるようになるはずです。このビデオを見た後、あなたはよく環境土壌サンプルからストリークペイント方法で使用されるファージを浄化する方法を理解しているはずです。