Name: の単離のための最適化された濃縮技術アルスロバクテリオファージ種土壌サンプルの分離株から (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: 学ぶArthrobacterバクテリオファージの濃縮プロトコル。土壌サンプルからの単離、宿主細胞への感染、プラーク形成と純化の手法を含む。微生物学とウイルス学研究に応用可能。

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このプロトコルの開発のための資金は、高等教育のための南東ペンシルベニア州コンソーシアムとカブリーニカレッジ科学部によって提供されました。追加の資金と支援はアルカディア大学とImmaculata大学から来ました。我々は、特に親切に私たちの孤立したファージの電子顕微鏡画像を撮影するために、セントジョセフ大学で博士カレンSnetselaarに感謝。追加のサポートは、ゲノミクスと進化科学（SEA-のファージ）プログラムを推進ハワード·ヒューズ医学研究所の科学教育連盟ファージハンターによって提供された。

ファージを単離するためのArthobacter細胞の作製<ul><li>文化アースロバクター·エスピー KY3901コロニーは2〜3日間30℃でインキュベートルリアBertaini（LB）寒天プレート上にストリーク。コロニーを採取し、バッフル培養フラスコ中のLBブロス250ミリリットルに追加し、30℃で225rpmで振盪インキュベーター中でインキュベートし、滅菌ループを使用。 </li><li>ファージ感染実験のために後半早い/指数関数定常期の細胞を得るための成長の約24時間を許可します。後半定常成長状態に真ん中に入るから細胞を防ぐために密接に細菌増殖の状態を監視します。 注：細胞増殖は、後述するファージの単離および精製手順/ステップのために0.5-.0.7間の光学濃度OD 600で構成する必要があります。 </li></ul>土壌サンプルからのファージの2コレクション<ol><li>目的の場所から土壌の200〜400グラムを収集します。注：Arthroba中の細菌以来CTER属は、それらを感染させるファージに見出され、土壌のほとんどの種類に普及していることができる一般的な土壌細菌である。 </li><li>土壌へのファージバッファ（PB）[68 mMの塩化ナトリウム、10mMのMgSO 4を、10mMのTris-CL液（pH7.5）]の少なくとも400 mlを加えPBの少なくとも200ミリリットルになるように十分な大きさのフラスコ内で混合上清中および抽出することが可能である。 </li><li>土壌が中断されるまで、静かに撹拌または旋回により混合し、土壌の堆積物は、典型的には30分を決済することができます。 </li><li>土壌堆積物の破片を除去する重力濾過により濾紙を通して「土壌抽出」を渡す。 </li><li> LB粉末を追加して、2％溶液（200ミリリットル土壌抽出物中の4グラムLB粉末）を作るために混合する。 </li><li>無菌の濾液を得、真空濾過により0.22μmのフィルターを通して溶液を通過させる。可能な場合は、すぐに2.7のステップに進みます。必要性は、4℃で、店舗フィルタリングされたサンプルは、しかし、生存可能なファージ粒子の数を進める前に、一週間までのためである場合削減されます。 </li><li>一定分量の複数の無菌技術を使用してバッフル培養フラスコを振っ滅菌個々の250ミリリットルにフィルター滅菌LB /土壌抽出液の50ミリリットル部分。異なるアースロファージが異なるのCaCl 2の条件で最適に成長するので、最終的な所望の濃度（0-50 mM）を滅菌2.0 M CaCl 2溶液を追加します。 注：私達は私達によって識別アースロファージの大半が1 MM-2.5のCaCl 2の範囲内であることを見つける。しかし、単離されたファージのいくつかは非常に高いのCaCl 2濃度で0のCaCl 2 .ORで独占的に我々が成長した。 3.1すぐにステップ進んでください。 </li></ol> 3.ファージの単離<ol><li>フラスコのそれぞれに1後半早い/指数関数定常期の細菌培養物を2.5ミリリットルに追加します。 0.5から0.7 OD 600のために、細胞の1ミリリットルを使用しています。 0.7のODよりも高いOD 600の場合の2.5ミリリットルを使用細胞。 注：指数関数的増殖期の細胞は、通常より多くのファージは、固定相成長の細胞よりも高い力価が得られる。 </li><li>振盪インキュベーター中で約24時間、30℃、250rpmで振盪フラスコ。 </li><li> 24時間のインキュベーション期間の後、振盪インキュベーターから濃縮フラスコを取り除き、濃縮サンプルをファージ緩衝液中で10倍に希釈する。 </li><li>後半早い/指数関数定常期の細菌培養物0.5ミリリットルで培養管を設定し、培養管に集積培養の様々な量（PBで10 -1希釈液500μlに5μl）を追加します。 注：これは、それぞれの土壌サンプルを濃縮した後に別のファージ力価を生成するので広範囲の濃度をテストすることをお勧めします。 </li><li>オリジナルの濃縮フラスコに存在する濃度に最終濃度が等しくなるように培養管に塩化カルシウムを追加します。 W多くのファージを選択するために異なるのCaCl 2濃度の範囲を使用してくださいi番目のCaCl 2の依存関係を変化させる。 注：ほとんどのファージは1〜2.5 mMとのCaCl 2の範囲内で分離されますが、0〜50のCaCl 2濃度からどこでも最も最適に分離されたファージがある。このためには、ユニークな孤立したアースロファージの数を最大化するのCaCl 2濃度の範囲を確認するのが最善です。 </li><li>培養管にLBトップアガーの4.5ミリリットルを混合し、LB寒天プレート上に混合物を注ぐ。均等にプレート全体に分散し、約15分間固化するトップアガーを可能にするために穏やかに渦巻。 注：トップ寒天は、より大きなバッチ（250ml）中で調製する​​ことができ、余分なトップ寒天を室温で保存し、少なくとも2週間、その後の実験のために再利用することができる。トップ寒天を作るために使用される様々な式がありますが、私たちは、LBと混合した寒天の7グラム/ Lを使用して寒天トップを作る実験の過程で液体状態を保持するための60°Cの水浴中でトップアガーを置く。 </li><li>反転トン彼プレートと48時間に（温度30℃）でO / N所望の温度でインキュベートする。これらの条件が存在するファージのために最適化することが異なります。ほとんどの単離されたファージを、24時間のインキュベーション期間の後に1〜2.5のCaCl 2濃度で30℃でインキュベートしたプレートから来る。 </li></ol> 4.ファージ精製<ol><li>プレート上のプラーク形成のための24時間のインキュベーションのチェックの後。全くプラークが明らかでない場合には最大72時間のインキュベーションを続行するか、追加のプラークが表示されますかどうかを判断する。週間まで4℃で前に進むのための推定プラークと、店のプレートを必要に応じて。 注：それは一つのプレート上の異なるプラークの形態の多様を見つけることは珍しいことではありません。インキュベーションの3日後にプラークを見つけることは可能ですが、まれである。 </li><li>ストリークプラーク法を用いて明らかに単離されたプラークから、所望のファージを精製する。無菌木製の棒でプラークをタッチします。炎を通して木の棒を実行することにより、ストリークプラークを、allowin簡潔に冷却した後、 図1に示すように、穏やかな運動で寒天プレート上の棒をこすりするGスティック。各パスのためのクリーンスティックを使用してこれを繰り返します。 </li><li>また、個々のファージプラークを分離するために、伝統的なプラーク力価アッセイを使用しています。プラーク力価アッセイは、LB寒天LB上層寒天と、ファージプラークを単離するためのペトリ皿のような材料として、複数の試薬の使用を必要とする。我々は、ストリークプラーク法を用いて非常に成功しているが、それは、プラーク力価アッセイを用いて、個々のプラークを単離することが技術的に容易である。 </li><li> LB寒天プレートを少なくとも3回に画線すると、推定上のファージ粒子の最低濃度領域をマークし、GENTLY母板として塩化カルシウムの同じ濃度を含む（ アルスロ 0.5mlの溶融LBトップアガー4.5mlの適用）、それは、プレート全体に均等に分散することができます。 </li><li>プレートO / Nを反転し、インキュベートする。ストリークプラークを繰り返します純粋なファージ種を確保するために、少なくとも3回の反復のための技術が単離される。ファージの生存率の有意な損失なしにすじの間で、必要に応じて週まで4℃で保存プレート。 </li><li>一度希望するプラークが、最終的なストリークプレート上で増殖させ、単離されている、マイクロピペットの先端で1よく孤立したプラークをタッチし、100μlのPBで再サスペンド。シリアルに新鮮なPBの180μLにサンプルを20μlを渡すことで、10 -8希釈にこの10 0ソリューションを希釈する。 </li><li> CaCl 2を同じ濃度で含有する溶融LBトップアガー4.5 mlの感染細菌を混合して5〜10室温で分およびプレート培養チューブ中で増殖させたアルスロ 0.5mlの各希釈物10μlを追加するファージを単離するために使用元の土壌サンプルから。次の日まで4℃で行われたすべての希釈液を保存します。 </li><li>伝統的なプラーク力価としてを使用してWebパターンを作るために必要なファージの連続希釈を決定します言う。プラーク力価アッセイの目的は、ウェブパターン板を得るために必要なファージ力価を決定することである。として主に細菌を欠いたが、まだのファージによって溶解されていない細菌の残骸を含むWebパターンプレートを識別します。無菌の50ミリリットル培養フラスコに後半早い/指数関数的に静止アルスロ文化の 5ミリリットルを追加します。 <ol><li>培養フラスコ内（ アースロ文化にウェブパターンを与えた）希釈液100μlを加え、ファージを室温で5から10分間細菌細胞に感染することができます。最初に10新鮮なLBプレート上にプレートし、ファージをこの混合物を5mlを識別するために使用されるのCaCl 2の同じ濃度を含む溶融LB上層寒天と混合する。固化し、30℃で反転したプレートをインキュベートすることを許可する。 </li></ol></li><li>次の日は、4℃または室温で4時間後にPBや店舗O / N 5mlのウェブパターンプレートをあふれさせる。 </li><li> 0.22μmのシリンジフィルターを通してファージ溶解物をフィルターそして4℃で保存する。ファージ粒子の電子顕微鏡像、標準的な手順を用いてDNAの制限酵素分析およびゲノム配列決定のためのファージゲノムDNAの分離のような追加の実験のために、この最後のファージストックを使用する。ファージストックの長期保存のため、-80℃でストック·アーカイブ用の小さなバイアルに無菌グリセロールにファージ溶解等量のを追加します。 注：これらのファージ技術で経験していない人のために、偉大なリソースがオンラインでアクセスwww.phagesdb.orgサイトです。 </li></ol>

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</ol>

著者は競合する経済的利益を宣言していない。

アルスロホストに感染することができるファージを単離するための多くの以前の試みにもかかわらず、私たちは、標準的な濃縮手順を使用してほとんど成功していた。環境サンプルからファージを豊かにするバンTwestとKropinski 10によって開発され、適合した細菌の濃縮の一般化された方法は、濃縮手順の大多数のための基礎のまま。以前の研究からの証拠は、ダイレクトプレーの方法は、分離5の非常に低い成功率ではあるがアースロバクターの菌株に検出可能なプラークを生産していることを示唆している。ダイレクトプレーティング法により、ファージをファージバッファに土壌試料から抽出し、雑菌を除去するために濾過される。ファージ粒子を含有する濾過抽出物は、宿主細胞の感染を可能にするために、所望の細菌宿主に添加し、細菌の増殖およびファージ増幅のさらなるラウンドなしでメッキされる。 当社の濃縮技術は堅牢でオペアンプですアースロバクター·エスピー KY3901からアースロファージの比較的...

土壌環境でのロバクター種の普遍性は、宿主細菌のこの種から単離されることができるファージの膨大な数と多様性を提供しています。 Acintobacteriaceaeファミリーの細菌メンバーは、アトラジン、様々な他の殺虫剤や除草剤の1,2,3のような扱いにくい化合物を分解することが彼らの異化経路のための最も注目すべきである。ほとんどの研究は、 アルスロバクターの環境の株を用いて行われたが、この属の臨床分離株は、血液、尿、目、すべての系統発生異質4を表示する他の多くのヒト供給源において見出される。 アースロバクター菌の研究のかなり大規模なボディがありますが、唯一の少数の研究は、この多様な属のメンバーに感染することができるのファージについて報告する。興味深いことにしかし、 アルスロで以前に行われた作業は、土壌のタイピングなど、いくつかの重要な個別のトピックにタッチをファージを&lt;em&gt;のアルスロバクター種5、活性汚泥処理プラント6、及び作業強調部位特異的組換えおよびインテグラーゼ遺伝子7において有害な泡の低減を目的と工業用途。 様々な濃縮技術プロトコルは、純粋なファージは、 アルスロバクター種において単離生成するために使用されてきた。初期の手順は、1年以上8の期間のためのニコチン塩のような追加された有毒物質しかA.に感染することができるのファージを生じさせるとともに、土壌のインキュベーションを含むスロバクター 。不安定な有機物が長い潜伏期間を8を省略し 、プラークアッセイ技術により検出可能なファージを生成するために登場して土を使用して行われた研究は、パーコレート。興味深いことに、ダイレクトプレーティングに似た手法は、低い成功率の過去の研究を引用して、まだ研究者5によって著しく低い成功率を有しながら、いくつかのファージを生じる過去に使用した<s&gt; 8まで。 全体的に、過去に使用される分離技術は、最も一般的な好気性土壌を表すロバクター属にもかかわらず、実際にはほとんど効 ​​果を持つために注目すべきであったが、自然4,9に隔離する、水や土壌からファージを単離するためのヴァンTwestとKropinski 10現在の濃縮方法環境細菌分離株が、これらの濃縮技術を豊かにするために使用される以前の技術から適応は、 アルスロファージを単離する非効率的な証明した。ここで説明する方法の目的は、初期の濃縮方法は、この細菌属からファージを単離することに関連した以前の技術的な課題を克服し、一貫して効果的にアースロファージを分離するように適合させることができることを「コンセプトの証明」を示すことです。

<table><tbody><tr><td>LBブロスパウダー</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP9722-2</td>これらをまとめ<td>て注文するのが最善です。</td></tr><tr><td>粒状寒天</td><td>フィ</td><td>ッシャーBP1423-2</td>これらをまとめ<td>て注文するのが最善です。</td></tr><tr><td>0.22 umシリンジフィルター</td><td>フィッシャー</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um ブフナーフィルター</td><td>フィッシャー</td><td>430320</td><td>レシーブチューブを慎重に交換することで、50ml以上の液体を得ることができます。</td></tr><tr><td>エッペンドルフチューブ</td><td>フィッシャー</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>5 ml ピペット インディビジュアル</td><td>フィッシャー</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>50 ml コニカルチューブ</td><td>フィッシャー</td><td>76002844</td><td></td></tr><tr><td>15 ml コニカルチューブ</td><td>フィッシャー</td><td>76002845</td><td></td></tr><tr><td>10 ml ピペット 10 ml ピペット</td><td></td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>25 ml ピペット インディビジュアル</td><td>フィッシャー</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Whatman定性的な濾紙</td><td>フィ</td><td>ッシャー1001-824</td><td></td></tr></tbody></table>

の単離のための最適化された濃縮技術<em&gt;アルスロ</em&gt;バクテリオファージ種土壌サンプルの分離株から

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

>jove_content<環境サンプルからのバクテリオファージの分離は、微生物学の先駆者によって定められた原則を使用して、何十年にもわたって行われてきました。Arthrobacter宿主に感染するファージの単離は、おそらく以前の多くの単離技術の成功率が低いため、研究に利用できるArthrobacterファージのグループが少なく評価されているために限られています。ここで説明する濃縮技術は、他の多くの技術とは異なり、インジケーターバクテリアの成長のベースとして、汚染細菌を含まないろ過された抽出物であるArthrobactersp. 具体的にはKY3901です。最初に土壌細菌を除去することにより、標的ファージは、初期の土壌サンプルに存在する天然の土壌細菌との競合によって妨げられることはありません。この濃縮法により、いくつかの異なる土壌タイプから数十のユニークなファージが生成され、同じ濃縮土壌サンプル分離株から異なるタイプのファージが生成されました。この手順の使用は、非常に多様な興味深い宿主細菌のファージを単離するために、ほとんどの栄養豊富な好気性培地に拡大することができます。

アースロファージのための改善された濃縮技術の再現性を実証するために、30種類の土壌サンプルは、固有のアースロファージは、この濃縮を使用して採取した土壌サンプルの22から得られたこれらの30の土壌サンプルの2014年の春と夏の間、異なる時間と場所で使用した手順。標準濃縮手順は、同じ土壌試料の3からユニークなファージを得た。濃縮サンプルは、プラークまたはプラークの検出に成功のために濃縮されたアルスロの大きな体積を必要とする比較的低いファージ力価を分離するために最初の希釈を必要とする非常に高いファージ力価を持つことができます。私たちは、最初の濃縮およびLB寒天上にプレーします（ 図2）の後に、純粋なファージ集団を単離するためにプラークストリークメソッドを使用します。あるいは、従来の標準的なプラーク力価アッセイは、この方法は多くの時間、試薬および材料を要するものの、純粋なファージ単離物を単離することができるS。前述のように、我々は実験的にプレート上ウェビングパターンを形成するファージ力価数およびプラーク形成単位（PFUで）の数を決定するために、プラーク力価...

私たちは、Arthrobacter属の細菌に感染するバクテリオファージの単離のための濃縮プロトコルを提示します。この濃縮プロトコルは、土壌分離株からのArthrobacterファージの単離と増幅について、迅速で再現性のある結果をもたらします。

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of ...

本手順の全体的な目的は、濃縮プロトコルを用いて土壌サンプルから arthrobacter 菌ファージを分離することです。まず、土壌サンプルを採取し、混入している土壌微生物から生存可能なファージ粒子を分離します。次に、分離したファージ粒子を用いて、宿主となる arthrobacter 菌細胞に感染させます。次に、感染させた細菌細胞をアガープレートに播種し、プラーク形成によってファージを同定します。最終ステップでは、ストリークプレート法を用いて、明確に分離したプラークから目的のファージを精製します。最終的に、この濃縮法は、arthrobacter species KY 3 9 0 1からアルスロバクターファージを比較的容易に分離できるように最適化されています。既存の濃縮法に対する本手法の主な利点は、微細フィルターでろ過した土壌サンプルを宿主細菌の純粋培養液に添加することで、競合する細菌の増殖を防げる点にあります。この方法は、Arthrobacterファージの分離において有効であることが証明されていますが、他の細菌宿主からのファージ分離にも適用可能です。私たちは、他の研究者がArthrobacterファージの発見に苦労していることを知り、この手法を考案しました。従来の濃縮法を用いて、Arthrobacterファージを正常に分離するために使用される手法を学生が実演します。LB寒天プレートにストリークして形成されたコロニーからArthrobacter細胞を採取し、30 °Cで2〜3日間培養します。滅菌済みのループを用いてコロニーをピックアップし、50 millilitersのlb brothに添加します。バッフル付き培養フラスコを用い、振盪インキュベーターにて30 degrees Celsius、225 RPMで約24時間インキュベートします。これにより、ファージ感染実験用の対数増殖期または定常期初期の細胞を得ることができます。細胞が定常期の中期から後期に入らないよう、細菌の増殖状態を注意深く監視してください。ファージ分離に最適なOD 600は0.5から0.7の間です。Arthrobacter属の細菌は一般的な土壌細菌であるため、これらの細菌およびそれらに感染するファージは、ほとんどの種類の土壌で見つけることができます。目的の場所から200〜400 gの土壌を採取します。十分に大きなビーカーに土壌を入れ、少なくとも400 mLのファージバッファーを加えます。これにより、上澄み液に少なくとも200 mLのファージバッファーが含まれ、抽出可能になります。土壌が懸濁するまで静かに撹拌または旋回させて混ぜ合わせ、通常30分間放置して土壌沈殿物を沈降させます。次に、吸引ろ過によって土壌抽出液をろ紙に通し、土壌沈殿物の破片を除去します。ろ過済みの土壌抽出液200 millilit

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Environment

環境

出典: ワトソン、DC、 et.al。大腸菌と他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離と精製 J. Vis. 経験。 (2021年)このビデオは、遺伝子組み換え細菌の外膜に由来する細胞外小胞(EV)の単離と濃縮を示しています。このプロセスには、細菌を培養して EV...

細菌からの外膜由来細胞外小胞の単離と濃縮

出典: Cross, T. ら、土壌サンプル分離株からアルトロバクターバクテリオファージ種の分離のための最適化された濃縮技術。 J. Vis.

バクテリオファージ感染のための土壌細菌培養の準備

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp.(2015)This video demonstrates the isolation of bacteriophages from a soil sample. A soil sample is collected and suspended in a phage buffer and allowed to settle the sediment. The extract is filtered, and nutrients are added. A vacuum filtration is done to remove microbial contaminants. The filtrate with phages is aliquoted into flasks, and...

Isolation of Bacteriophages from a Soil Sample

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the isolation of Arthrobacter bacteriophages from a soil sample using enrichment and plaque assay techniques. It highlights the infection, amplification, and visualization of phages as clear lysis zones formed on a bacterial lawn.

Isolation of Arthrobacter Bacteriophages from a Soil Sample

環境家禽生産サンプルで使用するための新しい半自動ハイブリッドDNA抽出法が開発され、全細菌群集の量的および質的推定値に関して、一般的な機械的および酵素的抽出方法よりも改善が実証されました。...

家禽生産のサンプルからの細菌群集の定性的および定量的評価のためのハイブリッドDNA抽出法

細菌は、生理活性のある生体分子を運ぶナノメートルサイズの細胞外小胞(EV)を分泌します。EVの研究は、それらの生合成、微生物-微生物および宿主-微生物の相互作用および疾患における役割、ならびにそれらの潜在的な治療用途を理解することに焦点を当てています。EV研究の標準化を促進するために、さまざまな細菌からEVをスケーラブルに分離するためのワークフローが提示されます。...

大腸菌およびその他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離および精製(英語)

昆虫病原性真菌コロニーは、 テネブリオ 餌、 ガレリア...

土壌試料からの昆虫病原性菌類の分離方法の比較

地熱泉からの重金属耐性微生物の単離は、バイオレメディエーションおよび環境モニタリングバイオシステムの開発にとってホットな話題である。この研究は、温泉から重金属耐性菌を単離し同定するための方法論的アプローチを提供する。...

環境汚染に対処するための極限環境微生物のバイオプロスペクティング

ここでは、低分子量の細胞外DNAの割合を高めることにより、環境中の抗菌薬耐性(AMR)を評価する簡単な手法を紹介します。20%-30%のPEGと1.2 M...

抗菌薬耐性の包括的評価のための廃水からの低分子量DNAの抽出の強化 

ここでは、シアノファージ(およびその宿主)を単離するための海洋および淡水生態系のユーフォティックゾーンからのサンプリング方法と、単一の遺伝子型を濃縮し、ウイルスと宿主の相互作用ダイナミクスを特徴付けるサンプリング後のプロセスについて説明します。...

光合成微生物とそのウイルスの環境サンプリング:フィールドからラボまで

学ぶArthrobacterバクテリオファージの濃縮プロトコル。土壌サンプルからの単離、宿主細胞への感染、プラーク形成と純化の手法を含む。微生物学とウイルス学研究に応用可能。

の単離のための最適化された濃縮技術

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