イオン選択自己参照微小電極法を用いた細胞外イオンフラックスの測定

この手順の全体的な目的は、イオン選択性自己参照型マイクロ電極法を用いて、生体内で細胞外イオンフラックスを測定することです。これは、まずイオン選択性マイクロ電極と参照用マイクロ電極を組み立てることで達成されます。第二のステップでは、イオン選択性自己参照型マイクロ電極の校正とバリデーションを行います。

次に、生物学的試料においてイオン特異的フラックスの測定を電圧記録の形式で行います。最後に、この電圧記録をイオンフラックスに変換します。最終的に、この手法を用いることで、生細胞または組織における特定の細胞外イオンフラックスの正確かつ非侵襲的な測定が可能になります。

これらの手法は、再生や病理だけでなく、生理学や老化における重要な疑問の解明に役立ちます。例えば、本手法を用いることで、組織の形態形成、成長、分化などの生物学的プロセスを制御する特定のイオンフラックスの特定が可能になります。この手順の実演は、ポストドクターのGim Ardi博士とBenjas博士の研究室が行います。電極の校正を行う前に、1 mmの金製オスコネクタと塩化銀被覆銀線を備えたマイクロ電極ホルダーに、充填済みのイオン選択電極を装着してください。

次に、マイクロ電極ホルダーを3軸コンピュータ制御電子マイクロポジショナーに取り付けます。イオン選択性電極には、あらかじめ電解質および目的のイオンに対応するイオンフォーカクテル溶液が充填されている必要があります。装着後、電極を1 mMの塩化カリウム溶液に浸します。

さらに、3 Mの塩溶液を含むアガー、塩化銀でコーティングされた銀ペレット、および参照電極用の2 mm金製オスコネクタを備えた直線型マイクロ電極ホルダーに、参照電極を取り付けます。塩溶液の選択は、測定するイオン種によって異なります。参照電極を準備した後、磁気スタンドに予め取り付けられた手動マイクロポジショナーに電極ホルダーを装着します。

電極を固定した後、1 mMの塩化カリウムを含む溶液に浸します。開始前に、イオン選択性電極のセットアップを用いて、目的のイオンを含む電解質校正標準液の希釈系列を調製しておきます。例えば、生理学的濃度である約1 mMのカリウム陽イオンを検出する場合、10 mM、1 mM、0.1 mMの3つの対数系列の塩化カリウム溶液を作成します。

これにより、アッセイに必要な検出のダイナミックレンジが最大化されます。イオン選択性電極を校正するには、まずイオン選択性電極と参照電極の両方を、最も低濃度の校正液（本ケースでは0.1 millimolar）に浸します。室温で1〜3分間の短い安定化時間を置いた後、定常状態の電圧を測定し、記録します。

残りの校正標準液についても電圧測定を繰り返し、測定された電圧をイオンモル濃度の対数に対してプロットします。各標準溶液について線形回帰を行い、校正曲線のネルンスト傾斜、切片、および決定係数を算出します。ネルンスト傾斜を計算する際は、測定電圧を電圧増幅器の全ゲインで割ることを忘れないでください。

測定プロトコルを実証するため、穿孔したアフリカツメガエル卵母細胞からのカリウムイオンの流出を、カリウム感受性マイクロ電極を用いて評価します。イオン選択性電極のセットアップを開始する前に、800 µmのナイロンメッシュから1 cmのパッチを切り出し、プラスチック製ペトリ皿に接着させます。また、100 mM NaCl、2 mM KCl、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、および5 mM HEPESを含む、以下の組成のMark改変リンガー液を事前に準備しておきます。水酸化ナトリウムを用いてバッファーのpHを7.5に調整し、調製したバッファーをペトリ皿に分注します。

カエルの細胞、イオン選択電極、および参照電極をシャーレに慎重に配置します。次に、細胞に穿孔し、マイクロポジショナーを作動させて、イオン選択電極がサンプルから約10 microns離れた位置にくるようにします。用語の定義として、このサンプルと電極の間の距離を近接位置（close position）と指定します。

次に、イオン選択性電極が10 µmの近接位置から100 µmの遠位位置まで周期的に移動し、再び近接位置に戻るようにマイクロポジショナーを作動させます。移動速度は0.3 Hz、つまり10秒間に3往復となるように設定してください。マイクロポジショナーの作動中は、電極の動きが細胞の損傷した接線表面に対して完全に垂直であることを確認し、電圧測定および記録ソフトウェアを起動します。電圧データの収集中、マイクロポジショナーは近接位置と遠位位置で短時間一時停止するようにプログラムされています。

卵母細胞の創傷治癒の際は、データを連続的に記録します。このプロセスは約15分かかります。一方、opusオタマジャクシの尾の再生のような数日間にわたるプロセスの観察などの長期的な実験では、異なる時点（例：1、3、6、12、24時間後）で2分間の測定記録を行います。実験終了後、電圧データをテキストファイルとして抽出し、値をスプレッドシートにコピーします。

あらかじめ作成した検量線を用いて、測定された電圧値を対応するイオン濃度に変換します。外挿したイオン濃度を、生物学的試料からの距離の関数としてプロットします。最後に、フィックの拡散法則を用いてイオンフラックスを算出します。

ここで、Cは溶液中のイオン濃度、MUはイオン移動度、DC DXは距離dxあたりの濃度差を表します。生物学的実験に先立ち、NERの勾配切片の値およびイオン選択性電極の校正曲線全体を、ペトリ皿に配置した1 molarのイオン源から生成した人工イオン勾配を用いて検証することができます。カリウムイオン濃度の変化を、annu site woundに近い距離または遠い距離でプロットした場合についてです。

データは、細胞損傷の開始時に大規模なカリウムフラックスイベントが発生することを示唆しており、創傷治癒が進むにつれて、カリウムフラックスは徐々に減衰し、創傷が完全に治癒した15分後には静止レベルに戻ります。さらに、測定されたカリウムイオン濃度をイオンフラックスに変換すると、損傷後のカリウムフラックスの急激な増加と緩やかな減少は、無傷の対照卵母細胞と比較して統計的に有意な効果であると考えられます。この手順に続き、細胞間および細胞内イオンフラックスの特性に関するさらなる疑問を解決するために、蛍光バイオエレクトリシティ標識などの他の手法を実施することが可能です。