Name: イオン選択自己参照微小電極法を用いた細胞外イオンフラックスの測定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: 学ぶイオン選択自己参照微小電極法による細胞外イオンフラックスの非侵襲的測定法。生きた細胞や組織におけるイオン動態を正確に評価し、生理学や病理学研究に応用できます。

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この作業は、全米科学財団の助成金MCB-0951199、一部はNIHの助成金EY01910、カリフォルニア再生医療研究所の助成金RB1-01417、およびFundação para a Ciência e Tecnologia（FCT）助成金）SFRH/BD/87256/2012によって支援されました。

1.イオン選択自己参照微小電極作製<ol><li>イオン選択性微小電極の作製<ol><li>熱は微小電極プラーを使用してフィラメント（1.5ミリメートル外径、1.12ミリメートル内径）を使用せずに薄い壁ホウケイ酸毛細血管を引き出します。 注：これは、先端に直径3-4ミクロンを提供します。小さいヒントは、電子ノイズの微小電極受けやすく、また、イオン濃度の変化に遅く応答と関連する、より高い抵抗性を有します。有用な情報は、Smith らによって発表された論文に記載されています。26。 </li><li>親油性イオノフォアカクテルの保持を補助するための内側表面を疎水性にするために電極をSilanize。それらを乾燥させるために&gt; 100℃のオーブンで金属ラックおよび熱O / Nで微小電極を配置します。ラックは、直径2mmの孔を有する金属板を介して方法の一部を掘削します。 250ミリリットルgの上向きの穴先端に電極を配置しますその上小娘ビーカー。 </li><li>午前中は、オーブンをオフにして、絶縁手袋を着用し、慎重に所定の位置に電極を、ビーカーの金属ラックを削除します。熱を保持するためにオーブンのドアを閉じます。 </li><li>ラテックスまたはニトリル手袋、白衣と目の保護具を着用します。プラスチック製パスツールピペットで、私は、各電極の基部にシラン化溶液の液滴を配置（場所にビーカーを保つ、ピペットアクセスのための注ぎリップを使用します）。シラン化ソリューションは、ホットプレートで気化して、電極の内部をsilanizesれます。この段階での化学抽出ヒュームフードを使用してください。数時間は残りのシラン化液が蒸発することを可能にするために高温のオーブンでラック/ビーカー/電極を裏面に配置します。 注意：安全のため、背面にオーブンの電源を入れないでください。それは有害で可燃性蒸気を含んでいてもよいように、それがオンにされてはならない示すオーブンのラベルを配置します。 </li><li>冷却後、微小電極の保存瓶INSIに微小電極を保存乾燥剤400gでガラスデシケーターをデ。微小電極は、何週間もこのようにして保存することができます。 注意：代替のシラン化方法は、Smith らに記載されている26。 </li><li>測定されるべきイオンの100mMの（ 表1及び図1Bを参照）を含む溶液の50〜100μlの微小電極（約1cmの長さ）をバックフィル。細かいフィラメントにブンゼンバーナーに引っ張ら使い捨てのプラスチック製パスツールピペットの熱を使用してください。閉塞を防止するために、その後のdH 2 Oでピペットを洗浄します。 代替的に、外部溶液27中のイオンの濃度に一致するように埋め戻し液のイオン濃度を調整注：。 </li><li>気泡が存在しないことを保証するために、解剖顕微鏡下で微小電極を観察します。 <ol><li>垂直方向に電極を保持しながら気泡が指の爪で軽く微小電極存在タップしている場合（先端を下に）および/または泡をプッシュ針を交換するシリコーンチューブで修飾された注射器を使用して、背圧を適用することにより、先端をね。 </li></ol></li><li>イオン固有のイオノフォアカクテルの15〜20 NL（30〜50ミクロンの長さ）で微小電極をヒントフィル（ 表1参照）。顕微鏡スライドの短辺にイオノフォアカクテルの小液滴を配置します。解剖顕微鏡下で微小電極の先端部を観察し、微小電極の先端が約半分しか秒間イオノフォアカクテルに接触するまで、顕微鏡スライドに向かって移動します。毛細管圧力によって微小電極にイオノフォアカクテルを描画します。 注意：これは、電子干渉（ノイズ）にそれが影響を受けやすくすることができ、プローブの電気抵抗が増加し、また、応答時間を遅くするようイオノフォアカクテルの長い列を避けてください。 </li><li>金1ミリメートルオスコネクタとのAgCl（銀+）線（ 図1B）でストレート微小電極ホルダーに微小電極をマウントします。&lt;/ LI&gt; <li> 3次元コンピュータ制御の電子マイクロポジショナー（ 図1A）に搭載されたヘッドステージに微小電極ホルダーを取り付けます。 </li><li>サンプルを測定するための適切なソリューションを測定する微小電極の先端を配置し（生理食塩水、培地など ）微小電極が時間または2つ、あるいは一晩安定化することを可能にします。 </li></ol></li><li>参照電極の作製<ol><li>参照電極（ 図1C）は 、上記と同様の毛細血管です。 5cmの長さにダイヤモンド鉛筆でキャピラリをカットし、ブンゼン火炎中1-2秒間の各端部での火災は、研磨。 </li><li> 2％アガロースでのNaClの3M溶液、CH 3 CO 2 K（酢酸カリウム）またはKClを〜200μlでこれらの電極を埋めます。イオンに応じてソリューションを測定することを選択します（参照電極は、測定されるイオンを含むべきではありません。 表1を参照）。ミックスアガロースとほぼ電子レンジで沸騰するまで溶液および熱。アガロースを溶解するために撹拌し（溶液は透明になります）。 </li><li>プラスチックパスツールピペットに参照電極を取り付け、キャピラリー内に高温の溶液を引き出します。 </li><li>使用前に密封されたチューブ内でこの3 M溶液に冷3 MのNaCl、CH 3 CO 2 KまたはKCl溶液とストアに電極をドロップします。気泡を有する任意の参照電極を捨てます。 </li><li>ストレート微小電極ホルダーに参照電極内部（事前に充填された3 M溶液を用いて）のAgCl（銀+）でペレットと金2ミリメートルオスコネクタ（ 図1C）をマウントし、手動マイクロポジショナーに電極とホルダーを取り付けます磁気スタンドに取り付けられました。 </li></ol></li></ol> 2.イオン選択自己参照微小電極のキャリブレーション<ol><li>参照溶液のように、目的のイオンを含むキャリブレーション溶液を調製します。 表1を参照してください</strオング&gt;。ブラケット溶液中での濃度は、試料（ 例えば 、培地、生理食塩水）です。つまり、1つの較正溶液は、測定溶液中のイオンのより低い濃度を含有し、そして高い方なければならないれます。 <ol><li>例えば、K + 1mMのが含まれている生理食塩水を使用しています。この濃度をブラケットに、連続希釈で10、1および0.1mMの濃度になるように脱イオン水中でのKCl粉末を溶解します。これらのキャリブレーションソリューションを使用しています。また、これらの解決策のうちの少なくとも2つを使用します。 </li></ol></li><li>それぞれの較正溶液中のイオン選択性微小電極および参照電極を浸し、電圧値が（ 表1参照）は、専用のソフトウェアを使用して対応する電圧を記録する前に、1〜3分間安定化させ。 </li><li>ソフトウェアとしてtxtファイルとしてデータ（アンプ出力）を保存し、スプレッドシートファイルにデータをコピーします。の対数に対して微小出力（MV）をプロット分子イオン濃度（ 図2A）。 </li><li>線形回帰を適用し、ネルンストの傾き、切片およびR 2の値を計算します。ネルンスト傾斜は、二価イオンの価イオンおよび29±11 mVの/十年のための58±11 mVの/ディケード（アニオンのためにそれが否定された陽イオンのために、ネルンスト傾斜は、正である）である場合に微小電極を受け入れます。さらに、良好な微小電極は強い線形相関（; 図2B R 2&gt; 0.9）を持っている必要があります。 注：ここで使用される増幅器のMV出力はMVが10倍のゲインで読書ができます。値は、10のファクタで分割する必要があります。 </li><li>実際のイオン濃度（ 図2B）に微小電極の生のMV出力を変換するために、線形回帰式を使用してください。 </li></ol>イオン選択微小電極法の3検証<ol><li>人工光源の準備<ol><li>人工光源の毛細血管は同じ毛細血管です上記。熱は、ステップ1.1.1のように微小電極プラーを使用してキャピラリを引き出します。 </li><li>塩化ナトリウム、塩化カリウムの1 M溶液200μl、CaCl 2を 2 H 2 OまたはpH 4緩衝液を用いて、これらのキャピラリーを埋め戻します。選択イオンに応じて人工光源溶液（ 表1参照）を測定します。 注：別の方法として、大きな先端径（〜20ミクロン）で電極を引き出し、同じソリューションを、先端充填が、百分の0.5から1アガロースを含む（アガロース溶液のいずれかの大きな流れを防ぐことができます）。 </li><li>マイクロマニピュレータに人工光源キャピラリをマウントし、試料中のイオンの流れを測定するために使用される溶液中に浸します。勾配の安定化を可能にするために、1時間に30分間、溶液中の人工光源のままにしておきます。 </li></ol></li><li>イオン選択性微小電極の検証<ol><li> measuするために使用される溶液中の人工光源のキャピラリーから約1センチメートル離れたイオン選択性微小電極を浸しサンプルのイオンのフラックス再と以前のように参照電極と回路を閉じます。電圧値が1〜2分間の専用ソフトウェアを使用して対応する電圧を記録する前に1~3分間安定させ。この値は、バッファ値に対応する（文献でも参照、背景やブランク値と呼びます）。 </li><li>人工光源から約5μmにイオン選択性微小電極を移動して、電圧値が1〜2分間のソフトウェアを使用して対応する電圧を記録する前に1〜3分間安定化させます。 </li><li>人工光源の毛細管から離れて10、20、40、80、160、320、640と1280ミクロンでイオン選択微小電極を配置することにより、上記の手順を繰り返します。 </li><li> txtファイルなどのデータを抽出し、スプレッドシートファイルに値をコピーします。 </li></ol></li><li>校正値と同じ方法でmVの値に対応するイオン濃度を計算します。値をプロットします。 いいえTE：イオンフラックスが存在する場合、微小電極は、二つの位置（図3B）との間のイオン濃度の差を検出します。人工光源は、溶液よりも測定した種の多くのイオンが含まれている場合は、濃度が正しく、この場合には（イオン束の方向を検出するために、イオン選択微小電極の能力を検証し、遠くよりもソースに高い近くなければなりません流出;人工シンクのために、培地を測定するよりも低い特定のイオン濃度と、それが流入する必要があります）。 <ol><li> cは 、溶液中のイオン濃度（モルcm -3程度）であり、μはイオン移動度である（モルセンチN -1秒-1）J = Cμ（DC / DX）：拡散のフィックの法則を用いてイオンフラックスを計算します、およびDC距離dx（CM）（ 図2C）上の濃度差です。イオンフラックスデータは、通常、 ピコモルcm -2でSに提示されています-1またはナノモルcm -2で秒-1。 注：Smithら26によって記載されたイオンフラックス計算する別の方法を用いることができます。主な違いは、代わりに、イオン移動度の拡散係数を使用し、サンプルなしで生理食塩水溶液中のイオン流束の測定値から算出し、バックグラウンドイオンフラックス（また、電圧ドリフト又は補正係数）の減算を含みます。 </li><li>ソース（ 図2D）からの距離に対する各ステップのイオンフラックスの平均値をプロットします。源から離れた場所に移動すると、イオンフラックスの異なる大きさを検知するイオン選択性微小電極の能力を検証するフラックス値の指数関数的減少を観察します。 </li><li>大きな信号対nでの正しい方向と大きさの測定値を検証するために記録されることを意図し、各特定のイオンに対して一度人工光源の検証を行いオワーズ比。 注：サンプルを含まない緩衝液のイオンフラックス測定は、バックグラウンドレベルやノイズを示しています。典型的には、バッファは、測定変数の方向が表示され、非常に小さな束につながるイオン濃度の明確な変動を示さありません。 </li></ol></li></ol>商工会議所の測定4.準備注：実験の前に、サンプルを測定することが考慮し、サンプルがどのように実装され、微小電極の測定のために固定化します。 <ol><li> アフリカツメガエル卵母細胞のための測定は800ミクロンのナイロンメッシュ（nitexメッシュ）の1cm角にカットし、プラスチックシャーレ（ 図1E）にそれを接着ツメガエル 。 </li></ol> 5.イオンフラックス測定<ol><li>較正溶液の場合と同様に試料の測定を行うために使用される緩衝液中に存在するイオン濃度を測定する。X.ツメガエルの卵母細胞は、マークの改変リンガー（MMR）が必要です。 D（MM）の最終濃度に達するまでの脱イオン水にissolveのNaCl、KClを、塩化カルシウム、塩化マグネシウムおよびHEPES：100のNaCl、2のKCl、2塩化カルシウム、塩化マグネシウム1及び5 HEPES。 NaOHを用いて7.5に緩衝液のpHを調整します。 </li><li>測定チャンバー内に試料を置き、微小電極（ 図3A）の近くに位置を定義するためにマイクロポジショナーを使用して（約10μm離れた）サンプルに近いイオン選択微小電極をもたらします。 </li><li>近くに位置し、専用ソフトウェアを使用して離れたサンプル（遠い）からの位置の間の微小電極の低周波数（0.3ヘルツ）エクスカーション（100μm）を起動します。微小電極の移動は、試料の表面に垂直であることを確認してください。 注：微小電極の遠足は、ソフトウェア上で設定することができます。大きな遠足は勾配がサンプリング間隔を長くし、時間分解能が低下している間、測定中の小束を容易に検出することができ読み取る増加します。見ます<st栄&gt;例えば図3A。 </li><li>ソフトウェアを使用して録画を開始します。微小電極は、それぞれの位置で一時停止し、mV単位電位がコンピューターに記録されています。信号の安定化を可能にする、少なくとも2分間の測定値を取得します。短い時間経過実験では、全体の時間のコースに興味のある位置での電位の変化を記録します。 </li><li> txtファイルなどのデータを抽出し、スプレッドシートファイルに値をコピーします。 </li><li>校正値と同じ方法でmVの値に対応するイオン濃度を計算します。値をプロットします。 注意：イオンフラックスが存在する場合、微小電極は、二つの位置（ 図3B）との間のイオン濃度の差を検出します。 </li><li> （ステップ3.3.1）以前のように、拡散のフィックの法則を用いたイオンフラックスを計算します。 </li><li>新しいサンプルを測定する前に、バッファの測定を繰り返し、すべての新しいのためのフラックス測定と計算の手順を繰り返しますサンプル。 </li></ol> 6.統計分析とデータ表示<ol><li>および/ ​​または混合効果28とANCOVAモデルを用いた制御条件でイオンフラックスの時間の位置の独立した効果をテストします。 注：共分散分析（ANCOVA）をカテゴリと連続の両方の対策が独立変数として使用することができるようにすることで、定期的なANOVAと回帰をミックス一般線形モデルです。また、個々のおよび最終的なネストされた効果につき反復測定によって誘発される相関誤差の存在下で、混合効果モデルは、両方の固定およびランダム効果の正確な推定値をモデル化するために使用されます。 </li><li>複数のテスト28ボンフェローニ補正を持つグループレベル間のスチューデントt検定を使用して対比較を計算します。 </li><li>位置や時間に応じてイオンフラックス測定を要約する箱ひげ図を生成します。記載ペアワイズスチューデントの tからp値を含みます（ 図3D）は、上記と以下のようにp値の有意水準を示す：*：P &lt;0.05; **：P &lt;0.01; ***：P &lt;0.001 29 </li></ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

in vivoでの細胞外イオンフラックスの測定に成功するために最も重要な手順は次のとおりです。ノイズの低減、イオン選択微小電極と参照電極の正確な製造、およびサンプルと両電極の配置。 ノイズを最小にするために、記録システムは、好ましくは、接地された金属張り（防振）テーブルでアース（接地）ファラデーケージにする必要があります。また、顕微鏡シャーシも接地する必要があります。電気ノイズの発生源は、光源を含みます。光ファイバ「ファンレス」光源は、最小限の電気的ノイズの原因となります。最後に、所有者はまた、塩素化微小電極に銀線、ペレットを維持すること（次亜塩素酸ナトリウム漂白剤に浸漬してのdH 2 Oですすぎ）ノイズを最小限に抑え、イオン選択微小電極や測定になります参照電極中の気泡の選択図存在として失敗微小電極の導電率はゼロか、改ざんされます。これにより、所有者にそれらをマウントする前に顕微鏡下で電極を検証することが重要です。気泡を除去するための詳細な手順のためのプロトコルを参照してください。サンプルおよび微小電極の両方の正確な位置決めが確実かつ再現可...

<html>全ての動物細胞は、外部環境から細胞質を分離する脂質二重膜で囲まれています。セルは、イオン1の能動輸送により、内部の電気膜電位、負を維持します。膜電位は、細胞は、膜2に、様々な分子デバイスを動作させるために利用することができる保存されたエネルギー源です。ニューロンおよび他の興奮性細胞は、大きな膜電位を有します。ナトリウムチャネルの迅速な開口部は膜電位（脱分極）の崩壊と神経2の長さ方向に沿って搬送される活動電位を生成します。別にこれらの急速な電気的変化から、多くの組織や器官が発生し、重大な長期的な電位を維持します。例えば、皮膚、角膜上皮が発生し、イオンの方向励起（主にナトリウムと塩化物）3によって経上皮電位および細胞外の電流を維持します。 10トン&quot;&gt;内因性細胞外電流の測定は微小電極システム7-10は、細胞膜および上皮細胞層の電気的パラメータの測定を可能に用いて振動プローブ4-6および膜または経上皮電位の測定値を使用している間、彼らはない与えます関与するイオン種の指標。 選択的イオノフォアと微小電極は、溶液中の特定のイオン濃度を測定することができます。イオン勾配またはフラックスは異なる位置に2つ以上の電極を用いて測定することができます。しかし、各プローブの固有の電圧ドリフトは、不正確な測定または存在しなかった勾配であっ​​ても検出を引き起こし、異なるであろう。それは2点間の低周波数で移動することにより、「自己参照」モードで使用される単一の電極は、この問題を解決します。ここで、イオンフラックスは、（ 図3B参照 ）は、比較的ゆっくりと安定した信号ドリフトの背景を見ることができます。 </P&gt; イオン感受性測定システムは、組織または単一細胞に近いイオンの小さな細胞外フラックスを検出するために、イオン選択自己参照微小電極を使用しています。システムは、微小電極からの信号を処理し、マイクロステッピングモータとドライバは、微小電極の動きを制御するための増幅器で構成されています。回路を閉じるイオン選択微小電極および参照電極をヘッドステージ前置増幅器（ 図1A）を介して増幅器に接続されています。コンピュータソフトウェアは、微小運動（周波数、距離）のパラメータを決定し、また、増幅器の出力を記録します。ステッピングモータは、三次元マイクロポジショナーを介して微小電極の移動を制御します。イオン選択性微小電極を振動、低周波は、まず、特定のカルシウム流11を測定するために1990年に開発されました。同様に、カルシウムなど、商業的にアクセス可能なイオノフォアカクテルは今MICRを作るために利用可能ですナトリウム、塩化物、カリウム、水素、マグネシウム、硝酸、アンモニウム、フッ化リチウム、水銀に敏感oelectrodes。 基本的には、自己参照イオン選択微小電極技術は、電圧計で測定することができる電位に溶液中に溶解し、特定のイオンの活性を変換します。イオノフォアカクテルは、イオン交換特性を有する非混和性液体（有機親油性）相です。イオノフォアは、選択的可逆的に（結合する）特定のイオンと錯体を形成し、微小電極（電解液）に含まれる水溶液と微小電極が浸漬させた水溶液（ 図1D）との間でそれらを転送します。このイオンの移動は、電気化学的平衡をもたらし、微小電極と参照電極との間の電位の変動を電圧計により測定されます。電圧は、ネルンストeによる特定のイオン活性の対数に比例していますイオン濃度（ 図2AおよびB）の計算を可能にするquation。 現在、いくつかのシステムでは、同様の概念や原理を用いてイオン流の測定を可能にします。例えば、走査型イオン選択電極法（SIET）12,13またはニューマンとShabala 14-16によって開発された微小電極のイオンフラックスの推定（MIFE）技術は市販されており、広く特定のイオンを決定するために、研究コミュニティによって使用されます動物、植物および単一生細胞モデルの多様にわたって細胞膜および組織で生じる磁束。マウスの骨におけるイオン選択性微小植物の根17を横切って、水素、カリウムおよびカルシウムフラックスを測定するために使用されている、塩化フラックスラット大脳動脈18と花粉管19、水素流量スケート網膜細胞20、カルシウムフラックス21、様々なイオン菌糸22であり、rでフラックス単一細胞の創傷中に角膜23、および最終的にカルシウム流で12,24治癒 。また、イオン選択自己参照微小電極25の詳細については、以下のレビューを参照してください。 次の記事では、準備し、単一細胞レベルでのイオン選択自己参照微小電極技術を用いて、内因性の細胞外イオンフラックスの測定を実行する方法を詳細に説明しています。

<table><tbody><tr><td>イオナップ&nbsp;</td><td>&nbsp;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td><td>なし</td><td>BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA によって作成されたアンプ。同様のシステムは「XBL 関数が重要"(http://www.xuyue.org/)または「YoungerUSA」(http://www.youngerusa.com/)または該当する電子機器(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>IonAmp32&nbsp;</td><td>&nbsp;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td><td>なし</td><td>BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA によって作成されたソフトウェア。同様のシステムは「XBL 関数が重要"(http://www.xuyue.org/)または「YoungerUSA」(http://www.youngerusa.com/)またはApplicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>ヘッドステージプリアンプ</td><td>&nbsp;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td><td>INA116</td><td>BSR Voltage Follower INA116, designed by the BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA;同様のシステムは「XBL 関数が重要"(http://www.xuyue.org/)または「YoungerUSA」(http://www.youngerusa.com/)またはApplicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>MicroStep Driver</td><td>&nbsp;BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA</td><td>なし</td><td>X、Y、Z ポジショニングには 3 つの MicroStep ドライバーが必要です。BioCurrents Research Center, Woods Hole, MA, USA; によって作成されました。同様のシステムは「XBL 関数が重要"(http://www.xuyue.org/)または「YoungerUSA」(http://www.youngerusa.com/)またはApplicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>手動マイクロポジショナー&nbsp;&nbsp;</td><td>世界の精密機器&nbsp;</td><td>モデルKITE-R</td><td>同様のシステムは、Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>Magnetic stand&nbspから購入できます。&nbsp;&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>Model M10</td><td>同様のシステムは、Applicable Electronics(http://www.applicableelectronics.com/)</td></tr><tr><td>防振テーブルから購入できます&nbsp;&nbsp;</td><td>ニューポート社&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>モデルVW-3036-OPT-023040</td><td>同様のシステムは、適用可能な電子機器(http://www.applicableelectronics.com/)から購入することができます</td></tr><tr><td>3次元マイクロポジショナーの一部:アングルブラケット、90°、スロット付き面</td><td>ニューポート社&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>モデル360-90</td><td>3次元マイクロポジショナーの集合体には、X、Y、Z制御用の3つの電動ロータリーモーター、MCA-2調整可能な角度ポストと振動テーブルにボルトで固定するさまざまなニューポートコネクタとネジを備えたMPH-1取り付けアームも必要です</td></tr>3<tr><td>次元マイクロポジショナーの一部:ペグ結合ダブテールステージ0.5インチ Xトラベル</td><td>ニューポート株式会社&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>460PD-X</td><td>なし</td></tr><tr><td>3次元マイクロポジショナーの一部: クイックマウントリニアステージ、0.5インチ XY Travel</td><td>Newport Inc.</td><td>460A-XY</td><td>なし</td></tr><tr><td>Kwik-Fil薄肉ホウケイ酸ガラスキャピラリー(フィラメントなし)&nbsp;</td><td>世界の精密機器&nbsp;</td><td>TW150-4</td><td></td></tr><tr><td>無電極プーラー&nbsp;</td><td>成茂</td><td>&nbsp;PC-10</td><td>なし</td></tr><tr><td>金属製ラック</td><td></td><td>なし</td> 金属<td>製電極ホルダー 10cm x 15cmの長方形のスチール製ベースに半センチ間隔の穴をあけて、2mm幅の穴を開けて社内製</td></tr><tr><td>オーブン</td><td>QL</td><td>Model 10 ラボオーブン</td><td>なし</td></tr><tr><td>シラン化ソリューション I&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85126</td><td>危険、プロバイダーが推奨するハンドル&nbsp;</td></tr><tr><td>ガラスペトリ皿;パイレックス</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>316060</td><td>なし</td></tr><tr><td>電極/マイクロピペット 保存ジャー</td><td>ワールド プレシジョン インスツルメンツ&nbsp;</td><td>E215</td><td>なし</td></tr><tr><td>ガラス乾燥器</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-595E</td><td>ドライエライト乾燥剤が含まれています(WA Hammond Drierite Co. Ltd、Xenia、OH、USA)。シールにワセリンを敷いて気密にします。</td></tr><tr><td>プラスチックパスツールピペット&nbsp;</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>11597722</td><td>なし</td></tr><tr><td>ブンゼンバーナー</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>S97329</td><td>なし</td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>S8902</td><td>なし</td></tr><tr><td>ストレートマイクロ電極ホルダー</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>QSW-A15P</td><td>ゴールド1mmオスコネクターとAg/AgClワイヤー付き</td></tr><tr><td>ストレートマイクロ電極ホルダー&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH3S</td><td>内部にAgCl(Ag+)ペレット、金2mmオスコネクタ付き&nbsp;</td></tr><tr><td>6 cmシャーレ</td><td>VWR</td><td>60872-306</td><td>なし</td></tr><tr><td>Nitex mesh</td><td>Dynamic Aqua-Supply Ltd.</td><td>NTX750</td><td>なし</td></tr><tr><td>接着剤;ロックタイトエポキシ</td><td>VWR</td><td>500043-451</td>プラスチック<td>計量ボートで接着剤と硬化剤を均等に混合し、完全に混合します。すぐにセットしますが、完全に硬化する</td></tr><tr><td>脱イオン水&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>99053</td><td>なし</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>なし</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td>なし</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td>なし</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>なし</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>なし</td></tr><tr><td>ヒドロキシドナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>なし</td></tr><tr><td>酢酸カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1190</td><td>なし</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Σ-Aldrich</td><td>A9539</td><td>なし</td></tr></tbody></table>

イオン選択自己参照微小電極法を用いた細胞外イオンフラックスの測定

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

動物、植物、単一細胞からの細胞は、外部から細胞質を分離し、細胞膜と呼ばれるバリアによって囲まれています。例えば、上皮細胞層としても外​​側または多細胞生物の異なる区画の内部を分離するバリアを形成します。これらの障害の重要な特徴は、細胞膜または細胞膜を横切るイオンの微分分布です。二つの特性は、この配布を許可する：1）膜および上皮は、特定のイオンを選択的に透過性を表示します。 2）イオンは、細胞膜および細胞膜を横切るポンプを介して輸送されます。これらの特性は、組織の生理機能の維持に重要な役割を果たし、修理の際に、損傷後の手がかりを信号として機能し、または病理学的条件の下で。イオン選択自己参照微小電極は、単一の細胞および組織レベルでのカルシウム、カリウムやナトリウムなどのイオンの特定のフラックスの測定を可能にします。微小電極は、イオノフォアのカクテルが含まれています特定のイオンを選択的に透過。内部充填溶液は、目的のイオンの設定濃度が含まれています。微小電極の電位はイオンの外濃度によって決定されます。イオン濃度が変化するように、微小電極の電位がイオン活性の対数の関数として変化します。 （これはイオン束に濃度勾配で、すなわち ）イオンのソースまたはシンクの近くに前後に移動すると微小電極電位はイオンフラックス/勾配に比例した振幅で変動します。増幅器は、微小信号を増幅し、出力は、コンピュータに記録されます。イオン束は、その後、特定のイオン移動度として、電極電位変動、微小電極の偏位、および他のパラメータを使用して拡散フィックの法則によって計算することができます。本稿では、イオン選択自己参照微小電極のANを用いて細胞外のイオンフラックスを測定するための方法論を詳細に説明しますいくつかの代表的な結果を提示するdは。

我々は以前、カルシウム流入は、単一のセルが24を負傷した後に表示されることが示されています。したがって、我々は、他のイオン束は、単一の細胞損傷の際に発生するかどうか尋ねました。我々は、Xを使用しました卵母細胞をアフリカツメガエル 、単一のセルのための十分に確立されたモデルは30〜34と電気生理学的記録24,35-39創傷治癒します 。興味深いことに、カリウムイオンは、Xの内部に、より集中しています創傷時のカリウムの流出を示唆している：（1 mMのMMR 1Xに）使用される細胞外溶液中よりも卵母細胞（約110 mM）の40を アフリカツメガエル 。この仮説を確認するために、我々は、Xの過程でカリウムフラックスを測定しましたイオン選択自己参照微小電極を用いた卵母細胞の細胞膜の治癒をアフリカツメガエル 。 卵母細胞を創傷に、最初の大きな先端サイズ（〜50μm）を有するキャピ...

細胞膜のトランスポーターは、細胞膜または細胞層間でイオンを異なる分離することを可能にし、組織の生理学、修復、病理学において重要な役割を果たします。ここでは、in vivoで単一細胞および組織における特定のイオンフラックスの測定を可能にするイオン選択的自己参照型微小電極について説明します。

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

この手順の全体的な目的は、イオン選択性自己参照型マイクロ電極法を用いて、生体内で細胞外イオンフラックスを測定することです。これは、まずイオン選択性マイクロ電極と参照用マイクロ電極を組み立てることで達成されます。第二のステップでは、イオン選択性自己参照型マイクロ電極の校正とバリデーションを行います。次に、生物学的試料においてイオン特異的フラックスの測定を電圧記録の形式で行います。最後に、この電圧記録をイオンフラックスに変換します。最終的に、この手法を用いることで、生細胞または組織における特定の細胞外イオンフラックスの正確かつ非侵襲的な測定が可能になります。これらの手法は、再生や病理だけでなく、生理学や老化における重要な疑問の解明に役立ちます。例えば、本手法を用いることで、組織の形態形成、成長、分化などの生物学的プロセスを制御する特定のイオンフラックスの特定が可能になります。この手順の実演は、ポストドクターのGim Ardi博士とBenjas博士の研究室が行います。電極の校正を行う前に、1 mmの金製オスコネクタと塩化銀被覆銀線を備えたマイクロ電極ホルダーに、充填済みのイオン選択電極を装着してください。次に、マイクロ電極ホルダーを3軸コンピュータ制御電子マイクロポジショナーに取り付けます。イオン選択性電極には、あらかじめ電解質および目的のイオンに対応するイオンフォーカクテル溶液が充填されている必要があります。装着後、電極を1 mMの塩化カリウム溶液に浸します。さらに、3 Mの塩溶液を含むアガー、塩化銀でコーティングされた銀ペレット、および参照電極用の2 mm金製オスコネクタを備えた直線型マイクロ電極ホルダーに、参照電極を取り付けます。塩溶液の選択は、測定するイオン種によって異なります。参照電極を準備した後、磁気スタンドに予め取り付けられた手動マイクロポジショナーに電極ホルダーを装着します。電極を固定した後、1 mMの塩化カリウムを含む溶液に浸します。開始前に、イオン選択性電極のセットアップを用いて、目的のイオンを含む電解質校正標準液の希釈系列を調製しておきます。例えば、生理学的濃度である約1 mMのカリウム陽イオンを検出する場合、10 mM、1 mM、0.1 mMの3つの対数系列の塩化カリウム溶液を作成します。これにより、アッセイに必要な検出のダイナミックレンジが最大化されます。イオン選択性電極を校正するには、まずイオン選択性電極と参照電極の両方を、最も低濃度の校正液（本ケースでは0.1 millimolar）に浸します。室温で1〜3分間の短い安定化時間を置いた後、定常状態の電圧を測定し、記録します。残りの校正標準液についても電圧測定を繰り返し、測定された電圧をイオンモル濃度の対数に対してプロットします。各標準溶液について線形回帰を行い、校正曲線のネルンスト傾斜、切片、および決定係数を算出します。ネルンスト傾斜を計算する際は、測定電圧を電圧増幅器の全ゲインで割ることを忘れないでください。測定プロトコルを実証するため、穿孔したアフリカツメガエル卵母細胞からのカリウムイオンの流出を、カリウム感受性マイクロ電極を用いて評価します。イオン選択性電極のセットアップを開始する前に、800 µmのナイロンメッシュから1 cmのパッチを切り出し、プラスチック製ペトリ皿に接着させます。また、100 mM NaCl、2 mM KCl、2 mM CaCl₂、1 mM MgCl₂、および5 mM HEPESを含む、以下の組成のMark改変リンガー液を事前に準備しておきます。水酸化ナトリウムを用いてバッファーのpHを7.5に調整し、調製したバッファーをペトリ皿に分注します。カエルの細胞、イオン選択電極、および参照電極をシャーレに慎重に配置します。次に、細胞に穿孔し、マイクロポジショナーを作動させて、イオン選択電極がサンプルから約10 microns離れた位置にくるようにします。用語の定義として、このサンプルと電極の間の距離を近接位置（close position）と指定します。次に、イオン選択性電極が10 µmの近接位置から100 µmの遠位位置まで周期的に移動し、再び近接位置に戻るようにマイクロポジショナーを作動させます。移動速度は0.3 Hz、つまり10秒間に3往復となるように設定してください。マイクロポジショナーの作動中は、電極の動きが細胞の損傷した接線表面に対して完全に垂直であることを確認し、電圧測定および記録ソフトウェアを起動します。電圧データの収集中、マイクロポジショナーは近接位置と遠位位置で短時間一時停止するようにプログラムされています。卵母細胞の創傷治癒の際は、データを連続的に記録します。このプロセスは約15分かかります。一方、opusオタマジャクシの尾の再生のような数日間にわたるプロセスの観察などの長期的な実験では、異なる時点（例：1、3、6、12、24時間後）で2分間の測定記録を行います。実験終了後、電圧データをテキストファイルとして抽出し、値をスプレッドシートにコピーします。あらかじめ作成した検量線を用いて、測定された電圧値を対応するイオン濃度に変換します。外挿したイオン濃度を、生物学的試料からの距離の関数としてプロットします。最後に、フィックの拡散法則を用いてイオンフラックスを算出します。ここで、Cは溶液中のイオン濃度、MUはイオン移動度、DC DXは距離dxあたりの濃度差を表します。生物学的実験に先立ち、NERの勾配切片の値およびイオン選択性電極の校正曲線全体を、ペトリ皿に配置した1 molarのイオン源から生成した人工イオン勾配を用いて検証することができます。カリウムイオン濃度の変化を、annu site woundに近い距離または遠い距離でプロットした場合についてです。データは、細胞損傷の開始時に大規模なカリウムフラックスイベントが発生することを示唆しており、創傷治癒が進むにつれて、カリウムフラックスは徐々に減衰し、創傷が完全に治癒した15分後には静止レベルに戻ります。さらに、測定されたカリウムイオン濃度をイオンフラックスに変換すると、損傷後のカリウムフラックスの急激な増加と緩やかな減少は、無傷の対照卵母細胞と比較して統計的に有意な効果であると考えられます。この手順に続き、細胞間および細胞内イオンフラックスの特性に関するさらなる疑問を解決するために、蛍光バイオエレクトリシティ標識などの他の手法を実施することが可能です。

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JoVE Journal

Biology

生物学

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で液分泌とイオンフラックス速度を測定するためのラムゼイアッセイの使用<em&gt;キイロショウジョウバエ</em&gt;マルピーギ管

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成虫の蚊における排泄系の神経ペプチドおよび他の調節因子の活性の研究

学ぶイオン選択自己参照微小電極法による細胞外イオンフラックスの非侵襲的測定法。生きた細胞や組織におけるイオン動態を正確に評価し、生理学や病理学研究に応用できます。

イオン選択自己参照微小電極法を用いた細胞外イオンフラックスの測定

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