胆道主導の肝臓の再生を研究するためにゼブラフィッシュにおける肝細胞特異的アブレーション

この手順の全体的な目標は、胆道主導の肝臓再生の分析のために、ゼブラフィッシュの肝細胞アブレーションを誘導することです。これは、肝細胞にニトロレダクターゼを発現するトランスジェニック幼虫を最初にメトロナまたはMTZに曝露することによって達成されます。2 番目のステップでは、肝細胞のアブレーションのレベルが、肝臓の相対的なサイズに基づいて評価されます。

最終ステップでのMTZ治療後、小さな肝臓を持ついじめっ子のアブレーションされた幼虫が最終的に肝臓のサイズで収集され、再生中の肝臓での肝臓マーカーの発現がそれぞれエピ蛍光と共焦点顕微鏡によって測定されます。げっ歯類の楕円形細胞活性化モデルのような既存の方法に対するこの技術の主な利点は、この技術では、再生肝細胞が主に胆道上皮細胞に由来することです。この方法は、胆道または肝臓前駆細胞が肝臓の再生にどのように寄与するかなど、肝臓再生分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

時限交配を行うには、成魚のオスとメスの半接合体またはホモ接合体の魚を一晩中セットアップし、その間に仕切りを設けます。交配が必要な場合は、翌朝、細かいプラスチックメッシュストレーナーを使用して胚を採取し、ストレーナーを逆さまにし、スクイーズボトルを使用してメッシュ表面を卵水の細かい流れですすいでください。次に、25ミリリットルの卵水が入った100mmのシャーレに最大100個の胚を移植し、ディッシュを摂氏28度に置いて色素沈着を抑制します。

PTUを最大10時間培養物に加えます。80時間後の受精後。パーソナライゼーション後、幼虫にトリカを麻酔し、エピ蛍光顕微鏡を使用してCFP陽性の幼虫を採取し、肝臓のサイズが同程度の動物のみを飼育します。

次に、トリカの卵の水をPTUを補充した新鮮な卵の水に交換し、CFP陽性のゼブラフィッシュの幼生を摂氏28度のインキュベーターに戻します。ゼブラフィッシュの幼生をMTZで治療するには、まず適切な数の幼生を2つの異なる培養容器に分けます。実験幼虫群を新たに調製したMTZの溶液に、対照群を卵水に保管します。

DMSOを補充。MTZの光不活性化を防ぐために実験グループをアルミホイルで覆い、アブレーション期間の終わりにゼブラフィッシュの幼生の両方のグループを摂氏28度でインキュベートします。プレートからMTZ溶液を取り出し、MTZ処理された幼虫を25ミリリットルの卵水と渦巻き巻きで2〜3回洗浄し、各洗浄後に卵水を廃棄します。

最後の洗浄後、MTZで治療された幼虫の心臓浮腫と死亡を避けるために以前に使用したトリカの濃度の半分で幼虫を固定します。次に、エピ蛍光顕微鏡でCFPフィルターを使用して、MTZ処理された幼虫の相対的な肝臓サイズに基づいて肝細胞のアブレーションレベルを評価します。幼虫の0〜5%を占める大きな肝臓を持つゼブラフィッシュは、アブレーションされていないと考えてください。

部分的に切除する幼虫の10〜20%を占める中型の肝臓を持つもの、および完全に切除される幼虫の80〜90%を表す非常に小さな肝臓を持つもの。すべての動物を分類した後、肝臓が切除されていないか部分的に切除された幼虫を発見し、肝臓分析のために重度の肝細胞切除を示す小さな肝臓を持つゼブラフィッシュのみを保持します。再生ゼロ時間の時点で、幼虫を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。

MTZウォッシュアウトとCFPソーシングの直後に、卵水を3%ホルムアルデヒドMPEMバッファーと交換して、摂氏4度のローターに一晩固定します。翌朝、固定液を1ミリリットルのP-B-S-D-Tと交換し、幼虫をさらに5分間回転させます。次に、すべての固定された幼虫を、新鮮なP-B-S-D-Tが入った100ミリメートルのシャーレに解剖顕微鏡で入れ、すべての幼虫が切り取られたら、鉗子を使用して卵黄と胸鰭を手動で除去します。

最大20匹の動物を1.5ミリリットルのチューブに移し、P-B-S-D-Tを1ミリリットルのブロッキング溶液と交換します。ローテーターを室温で2時間放置した後、ブロッキング溶液を100マイクロリットルの一次抗体カクテルと交換し、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日ロッキングしながら、一次抗体溶液を取り出し、ゼブラフィッシュをP-B-S-D-Tで10分間5回洗浄します。

最後の洗浄後、100マイクロリットルの二次抗体を室温で2時間インキュベートし、ロッキングします。最後に、先ほど示したように、幼虫をP-B-S-D-Tで5回洗います。顕微鏡スライド上で幼虫を横向きにし、封入剤を一滴加えます。

次に、各ゼブラフィッシュをカバーガラスで慎重に覆い、カバーガラスをマニキュアで密封します。受精後3.5日から5日までの36時間MTZ治療により、肝臓のサイズが劇的に縮小します。MTZウォッシュアウト後、胆道上皮細胞の膜におけるLCAMの発現によって評価されるように、強力なCFPと赤色の発現が30時間以内に再出現します。

肝内胆道ネットワークは最初は崩壊しますが、ウォッシュアウト後54時間で再確立され、急速な肝臓の再生と回復を示します。これらの画像では、肝臓の胆道上皮細胞でのみ発現する核赤色蛍光タンパク質のトランスジェニック肝細胞の再生肝細胞は、再生肝臓におけるこれらのH、2、BMチェリー陽性細胞のほとんどが、再生時間4、C、8で再生時間ゼロでHNF4アルファを発現することが示されています。MTZで処理されたCFP陽性肝細胞は、依然としてH 2 BMチェリーの発現を保持しており、重度の肝細胞喪失時に胆道上皮細胞が肝細胞に変換されることを示しています。

この手順を試行している間は、MTT治療後に完全に切除されたものを選択することを覚えておくことが重要です。この技術は、肝臓再生の分野の研究者が、細胞主導の肝臓再生である肝臓前駆細胞の根底にあるメカニズムを探求する道を開きました。このビデオを見れば、この地理細胞特異的操作モデルをビリオ駆動型肝変性研究に使用する方法について十分に理解できるはずです。