Name: テストのためのひよこ心臓浸潤アッセイ癌細胞の浸潤性および潜在的に抗浸潤化合物の活性 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 学ぶ ひよこ心臓浸潤アッセイ法を用いて、3次元の生組織におけるがん細胞の浸潤性を評価し、抗浸潤性化合物のスクリーニングを行う方法。この技術は新規がん治療薬の開発に貢献します。

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ビデオフィルムでアッセイ技術を実演してくださったMarleen De Meulemeesterに感謝します。B. I. R. は、フランダース研究財団 (FWO – Vlaanderen) の博士研究員です。L.M.M. は、Flemish League against Cancer (Vlaamse Liga tegen Kanker) から Emmanuel van der Schueren 助成金を受けています。

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<li>Mareel, M., Kint, J., Meyvisch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+study+of+the+invasion+of+malignant+C3H+mouse+fibroblasts+into+embryonic+chick+heart+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Virchows+Arch.+B.+Cell+Pathol.+Incl.+Mol.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Methods of study of the invasion of malignant C3H mouse fibroblasts into embryonic chick heart in vitro.</a> Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 30 (1), 95-111 (1979).</li>
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<li>De Wever, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+and+spheroid+collagen+type+I+invasion+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single cell and spheroid collagen type I invasion assay.</a> Methods Mol. Biol. 1070, 12-35 (2014).</li>
<li>Wolff, E., Schneider, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((La+transplantation+prolong%C3%A9e+d%E2%80%99un+sarcome+de+souris+sur+des+organes+embryonnaires+de+poulet+cultiv%C3%A9s+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22C.R.+Seances+Soc.+Biol.+Fil%22%5BJournal%5D)">La transplantation prolongée d’un sarcome de souris sur des organes embryonnaires de poulet cultivés in vitro.</a> C.R. Seances Soc. Biol. Fil. 151 (7), 1291-1292 (1957).</li>
<li>Easty, G. C., Easty, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organ+culture+system+for+the+examination+of+tumor+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An organ culture system for the examination of tumor invasion.</a> Nature. 199, 1104-1105 (1963).</li>
<li>Schleich, A. B., Frick, M., Mayer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+invasive+growth+in+vitro.+Human+decidua+graviditatis+confronted+with+established+human+cell+lines+and+primary+human+explants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Patterns of invasive growth in vitro. Human decidua graviditatis confronted with established human cell lines and primary human explants.</a> J. Natl. Cancer Inst. 56 (2), 221-237 (1976).</li>
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<li>Bracke, M. E., Van Larebeke, N. A., Vyncke, B. M., Mareel, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+modulates+both+invasion+and+plasma+membrane+ruffling+of+MCF-7+human+mammary+carcinoma+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid modulates both invasion and plasma membrane ruffling of MCF-7 human mammary carcinoma cells in vitro.</a> Br. J. Cancer. 63 (6), 867-872 (1991).</li>
<li>Vermeulen, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+from+the+noninvasive+to+the+invasive+phenotype+and+loss+of+alpha-catenin+in+human+colon+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Transition from the noninvasive to the invasive phenotype and loss of alpha-catenin in human colon cancer cells.</a> Cancer Res. 55 (20), 4722-4728 (1995).</li>
<li>Parmar, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-invasive+activity+of+3%2C7-dimethoxyflavone+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharma.+Sci%22%5BJournal%5D)">Anti-invasive activity of 3,7-dimethoxyflavone in vitro.</a> J. Pharma. Sci. 83 (9), 1217-1221 (1994).</li>
<li>Parmar, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-invasive+activity+of+alkaloids+and+polyphenolics+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Anti-invasive activity of alkaloids and polyphenolics in vitro.</a> Bioorg. Med. Chem. 5 (8), 1609-1619 (1997).</li>
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<li>Romeis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Das+mikrotom%5BTitle%5D)+AND+%22Mikroskopische+Technik.+15+Verb.+Aufl.+Kapitel%22%5BJournal%5D)">Das mikrotom.</a> Mikroskopische Technik. 15 Verb. Aufl. Kapitel. 7, München: Leibniz. 114-120 (1948).</li>
<li>Van Marck, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P-cadherin+promotes+cell-cell+adhesion+and+counteracts+invasion+in+human+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">P-cadherin promotes cell-cell adhesion and counteracts invasion in human melanoma.</a> Cancer Res. 65 (19), 8774-8783 (2005).</li>
<li>Attia, M. A., Weiss, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunology+of+spontaneous+mammary+carcinomas+in+mice.+V.+Acquired+tumor+resistance+and+enhancement+in+strain+A+mice+infected+with+mammary+tumor+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Immunology of spontaneous mammary carcinomas in mice. V. Acquired tumor resistance and enhancement in strain A mice infected with mammary tumor virus.</a> Cancer Res. 26 (8), 1787-1800 (1966).</li>
<li>Katritzky, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QSAR+modeling+of+anti-invasive+activity+of+organic+compounds+using+structural+descriptors%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">QSAR modeling of anti-invasive activity of organic compounds using structural descriptors.</a> Bioorg. Med. Chem. 14 (20), 6933-6939 (2006).</li>
<li>McKinnell, R. G., Bruyneel, E. A., Mareel, M. M., Seppanen, E. D., Mekala, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+in+vitro+by+explants+of+Lucke+renal+carcinoma+cocultered+with+normal+tissue+is+temperature+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Invasion in vitro by explants of Lucke renal carcinoma cocultered with normal tissue is temperature dependent.</a> Clin. Exp. Metastasis. 4 (4), 237-243 (1986).</li>
<li>Wanson, J. C., de Ridder, L., Mosselmans, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+hyperplastic+nodule+cells+from+diethylnitrosamine+treated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Invasion of hyperplastic nodule cells from diethylnitrosamine treated cells.</a> Cancer Res. 41 (12 Pt 1), 5162-5175 (1981).</li>
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<li>Laerum, O. D., Steinsvag, S., Bjerkvig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+culture+of+the+central+nervous+system%3A+recent+developments+and+current+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurol.+Scand%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue culture of the central nervous system: recent developments and current applications.</a> Acta Neurol. Scand. 72 (6), 529-549 (1985).</li>
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<li>Bjerkvig, R., Laerum, O. D., Mella, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+cell+interactions+with+fetal+rat+brain+aggregates+in+vitro+and+with+brain+tissue+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Glioma cell interactions with fetal rat brain aggregates in vitro and with brain tissue in vivo.</a> Cancer Res. 46 (8), 4071-4079 (1986).</li>
<li>Bracke, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confrontation+of+an+invasive+%28MO4%29+and+a+non-invasive+%28MDCK%29+cell+line+with+embryonic+chick+heart+fragments+in+serum-free+culture+media%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Confrontation of an invasive (MO4) and a non-invasive (MDCK) cell line with embryonic chick heart fragments in serum-free culture media.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. 22 (9), 508-514 (1986).</li>
<li>Mareel, M. M., Bracke, M. E., Storme, G. A. Mechanisms of tumor spread: a brief overview. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMareel%2C+MM+%22Cancer+Campaign.+9%3A+The+Cancer+Patient%22">Cancer Campaign. 9: The Cancer Patient</a>. Grundmann, E. , Gustav Fisher Verlag. Stuttgart and New York. 59-64 (1985).</li>
<li>De Neve, W. J., Storme, G. A., De Bruyne, G. K., Mareel, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image+analysis+system+for+the+quantification+of+invasion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Exp.+Metast%22%5BJournal%5D)">An image analysis system for the quantification of invasion in vitro.</a> Clin. Exp. Metast. 3 (2), 87-101 (1985).</li>
<li>Smolle, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evaluation+of+melanoma+cell+invasion+in+three-dimensional+confrontation+cultures+in+vitro+using+automated+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Quantitative evaluation of melanoma cell invasion in three-dimensional confrontation cultures in vitro using automated image analysis.</a> J. Invest. Dermatol. 94 (1), 114-119 (1990).</li>
<li>Bracke, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((flavonoid+effect+on+tumor+invasion+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Technol%22%5BJournal%5D)">flavonoid effect on tumor invasion and metastasis.</a> Food Technol. 48 (11), 121-124 (1994).</li>
<li>Bracke, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+tangeretin+on+tamoxifen%E2%80%99s+therapeutic+benefit+in+mammary+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">The influence of tangeretin on tamoxifen’s therapeutic benefit in mammary cancer.</a> J. Natl. Cancer Inst. 91 (4), 354-359 (1999).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

たPHFの準備中に、断片は懸濁液中に滞在しないかもしれないが、血管壁に付着します。これは、培養培地の体積を増加させることによって克服することができます。たPHFの数が少なすぎるとそのサイズが大きすぎる場合には、培地の容積を減少させます。集約する試験細胞の障害は、温度または微生物感染に対する変動に起因する可能性があります。あるいは、集約することができないことは、細胞の本質的な特性であってもよいです。 PHFへの凝集体の取り付けの際、接着不良は、半固体寒天培地の上またはろ紙の吸収により培養物の周りに複数の液体培地を除去することにより、インキュベーション時間を延長することによって克服することができます。この場合の微生物汚染についても確認してください。切片中の困難がパラフィンブロックの崩壊に起因する可能性があります。ブロックの保存期間が（再びパラフィンを融解）が長すぎるされている場合に発生します。アートをセクショニングするとifactsは、ミクロトームナイフの整合性を発生し、固定された培養物中のコーパスのエリーナの不在をチェックする必要があります。培養物中の壊死領域が悪く、培養条件の兆候です。これらの領域は、文化の<stron...

侵略は、悪性腫瘍の特徴です。この活動は、周囲の組織の破壊につながるだけでなく、転移形成に関与しているだけでなく。癌患者は、浸潤および転移によって死亡し、効率的な抗侵襲治療はまだ不足しているので、腫瘍細胞の浸潤を模倣する実験用アッセイが開発されています。ニワトリ心臓アッセイの目的は、三次元で腫瘍浸潤を研究するための関連する器官培養方法を提供することです。アッセイは、侵襲的および非侵襲的な細胞とを区別し、腫瘍浸潤に対する試験化合物の効果を研究することを可能にすることができます。 アッセイの使用の理論的根拠は、腫瘍は、腫瘍細胞が継続的に間質（宿主細胞と細胞外マトリックス）と相互作用し、かつ、これらの分子相互作用を介して侵入を微調整1である生態系であり、実際の概念です。そのため、アッセイにおいて腫瘍細胞をliviに直面しています腫瘍細胞による浸潤のための基質として、また間質細胞とマトリックス要素の異なるタイプの供給源として働くだけでなく、ngのニワトリ胚の心臓断片2、。ニワトリの心臓は、筋細胞、線維芽細胞および内皮細胞を含む、細胞外マトリックスはラミニン、フィブロネクチンおよびコラーゲンの異なる種類で構成されています。このように、三次元器官培養技術は、患者の腫瘍の浸潤に関与する多くの細胞および分子間相互作用を覆います。 ニワトリの心臓アッセイの主な利点は、間質効果の実装です。この局面は、基底膜3または間質マトリックス4分子からなる非生物ゲルに腫瘍細胞の浸潤に基づいて、in vitroで他の浸潤アッセイよりも完全です。器官培養実験に見られるように、腫瘍細胞と正常な生体宿主組織との間の対立の概念は、いくつかによって導入されましたイギリス6、およびドイツ7のシュライヒでウルフとシュナイダーフランス5で、イースティとイースティ含む作者。引用された方法に比べて、ニワトリの心臓浸潤アッセイの二つの技術的利点は、フラグメントの量を簡単に標準化することができること、およびそれらが器官培養中に機能の完全性の監視を可能に収縮、残っていることです。それらは容易に卵の無菌内容から切除することができるのでさらに、鳥類の胚が好ましいです。アッセイは、腫瘍細胞に周囲の複雑な間質を提供することにより、ニワトリ漿尿膜の膜アッセイ8に概念的な類似性を有しています。 アッセイは、正常にかかる9およびHCT-8（大腸）10細胞株ファミリーMCF-7（乳房）と同様のヒト腫瘍の浸潤性および非浸潤性細胞の変異体を区別するために適用されています。技術は、同様に、潜在的に抗浸潤化合物を試験するのに有用です<suP&gt; 11,12。さらに説明されるように、それは小有機分子の構造 - 活性関係を確立するために使用することができます。アッセイは、しかし、アカウントに癌浸潤に対する免疫学的細胞の寄与を取ることはありません。それは技術があるため操作の数が多い、検定実行の限られた数（最大30文化）と長いターンアラウンドタイム（約1ヶ月）の、ハイスループット分析システムとみなすことはできないことを強調すべきです。

<table><tbody><tr><td>リンゲルの塩溶液</td><td>ブラウン</td><td>CEO123</td><td></td></tr><tr><td>バクト寒天</td>ベ<td>クトンディキンソン</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>トリス-(ヒドロキシメチル)-アミノメターンアナ</td><td>ラーVWR</td><td>103157P</td><td></td></tr><tr><td>BSA:ウシ血清からのアルブミン、コーンVフラクト。</td><td>シグマ</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>MEM-Rega 3</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td></td><td></td>19993013</tr><tr><td>ジャイロトリー シェーカー</td><td>ニューブランズウィック サイエンティフィック</td><td>G10 および G33</td><td></td></tr><tr><td>三角フラスコ 50 ml</td><td>ノボラブ</td><td>92717</td><td></td></tr><tr><td>ガラス ペトリ皿</td><td>ノボラブ</td><td>68516</td><td></td></tr><tr><td>虹彩切除はさみ</td><td>ルメックス</td><td>11-0625</td><td></td></tr><tr><td>眼格子付きマクロスコープ</td><td>ワイルド</td><td>157702</td><td></td></tr><tr><td>パラフィンワックス</td><td>国際医療製品</td><td>8599956</td><td></td></tr><tr><td>エオシンY</td><td>シグマ</td><td>230251-25g</td><td></td></tr><tr><td>ハリスのヘマトキシリン</td><td>シグマ</td><td>HHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>カバースリッピング樹脂(ティッシュテック)</td><td>さくら</td><td>4494</td><td></td></tr><tr><td>パラフィン溶解装置</td><td>GFL1052</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラフィン切片用ミクロトーム</td><td>ライヒェルト</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ガスインおよびアウトレット付き三角フラスコ用Stppers</td><td>Novolab</td><td>2602421および260243</td><td></td></tr><tr><td>ジアミノベンジジン</td><td></td><td>Sigma D8001</td><td></td></tr><tr><td>REAX ロッキングテーブル</td><td>ハイドルフ</td><td>54131</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルティッシュディッシュ</td><td>VWR</td><td>NUNC142475</td><td></td></tr><tr><td>眼科用核摘出スプーン</td><td>Rumex</td><td>16-060</td><td></td></tr><tr><td>鋭い鉗子</td><td>Rumex</td><td>4-111T</td><td></td></tr><tr><td>鈍い鉗子</td><td>ニッケルエレクトロ LTD</td><td>7112</td><td></td></tr><tr><td>三角フラスコ 5 ml</td><td>Novolab</td><td>211901</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライドを洗浄し、脱脂</td><td>国際医療製品</td><td>8613908</td><td></td></tr></tbody></table>

テストのためのひよこ心臓浸潤アッセイ癌細胞の浸潤性および潜在的に抗浸潤化合物の活性

Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds

ニワトリ心臓アッセイの目的は、三次元で腫瘍浸潤を研究するための関連する器官培養方法を提供することです。アッセイは、侵襲的および非侵襲的な細胞とを区別し、腫瘍浸潤に対する試験化合物の効果の研究を可能にすることができます。癌細胞は - のいずれかの凝集体または単一細胞として - ニワトリ胚の心臓の断片に直面しています。数日または数週間のための懸濁液中の器官培養した後に直面している培養物を固定し、組織学的分析のためにパラフィンに包埋しました。癌細胞と正常組織との間の三次元相互作用は、その後、ヘマトキシリン​​ - エオシンで、または心臓組織内のエピトープまたは対向癌細胞に対する免疫組織化学的染色後の染色連続切片から再構築されます。アッセイは、癌浸潤は、癌細胞とその隣接する間質ホスト要素（筋線維芽細胞、endoth間の分子間相互作用の結果であることを最近の概念と一致していますelial細胞、細胞外マトリックス成分、等）。ここで、この間質環境は、生体組織片などの癌細胞に提供されます。アッセイの妥当性への支援の側面が複数あります。時間と宿主組織の空間の漸進的占領と交換、および直面細胞の生体内での侵襲性および非侵襲性は、一般的に、アッセイの結果と相関する：アッセイにおける侵入は癌浸潤の基準に従うものです。さらに、 インビボでの細胞の浸潤パターンは、病理学者によって定義されるように、アッセイでの組織学的画像に反映されています。多数の潜在的抗浸潤有機同族化合物を用いて得られた結果の定量的構造活性関係（QSAR）分析は、診療所で使用されるフラボノイドおよびカルコン、および既知の抗転移薬のための構造-活性関係（ 例えば、微小管阻害剤の研究を可能にしました）ならびにアッセイに侵入を阻害します。 HoweveR、アッセイは、アカウントに癌浸潤に対する免疫学的貢献を取ることはありません。

図5に示すように、組織切片は、成功した多数のアッセイの最終結果を示しています。培養物の組織学的音、生細胞を示し、腫瘍細胞と正常組織との間の相互作用を解析することを可能にします。さらに、正常組織からの免疫反応は、免疫拒絶システムが開発される前に、例えば、使用されるニワトリ胚の正確な年齢を確認する、観察することができません。培養期間中（グロス）の汚染がないことを示している目に見える細菌は、ありません。最後のセクションの丸みを帯びた周囲は三角フラスコの壁に（一時的な）接着性の兆候なしに懸濁液中で培養を確認します。 多くの化合物は、このアッセイで試験されています。薬物は、一般に対向PHF /腫瘍集合対が小さな三角フラスコ（ステップ2.7）に転送される時点で培地に供給されます。いくつかは、で知られている（ツールとして使用されましたhibitorsおよび活性化）は、腫瘍の浸潤の過程に関与する経路およびエフェクター分子を解明します。構造的に関連した他の化合物については、定量的構造活性相関（QSAR）は、ニワトリの心臓浸潤アッセイの結果に基づいて設立されました。そのため、関連ポリ...

ここでは、三次元での正常組織片をリビングへの腫瘍細胞の浸潤を研究するためのプロトコルを提示します。この器官培養技術は、主にin vitroで 、潜在的に抗浸潤薬をテストするために適用されます。

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish ...

この手順の全体的な目的は、腫瘍浸潤を三次元的に研究するための適切な臓器培養法を提供することです。まず、鶏の胚性心臓から得られた正常組織片を調製し、次に、腫瘍細胞の凝集体を懸濁状態で調製することでこれを達成します。その後、腫瘍細胞凝集体を、懸濁培養でのインキュベーションのため、半凝固アガロース床上の正常組織片と個別に接触させます。最終ステップとして、接触させた培養物を固定し、パラフィン埋没および組織切片作成を行います。最終的に、組織切片の連続顕微鏡解析により、腫瘍細胞の組織片への浸潤を視覚化できます。ゲルを用いた浸潤アッセイなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、腫瘍細胞を三次元の生存組織断片に接触させることができる点にあります。抗浸潤薬への未充足のニーズがあるため、本手法がもたらす意義はがん治療にまで及びます。一般的に、この方法に不慣れな人は苦労することがありますが、その理由は、組織断片および腫瘍細胞凝集体の特定の寸法を使用することの重要性を軽視しているためです。この手法はがんの浸潤に関する知見を得るために有効ですが、他の系にも適用可能です。例えば、炎症細胞による末梢組織への浸潤や、幹細胞の心臓組織への統合などの研究に利用できます。心臓断片の培養においては、まず受精卵を37 °Cで9日間インキュベートすることから始めます。9日目に、70% ethanolで殻を消毒します。次に、組織培養キャビネット内で、鈍端鉗子を使用して殻を開けます。続いて、摘出用スプーンを胚の頸部の周囲に配置し、胚を殻から取り出します。5 mLのリンガー塩類溶液を入れた5 cmのガラス製ペトリ皿に胚を置きます。次に、両手に鋭いピンセットを持ち、胸部の腹側皮膚を切り開き、胸骨を除去します。その後、虹彩切除用ハサミを用いて心臓を切り出し、主要な血管を切り離します。心臓を、5%胎牛血清を添加した5 mLの培養液 containing 5 mL 含有する新しい5 cmガラス製ペトリ皿に転移させます。校正済み接眼グリッドを備えた顕微鏡下で、マイクロディセクション用ハサミを用いて心臓の上部頭側3分の1を切除し、心房および関連血管を除去します。次に、鋭いピンセットを用いて、心外膜を心室から剥離します。続いて、心室に矢状断の半切開を加え、血液を除去します。その後、心室を、5 mLの新鮮な培養培地と胎児牛血清を入れた別の5 cmシャーレに移し、組織を直径0.4 mmの断片に切断します。すべての心室の切断が終わったら、ディッシュをゆっくりと回転させ、すべての断片をディッシュの中央に集めます。次に、ステンレス製ニードルを使用して、すべてのCora Elianaをペトリ皿の周辺部へ移動させます。その後、ガラス製パスツールピペットを用いて、心臓の断片を、薄い培養液の膜で覆われた50 mLのエルレンマイヤーフラスコに移します。フラスコ内に5%二酸化炭素を満たし、断片を回転振盪機を用いて37 °C、70 rpmで24時間培養します。翌日、断片をペトリ皿に移し、針を用いてCorporal Eliana、暗色の壊死断片、および組織の凝集体を除去します。断片を6 mLの培地を含む50 mLエルレンマイヤーフラスコに入れ、回転振盪機でさらに60時間培養します。2日半後、顕微鏡と針を用いて、線維芽細胞の薄い均質な層を示し、直径が0.4 mmであるステロイド断片を選別します。次に、前培養した心臓断片を、新鮮な培養液 containing 含有する別のシャーレに移します。対向培養を開始する3日前に、100,000 cells/mL のテスト細胞を、50 mL のエルレンマイヤーフラスコ内の 6 mL の適切な培養液に懸濁します。その後、このフラスコを、37 °C、70 rpm の回転振盪機を用い、適切な濃度の二酸化炭素条件下でインキュベートします。72時間後、顕微鏡下で凝集塊を確認し、直径0.2 mmの類形成細胞凝集塊を選択します。次に、少量の培養液に懸濁させた直径0.4 mmの前培養心臓断片を8個、半固形アガロース培地を含む胚発生用監視ガラス（ウォッチグラス）に転移させます。断片を円状に配置し、フィルターペーパーの小さな断片を用いて余分な培地を吸引します。0.2 mmのステロイド細胞凝集塊を10個、円の中に配置します。余分な培地を除去した後、各凝集塊を、あらかじめ培養した心臓断片に接触するまで移動させます。次に、シャーレの蓋をパラフィンで密封し、テスト細胞の培養済み心臓断片への接着特性に応じて、共培養を37 °Cで4時間から24時間インキュベートします。インキュベート終了後、対面させたペアを37 °Cに予熱した培養液に浸し、パステレットピペットを使用して、各ペアをそれぞれ1.5 mLの培養液が入った個別の5 mLエルレンマイヤーフラスコに転写します。その後、適切な濃度の二酸化炭素を供給しながら、ジャイラトリーシェイカーを用いて37 °C、120 rpmでフラスコをインキュベートします。また、対面させたサンプルの組織学的解析用に、2 mLのリンゲル塩類溶液を満たした5 mLエルレンマイヤーフラスコを予備として2つ用意します。インキュベーション期間の終了後、培養物をリンガー塩類溶液に数秒間移し、血清タンパク質を除去します。次に、梨をBowen Holland溶液3 mLを含む直径3 cmのシャーレに個別に移します。2時間後、培養物を3 mLの脱塩水で3回洗浄し、その後、固定液を可能な限り除去するために水道水中で2時間インキュベートします。最後に、各ペアを3 mLの70% ethanolに転送し、数日間保存します。培養に成功したこれらの画像では、腫瘍組織および心臓組織のいずれにおいても正常組織による免疫反応が観察されず、免疫拒絶系が発達する前のニワトリ胚が使用されたことが確認できます。また、細菌も見当たらないことから、培養期間中に重大な汚染がなかったことが示されています。さらに、切片の周辺が円形であることから、培養物がerla mireフラスコの壁面に一時的に接着することなく、懸濁状態で存在していたことが確認されました。本Chick心臓浸潤アッセイを用いて、多くの化合物がテストされてきました。構造的に関連のある化合物については、本アッセイの結果に基づいた定量的構造活性相関が確立されており、予測された抗浸潤活性と実験的な抗浸潤活性との間に明確な相関があることがデータで示されています。実際、この混同行列を用いることでアッセイの弱点と利点をまとめ、実験の正確性と再現性を概括的に示すことができます。この新しい手順を試みる際は、手順に従い、組織片の規定のサイズを厳守することが極めて重要です。「炎症細胞は浸潤しているか？」といった追加の疑問に答えるために、非癌細胞との共培養などの他の手法を行うことも可能です。このビデオを視聴することで、浸潤性腫瘍細胞と非浸潤性腫瘍細胞をどのように区別するかについて、十分な理解を得ることができます。固定剤の取り扱いは非常に危険であるため、本手順の実施中は換気などの予防措置を講じることを忘れないでください。

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Medicine

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