Name: 組織学的分析のために筋肉凍結切片の調製でのやっていいことといけないことを行います (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 学ぶ筋肉生検の凍結切片調製法。液体窒素冷却イソペンタンによる急速凍結とOCT包埋、7μm切片、染色技術を用いて凍結アーチファクトを回避し、組織形態を良好に保存する方法です。

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原稿の修正についてAlex Millerに感謝します。この研究は、Cure CMD、Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM)、Muscular Dystrophy Association (218938) から M.G. に授与された研究助成金によって支援されました。

1.組織の収穫と筋組織の凍結<ol><li>イソフルラン（2-クロロ-2-（ジフルオロメトキシ）-1,1,1-トリフルオロエタン）の過剰摂取で、​​マウスを安楽死させます。ヒュームフードで、このステップを実行し、そのようなデシケーターやイソフルランに浸した綿棒を含むベルジャー等の二次封じ込めメソッドを使用します。 </li><li>しっかりとフットパッドを絞ることによって死を確認してください。このような頸椎脱臼などの安楽死の二次メソッドを使用します。 </li><li>筋肉の緩み髪の毛の付着を低減するために、70％のアルコールで毛を濡らします。このような＃5のように微細な鉗子を使用して、四肢切断、皮膚の皮をむきます。 </li><li>慎重に、下骨から（この場合は前脛骨筋（TA））、目的の筋肉を分離腱から開始して削除します。 </li><li> 、筋肉を切除10月（最適切断温度化合物）でそれをカバーし、標識された使い捨ての凍結金型の上に平らに横たわっていました。筋肉は、その正常な生理的姿勢であることを確認してください（TAIにヘッド延伸することなくL）。あるいは、小さな発泡スチロールの正方形の筋肉を凍結し、筋肉の正しい長さを確保するために昆虫ピンを使用してピン。 </li><li>液体窒素を用いた鋼ビーカーに2-メチルブタン（イソペンタン）を冷やします。 5分 - これは、平均3になります。白い沈殿物をビーカーの底と壁に形成し始めるまで、断続的に攪拌してください。 注：この場合、イソペンタン、最適な凍結温度に到達した（-150°C） </li><li>チルド2-メチルブタンの筋肉を含む金型を浸し。 12秒と腓腹筋ヒラメ筋（GS）と15上腕三頭筋などの大きな筋肉 - - 20秒かかる6ダイアフラムと長指伸筋（EDL）などの小さな筋肉をフリーズします。あまりにも長い間、この亀裂につながる可能性としてのための筋肉を凍結しないでください。 </li><li>ドライアイスの上で凍結組織を移し、（このプロセスは15の周りの平均をとることに注意してください - 20分）イソペンタンを蒸発させて。アルミ箔で組織をラップとuでそれらを格納切片までLTRA低温（-70℃〜-80℃）。 </li></ol> 2.組織ブロックを準備するために10月に組織を埋め込みます<ol><li>ドライアイス上で輸送組織が融解を防ぐためにcyrostatします。 （組織の完全融解を回避するために、C°-24、-20に設定）チャンバをクライオスタットし、それらを30分間平衡化させるために組織を転送します。 </li><li>の冷却ペルチェベイの電源を入れます。クライオスタットは、この冷却を持っていない場合は、すぐに10月を凍結するエアロゾル冷却スプレーを使用しています。このような埋め込み中の任意の時点での筋融解は、凍結損傷を与えることができないようにしてください。 </li><li>試料ディスク上の10月の均一な薄層を追加し、冷まします。上にまだ液体ながら10月のほとんどが底に凍結されている場合には、（横断面と縦断のための10月に平行のため10月に垂直な方向）正しい向きで組織を挿入します。すぐにOCTを凍結するエアロゾル冷却スプレーを使用してください。熱EXTと組織のunembeded部分に触れてractor、45秒間待ちます。 </li><li> 、筋肉の周りに10月の別の薄い層を追加し、エアロゾル冷却スプレーで噴霧し、前のステップと熱を抽出。 </li><li>少しずつで10月を追加し続けると、すぐに全体の筋肉がカバーされるまでエアロゾル冷却スプレーおよび熱抽出器の組み合わせを使用して、10月にフリーズ。 </li><li>組織ブロックの上に熱抽出を入れ、5分間待ちます。 </li></ol> 3.切片を作製し、筋肉のミッド腹領域からのセクションを識別する<ol><li>試料ヘッドの上に試料をマウントします。ディスクを右に回して、締め付けます。試料ディスクを試料ヘッドとの良好な接触状態にあることを確認します。 </li><li> °-21の間および-24℃に室内温度を調整し、設定温度が達成されるまで待ちます。 </li><li>厚さの設定（7μm）を調整します。粗微動の設定を使用してブロックを前進または後退させることにより、ブロックをトリミング。 </li><li>セクションを収集上のスライドに切断面の付着を容易にするために、反対の電荷間の引力を使用して、セクションの上にスライドの上部を押して、正に荷電した顕微鏡スライドを予熱しました。 </li><li>セクションの断面積（​​CSA）を測定することにより、ミッドベリーセクションを識別します。顕微鏡に接続されているコンピュータにこの使用してイメージングソフトウェアを実行してください。 注：ソフトウェアプログラムのトレース機能を介して位相コントラスト画像が取得され、筋肉全体の円周を測定します。これは、CSA、ならびに最小フェレット直径（粒子の反対側にある2つの平行な接線の間の最小距離として表現さ​​れる繊維断面サイズの測定）測定の両方が得られます。注：CSAと最小フェレット直径測定値がプラトーに開始すると、半ば腹に達しました。 </li><li>将来の染色のために-80℃でスライドをインベントリおよびアーカイブします。 注：10月前staininに削除する必要はありません。G手順。スライドをカバーガラスをされると、彼らはすぐに染色される準備ができています。 </li></ol> 4.染色注：詳細なステップバイステップの手順は、製品データシートに記載されていますし、染色手順のために従うべきであるが、個人の最適化は、最適な染色を得るために必要とされ得ます。 <ol><li>メディアは（表を参照）の取付は、水と混和しないので、（70％、95％、および100％エタノールに2分間ずつ）アルコールの増加グレードを通してスライドを脱水し、キシレン（5分間、100％）を確保するためにそれらをクリアスライドは、時間をかけて不透明になることはありません。 </li><li>セクションをカバースリップし、それらが乾燥してみましょう。イメージングソフトウェアを備えた顕微鏡を用いた画像。 </li></ol>

<ol><li>Bonnemann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+approach+to+the+congenital+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+disorders+%3A+NMD%22%5BJournal%5D)">Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies.</a> Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).</li>
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<li>Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+regeneration+and+tackling+apoptosis%3A+a+combinatorial+approach+to+treating+congenital+muscular+dystrophy+type+1+A%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A.</a> Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).</li>
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<li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).</li>
<li>Maccarty, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Diagnostic+Reliability+of+Frozen+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The Diagnostic Reliability of Frozen Sections.</a> The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

組織学および免疫組織化学は、様々な神経筋障害で病状の症状および進行を理解する上で重要なツールとして使用されています。古典的には、筋肉生検は、最初のホルムアルデヒドで固定し、その後パラフィンワックスで包埋しました。ホルムアルデヒド固定は、組織構造を保持し、室温で組織保存および輸送を可能にするが、それはまた、正確な免疫染色​​を達成するためのさらなるステップを必要とする酵素架橋するタンパク質を不活性化します。この問題は、凍結切片を用いて除去されるが、この方法は、最適な染色結果と正確な解釈14,15を得るためにユニークな技術的な課題を提示します。 第一に、自己分解と分解が身体から除去した後にすぐに開始するとサンプルは外科的切除直後に凍結することが必須です。組織はまた、サイズに応じて変化する時間の適切な量のために迅速かつ完全に凍結されなければなりません/組織の厚さ。これが正しく行われていない場合は、組織学的評価のために無駄な組織をレンダリング発生するダメージを凍結します。凍結後、組織を直ちにドライアイス上に保存されている必要があり、その後、切片までの超低温（-80℃）...

筋肉組織学の検討は、神経筋障害1-4の異なるタイプの理解に重要な役割を果たしています。他の技術と組み合わせると、それは研究者が病状の症状および進行のより良いアイデアを得ることができ、また、治療的介入5-10の有効性を評価するために不可欠であることができます。しかし、正確に、組織を直ちに切除前の生理的状態を維持するように適切な方法で保存する必要があります。これは、除去、保存、切片、および染色の際に細心の注意が必要です。 組織を光学顕微鏡研究のため、2つの異なる方法で調製する​​ことができます。 （FFPE）のセクション、埋め込 ​​まれた第1の方法、ホルマリン固定パラフィンは、組織はパラフィンワックス11,12に埋め込 ​​まれる前に、10％の自然緩衝ホルムアルデヒド中に固定することが必要です。固定工程は、より良い形態を維持するのに役立つだけでなく、クロスリンク内因性のPRoteinsは、このように免疫染色のための複雑な抗原回復手順を必要とし、このようなセクション12の酵素染色の可能性を排除します。凍結切片を、一方、予め固定または処理する必要はありません。したがって、タンパク質は、天然の生物学的な立体配座13,14を保持することができます。また、凍結切片はまた、時間に肉腫および他の外科的生検15の術中診断で、たとえば、必要である、迅速なターンアラウンドタイムを可能にします。適切に行われていない場合は、この方法は、組織学的検査のためのセクションでは、不向き作る筋肉のアーキテクチャの変更を紹介しダメージを、凍結する傾向があります。本稿では、適切な検査のために最適な染色を達成するために、筋肉生検を準備するための最も効果的な方法を概説します。

<table><tbody><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカCM 1850</td><td>ライカマイクロシステムズ株式会社</td><td>バッファローグローブ、イリノイ州60089米国、オフィス電話1-800-248-0123 代替:リチャードアレンサイエンティフィック</td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>Nikon Eclipse 50i</td> ニ<td>コンインスツルメンツ株式会社</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 オルタナティブ: Olympus</td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア</td><td>ニコンイメージングソフトウェア 基礎研究</td><td>ニコンインスツルメンツ株式会社</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternatives: Image J, Metamorph</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>14043-220-05</td><td>JD Medical Dist. Co., Inc.</td><td>1923ウェストピオリアアベニュー、フェニックス、アリゾナ州85029アメリカ</td></tr><tr><td>10月</td><td>4583</td>年 <td>さくら株式会社</td><td>トーレンス、CA 90501 U.S.A. 代替ソース:ライカマイクロシステム</td></tr><tr><td>Freeze It</td><td>23-022524</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. 代替ソース: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Disposable tissue mold</td><td>22-363-554</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Colorfrost plus slides</td><td>9991001</td><td>Thermofisher</td><td>790メモリアル博士、ケンブリッジ、マサチューセッツ州02139 U.S.A. 代替ソース:VWRサイエンティフィック</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>650501-4L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050スプルースストリート、セントルイス、ミズーリ州63103 U.S.A. 代替ソース:VWRサイエンティフィ</td></tr><tr><td>ックエチルアルコール</td><td>HC-1300-1GL</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー790メモリアル博士、ケンブリッジ、マサチューセッツ州02139 U.S.A. 代替ソース:VWRサイエンティフィック</td></tr><tr><td>2-メチルブタン</td><td>M 32631-SL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. 代替ソース: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>HC-7001GA</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. 代替ソース: VWR</td></tr><tr><td>Scientific Cytoseal 280</td><td>8311-4</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. 代替ソース: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Hematoxylin Gill #3</td><td>CS402-1D</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. 代替ソース: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>6766007</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific</td></tr></tbody></table>

組織学的分析のために筋肉凍結切片の調製でのやっていいことといけないことを行います

Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

筋肉生検の組織学的評価は、神経筋疾患の病態の発症および進行の理解に不可欠なツールを務めています。しかし、そうするためには、適切なケアは、最適な染色を達成するための組織を切除し、保存するときに注意が必要です。組織保存する一つの方法は、ホルムアルデヒドで組織を固定し、その後パラフィンワックスでそれらを埋め込むことを含みます。この方法は、よく形態を保持し、室温で長期保存を可能にしますが、面倒であり、有害な化学物質の取り扱いが必要です。また、効果的な免疫染色​​のための抗原回復プロトコルを必要と抗原架橋、ホルムアルデヒド固定をもたらします。逆に、凍結切片は、固定を必要とし、したがって、生物学的な抗原の立体構造を保持しません。この方法は、intraoperaような迅速な組織学的評価を必要とする状況で、それは特に有用なもの、時間の周りクイックターンで明確な利点を提供します外科的生検を的。ここでは、異なる組織学的および免疫学的汚れによる可視化のための筋肉生検を調製する最も効果的な方法を説明します。

収穫および組織の凍結のためのセットアップを図1に見ることができる。切除した組織を乾燥する（ 図1A）を回避するために、PBSに浸したガーゼ上に格納されるべきです。組織を組織学的分析のために使用されるように選択される場合、それらは、OCT中に浸漬し、適切な向きでクライオモールド上に配置し、正確な形態（ 図1B）を確保することができるような生理学的長さに近いべきです。組織を凍結するのに適したイソペンタンのスラリーを液体窒素で冷却したイソペンタンを小さな白い析出物が下部に表示されるまで撹拌することにより達成することができます。この時点で、メディアが（ 図1C）を凍結するのに適しています。組織は、組織（ 図1D）のサイズ/厚さに応じて冷却したイソペンタン中で6-15秒から凍結されるべきです。凍結後、筋肉はそれを、その時点で白はドライアイス上に保存され、後に-80 &lt;に転送する必要がありますチョークのように表示されます強い&gt;℃の冷凍庫。 <p class="j...

ここでは、筋生検の凍結、埋め込み、凍結切片、および人工物の凍結を避けるための最も効率的な方法を示します。

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

この手順の全体的な目的は、凍結 artifact の作成など、筋生検組織から凍結切片を作製する際のピットフォールを回避することです。これは、まず液体窒素で冷却した 2-メチルブタンを用いて筋肉を急速凍結させることで達成されます。その後、クライオスタット内で筋生検組織を平衡化させ、エアロゾル冷却と熱抽出による急速凍結を行いながら、室温で OCT コンパウンドに少量ずつ包埋します。次に、7 µmの厚さで切片を作成し、温めた正電荷ガラススライドに貼付します。最終ステップとして、組織学的な評価に必要な染色を組織切片に行います。適切に作製された筋生検試料では、凍結 artifactがなく、組織学的な構造が良好に保存されます。したがって、パラフィン埋め込み組織切片作成などの他の既存の手法に対する本手法の主な利点は、非常に迅速であり、内因性抗原の構造や機能を変化させないことです。本手法は、成長、再生、炎症、線維化、壊死など、筋生物学における健康と疾患に関する重要な疑問への回答に役立ちます。本手法は、健康な筋肉と疾患のある筋肉の状態を判定できるため、筋疾患の治療や診断への応用が期待されます。この手法は、さまざまな形態の筋ジストロフィーに関する知見を得るのに有用ですが、がんやエイズの末期段階に伴うカヘキシアや、高齢者における筋肉量の減少など、他の系にも適用可能です。まず、ドラフトチャンバー内およびベルジャーなどの二次封じ込め条件下で、イソフルランを過剰投与してマウスを安楽死させます。足底を強くつまみ、動物の死亡を確認してください。次に、70% alcoholで被毛を湿らせます。これにより、抜け毛が筋肉に付着するのを防ぎます。その後、5番の精密ピンセットを用いて、肢から皮膚を剥離します。腱から始めて、目的の筋肉を骨から慎重に分離します。本例では、前脛骨筋を単離します。筋肉を切り出した後、OCTで覆い、ラベルを貼った使い捨て凍結モールドの上に平らに置きます。スライス前に、さらにOCTを添加します。筋肉が頭尾軸に沿った正常な生理学的方向にあること、および筋肉が伸展していないことを確認してください。その後、冷却します。液体窒素を用いて、スチールビーカーに入れたイソペンタンを冷却します。プラスチックスパチュラで3〜5分間、断続的に撹拌してください。白い沈殿が生じると、イソペンタンが最適温度に達したことになります。この時点で、充填済みのモールドを溶液に浸してください。横隔膜や最長指伸筋などの小さな筋肉では6〜12秒を要します。より大きな筋肉では15〜20秒を要しますが、凍結させすぎるとひび割れが生じる可能性があります。次のステップとして、凍結した組織をドライアイス上に置き、残留したイソペンタンを蒸発させます。これには約15〜20分かかります。組織が乾燥したら、ホイルで包み、切片を作成するまで-80°Cのフリーザーで保存します。切片作成の直前に、凍結組織をドライアイスを用いてクライオスタットまで搬送します。組織を-24°Cから-20°Cに設定したクライオスタットチャンバーに移し、30分間平衡化させます。この温度では、組織は完全に融解することはありません。次に、まず組織を包埋します。利用可能な場合は、ペルチェベイの冷却機能をオンにします。次に、標本ディスクにOCTを均一に薄く塗布し、冷却させます。第三に、OCTが底面で凍結しつつ上面がまだ液状である状態で組織を挿入し、横断切片を作成する場合は組織をOCTに対して垂直に、縦断切片を作成する場合は組織をOCTに対して平行に配置します。次に、エアロゾール冷却スプレーを使用してOCTを急速凍結させます。その後、組織の未浸透部分にヒートエクストラクターを当て、45秒間保持します。この工程のどの段階においても、筋肉を融解させないでください。クライオスタットにペルチェ冷却機能がない場合は、エアロゾール冷却剤を使用して組織周囲のOCTを迅速に凍結させます。次に、筋肉の周囲にOCTをさらに薄く盛り、エアロゾール冷却剤をスプレーして前ステップと同様に熱を抽出します。筋肉全体が覆われるまで、少量のOCTを順次追加し、エアロゾール冷却剤と熱抽出器を組み合わせて迅速に凍結させます。次に、組織ブロックの上にヒートエキストラクターを置き、切片作成に進む前に5分間待ちます。これで検体を検体ヘッドに取り付ける準備が整いました。まず、ノブを締めてディスクを固定します。チャンバーの温度が-24°Cから-20°Cの間にある間に、試料ディスクが試料ヘッドに十分に接触していることを確認します。チャンバーが設定温度に達したら、薄切厚を7 µmに設定し、ブロックのトリミングを開始します。粗動および微動調節を用いてブロックを移動させます。切片を回収する準備ができたら、ランプで加温した正電荷付きのスライドグラスの上に切片の上端を押し当てます。正しく凍結されていれば、組織面はチョークのような白色になります。一方、不適切に凍結された組織や、マウント工程で融解した組織は、赤色から桃色に見えます。スライドは今後の解析のためにディープフリーザーで保存できます。組織の中央腹側部分は、イメージングソフトウェアパッケージのトレース機能を用いて、位相差像から断面積を測定することで特定できます。この解析により、面積と最小フェレット径の両方の測定値が得られます。これらの測定値がプラトーに達し始めると、腹部の中央に到達したことになります。ほとんどの染色プロトコルについてはメーカーから段階的な手順書が提供されていますが、最適な染色強度を得るためには、個別の最適化が必要になる場合があります。OCTを除去する必要はありません。染色の際、最適な免疫染色を行うためには、必ず加湿チャンバーを使用してください。切片の乾燥を防ぐため、濡れたペーパータオルの上にパラフィルムを被せ、小さな箱の中で密閉する必要があります。免疫染色を行わない永久標本スライドの染色工程では、染色プロトコルに従い、昇順のアルコール濃度でスライドを脱水させてください。封入剤は水で混ざり合わないため、100%キシレンに5分間浸してスライドを透徹させます。これにより、時間の経過とともにスライドが不透明になるのを防ぎます。その後、染色した前脛骨筋の中腹領域の切片の封入および撮像を行います。ヘマチン・エジン染色を用います。適切に処理された切片は、全体にわたって一貫した形態と均一な染色性を示します。一方、凍結損傷や早期融解によって不適切に処理された筋肉では、形態に多数の断裂が見られ、シュレッド小麦のような外観を呈します。これらの切片を用いて免疫組織化学染色も実施した。染色は良好であった。フィブロネクチンは緑色に、DAPIは青色に染色されている。このビデオを視聴することで、筋肉の構造を評価するための筋肉生検からの適切な凍結切片の作製方法について、深く理解することができます。習熟すれば、すべての手順を適切に行うことで、およそ4～5時間で完了させることが可能です。この手順を試みる際は、処置後の筋肉の融解を防ぐことが重要である点に留意してください。成長や再生といった追加の疑問を解消するために、免疫染色やin situハイブリダイゼーションなどの他の手法を実施することができます。

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Flashは、E12.5マウス脳の凍結とCryosectioning

このビデオでは、筋肉組織をスナップで凍結し、その薄い切片を取得する手順を説明しています。この技術は、結腸がんマウスモデルにおけるがん関連悪液質の研究に役立ちます。...

切片化のための筋肉組織のスナップ凍結:急速に凍結したマウスの筋肉組織の極薄切片を得るためのプロトコル

骨格筋組織の構造的、機能的、生化学的特性を決定するための分析は、適切な準備によって大幅に促進されます。...

組織トリアージや骨格筋疾患のモデルのために凍結

この原稿では、石灰化組織の凍結切片に対する数回の蛍光イメージングから、複数の応答測定値の整列した合成画像を生成するためのハイスループットの半自動凍結組織学プラットフォームを紹介します。...

高スループット、石灰化組織のマルチイメージCryohistology

この原稿は、成体マウスや、解剖などの筋肉のその後の操作、凍結、切断、ルーチン染色、および筋線維断面積の解析における急性骨格筋再生を誘導するための詳細なプロトコルを記述します。...

心臓毒注入による急性骨格筋再生の誘導

連続凍結切片を、単一のマウス骨格筋からの隣接領域を用いた遺伝子発現の測定のための組織学的応用およびRNAの濃縮を可能にするために収集されます。直接アプリケーション間で比較され、プールされた凍結切片と測定30mgの - 高品質のRNAが20から得られます。...

遺伝子発現と組織学的分析のためにシングルマウス骨格筋の連続領域の凍結切片化

このプロトコルは、液体窒素に直接それらを沈めることにより、筋肉組織を凍結する手順を説明します。このプロトコルはまた、試料の窒素ガス際に液体窒素に接触組織表面の「ブランケット効果」を回避することができ、新たなクライオバイアルを強調しています。...

筋肉組織を直接液体窒素中に浸漬されたときにアーティファクトを凍結マルチホールクライオバイアルが不要

アクティブなオートファジーは、筋肉幹細胞（MuSC）の活性化に不可欠な、筋肉の再生を促進します。ここでは、コントロールマウスおよび損傷マウスからの筋組織切片のMyoD陽性MuSCにおける自食作用マーカーであるLC3のin situ検出のためのプロトコールを提供する。...

筋幹細胞におけるオートファジーのin situ Immunofluorescent Staining

ここで説明するプロトコルは、筋凍結切片における壊死性筋線維の直接免疫標識のためのプロトコルである。壊死細胞は、免疫グロブリンG(IgG)を含む血清タンパク質に透過性である。ミオファイバーによるIgGの取り込みを明らかにすることで、筋肉の状態に関係なく壊死を起こす筋線維の同定と定量を可能にする。...

筋生検における免疫標識筋線維変性

このプロトコルは、検査用神経筋研究のためのラットの声の折り目を準備するために使用される方法を記述します。...

神経筋解析のためのラット声帯の調製

増加する証拠は、骨格筋内の脂質の過剰な浸潤が脂肪毒性および糖尿病をもたらすことを示している。ここでは、線維型特異的な方法で脂肪滴のサイズ、密度、および細胞内分布を定量化するために、組織処理、Bodipyによる染色、画像取得、および分析を含む完全なプロトコルを提示する。...

骨格筋中の脂肪滴含量の線維タイプおよび細胞下特異的分析

学ぶ筋肉生検の凍結切片調製法。液体窒素冷却イソペンタンによる急速凍結とOCT包埋、7μm切片、染色技術を用いて凍結アーチファクトを回避し、組織形態を良好に保存する方法です。

組織学的分析のために筋肉凍結切片の調製でのやっていいことといけないことを行います

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