Name: エンジニアード前十字靭帯移植片の評価のための無胸腺ラットモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学ぶ 組織工学用の生分解性ポリマースキャフォールド製造とラット膝への移植手術。16週間後の組織学的・生物力学的評価により、前十字靭帯再建における移植片の品質と有効性を検証する方法です。

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著者は、このプロジェクトの初期のイテレーションへの技術的な貢献のためにガブリエルアロムとマイケルYeranosianに感謝したいと思います。このプロジェクトはOREF臨床医科学トレーニンググラント（NL）によって資金を供給された、HHリー外科研究助成（NL）、退役軍人局BLR＆Dメリットレビュー1 I01 BX00012601（DM）と筋骨格移植財団若手研究賞（FP）。

注：すべての動物の手術は、実験を開始する前に、地元の獣医スタッフと動物使用委員会によって承認された。 エレクトロポリカプロラクトン足場の調製<ol><li>医療グレードのエステルを秤量し、溶解PCLポリマーの溶液を10％w / wを作成する1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールで顆粒状にポリ（εカプロラクトン）を終了する。均質な溶液を確保するために、少なくとも3時間、攪拌プレートを用いて溶液攪拌をしましょう​​。 </li><li>足場の製作のための高度に整列PCL繊維のカフを作成するためにPCLソリューションをエレクトロスピニング。 <ol><li>すべての回でのファンとの化学ドラフト内でエレクトロスピニングセットアップを準備します。これは、エレクトロスピニングプロセスの単離された真空媒体として機能する大型アクリルボックスで構成され、電圧源により駆動源のPCL溶液を、モーター駆動の収集マンドレル、及び真空ポートのエントリポイントを有している。 acryliを清掃してください完全にエタノールでCボックスとエレクトロ製品の品質を損なう可能性のある不純物を除去するためにパラフィルムシートのすべての表面を覆う。 </li><li>負荷を約3ミリリットル18 G、1 1/2インチの針を平滑末端で10mlシリンジに上記溶液の。注射器を上に押して、すべての気泡を除去。プログラム可能なシリンジポンプにソリューションをロックします。電圧源線の取り付けのためのアクリルボックスの外側針の1/2インチを約残しながらアクリルボックスに小さな穴を通して針を挿入します。 </li><li>高度に整列PCL繊維のための集電体としての旋盤マンドレルを回転さ30ミリメートルを使用します。アルミ箔の薄いストリップでしっかりとマンドレルをカバーしています。約15cm離れた注射針からボックスの反対側のモーターにマンドレルをロックします。 </li><li>真空ポートにプラスチック製のホースを挿入し、ヒュームフードの真空源に接続します。真空源をオンにして、蓋付きのアクリルボックスをカバーしています。 </li><li> Sら2.5ミリリットル/時プログラム可能なシリンジポンプの注入速度。 3,450 rpmでマンドレルを動作させるためにモーターの電源を入れ、ワニ口クリップを使用して、箱の外側針の先端に電圧源の正極リードを添付してください。 </li><li> PCL溶​​液の注入が開始されると、電源をオンにし、20kVの動作電圧に設定する。 </li><li> PCL溶​​液0.5mlから均質なカフを作成するために12分間この溶液を注入する。 注：平均して、それぞれのカフは、3~4層の足場の合計を作成するために使用できる2つの6ストリップシートを作成するのに十分な電界紡糸材料を有する。 </li></ol></li><li>レーザーは、低真空の設定、10.0 keVの着陸電圧、6.4ミリメートル作動距離、および3.0のプローブ径で運転VersaLaserカッター2.3上の複数の小さなシートを形成するPCLカフをカット。 注：この例では、コンピュータ支援設計が1.5mmの複数のシートを得るために、カッターを指示するために使用された×35ミリメートル×150ミクロンと足場均等に15％の孔面積で150μmの直径の穴を配布した。 </li><li>プラズマは、イオン加速をPCL表面の親水性を誘導するためにプラズマクリーナーを使用して、PCL足場をエッチングする。 450トルに真空を設定し、ハイパワー（29.6 W）で30秒間足場を扱う。 </li><li>無菌環境での70％エタノール中で足場を浸し。 </li><li>コートコラーゲンとの個々の足場は、in vivoでの細胞接着および増殖を促進する。 <ol><li> 4℃での1×PBS中で9：1のPurecolコラーゲン3 mg / mlの標準溶液、10×PBS、2.5滅菌溶液と0.1 N NaOHで1：8に希釈することによって、コラーゲンコーティング溶液を作成する。溶液の均一性を確保するために十分に混合する。 </li><li>コー​​ト個々1.5ミリメートル×35ミリメートル×上記のコラーゲン溶液の薄層フィルムと150μmの足場。無菌環境下で24時間乾燥することができます。 </li></ol></li><li> 5-0ビクリル縫合糸を使用して、スタックおよび4つの個々の1.5ミリメートル×35ミリメートル×150μmの足場を固定Krackowは、移植の準備ができている最終的な厚さ0.6mm、多層、コラーゲンコーティングされた足場を作成するためにステッチ使用。 </li></ol> 2.ラット手術プロトコル<ol><li>吸入チャンバーにラットを配置し、2リットル/分の酸素と2％のイソフルランを送達することにより麻酔を誘導する。確認してラットが十分に足を後肢に圧力をかけ、あらゆる応答を評価することにより麻酔している。 </li><li>非滅菌バックテーブルの上には、皮下に25mg / kgのアンピシリン及び0.03 mg / kgをブプレノルフィンを注入する。 </li><li>目に眼軟膏を適用します。手術後肢から毛皮をクリップし、3クロルヘキシジンの交互のスクラブと70％エタノールで手術部位を分取</li><li>低体温症を防ぐために加熱されたパッドの上に、手術台にラットを転送します。セキュアなノーズコーン、および2リットル/分の酸素の2％イソフルランで手続きを麻酔を維持は、ノーズコーンを提供しました。露出された作動肢を残して、無菌状態でドレープ。 </li><li&gt;手術を開始する前に、最初の足圧を後肢への応答の欠如によって十分な麻酔を確認。 </li><li>膝蓋骨のレベルを中心と膝に2cmの長さの垂直切開内側を、確認します。切開が膝の上にセンタリングされるまで横方向に皮膚を撤回。 </li><li>ちょうど膝蓋骨に外側から内側に切断し、大腿四頭筋の筋腱接合部のレベルに遠位脛骨結節に膝蓋腱挿入のレベルに近位に拡張することで、内側傍関節切開を作るためにメスを使用してください。膝蓋骨や大腿四頭筋の腱をカットしないように注意してください。 </li><li>膝蓋腱のすぐ横膝カプセルを通じて1センチメートル垂直切開することにより横方向にリリース膝蓋骨。 </li><li>膝が延長されることを確認してください。細かいハサミを取り、横方向から内側に膝蓋骨の下を通過。伸筋機構はどちらの側に変換することができるようにハサミを数回を広げた。 </li><li>トンを曲げながら彼の膝、膝関節の内部を露出させるために横方向に膝蓋骨を翻訳。顆間ノッチと大腿骨顆の明確な可視化を確認してください。メスを用いて、ノッチにACLとPCLを横断する。 </li><li> 1.6ミリメートルのKワイヤと負荷電力ドリル。顆間でACL原点にKワイヤ先端を置きます。 superolaterallyドリルとメスで、必要に応じて、任意の軟組織を除去し、大腿骨の外側面に出口点を視覚化。移植のための明確なの通路を確保するために数回内外Kワイヤを渡します。 </li><li>脛骨プラトー上のACLフットプリント上のKワイヤを配置します。前外側ドリルと前外側脛骨近位端上の出口点を視覚化。 Kワイヤが脛骨を出るポイントが完全に可視化されるように、必要に応じて、軟組織をクリアするためにメスを使用してください。 </li><li>大腿骨のトンネルを通って（理想的にはこれ以上の2よりインチ長）を短縮キース針を渡します。 Kの目を通して移植片の一端から二縫合糸末端を通すeith針。大腿骨トンネルを通じて移植片の一端を引っ張って針を使用してください。 </li><li>脛骨トンネルを通って移植片のもう一方の端を渡す前に、手順を繰り返します。 </li><li> 8の字ステッチで骨膜またはその他の周囲の軟組織への移植片の大腿骨の端を固定する4-0ビクリル縫合糸を使用してください。手動張力拡張子で膝移植片。 8の字ステッチで骨膜またはその他の周囲の軟組織への移植片の脛骨の端を固定します。 </li><li> 8の字ステッチ過去両端に1〜2ミリメートルを残して、両端の余分な移植片を切断するはさみを使用してください。 </li><li>膝を拡張し、膝蓋骨を減らす。 4-0ビクリルを使用して、膝蓋骨の横方向の亜脱臼を防止、内側関節包を閉じるには、シングル8の字ステッチを配置。 </li><li>下の筋肉を縫合や皮膚がクローズされると、目に見える縫合糸を持ってさせないように注意しながら、実行中の表皮下5-0モノクリルまたはビクリル縫合糸で皮膚を閉じます。 </li><li>麟蹄皮下にブプレノルフィンとCTラット術後3日間の合計ごとに12時間。注入時の任意の排水や縫合不全のために手術部位を確認してください。跛行といくつかの腫れ、手術後の最初の数日で正常であるが、速やかに獣医スタッフと一緒にすべての術後の懸念に対処する。外科的切開が完全に治癒したとき動物は、術後2週間後に社会住宅に戻ることができる。 </li></ol> 3.データ収集プロトコル<ol><li>屠殺時に、開胸続いクローズCO 2チャンバー内で個別にラットを窒息させる。 </li><li>股関節で分離することにより、外科的に再構築され、反対側の手足の両方を収穫。 <ol><li>再構成された手足のために、外科的に後十字靭帯および残骸を含むすべての軟組織を除去するだけで、大腿骨、脛骨、および移植片を分離するために微細な切開により、天然のACLを破壊した。 </li> &lt;李は&gt;対側肢の場合は、ネイティブACLだけでなく、細かい解剖による大腿骨と脛骨を除くすべての軟組織を取り除く。 </li><li>大腿骨 - グラフト - 脛骨複合体の各端部から骨から1cmに¾が、すべてを削除するには、そのようなドレメルなどの回転工具を使用してください。 </li><li>このプロセスの間、および生体力学的試験を通して、定期的かつ頻繁には誤った結果を変更することが収穫膝の乾燥を防ぐために、生理食塩水で靱帯領域をスプレー。 </li></ol></li><li>組織学的分析のために、48時間、25℃で4％パラホルムアルデヒド溶液中で個別に膝を固定する。次に、完全な脱灰用Immunocal試薬の溶液中で膝を沈める。このプロセスは、サンプルの石灰の内容に依存しており、5日ほどかかる場合があります。サンプルの品質を下げることができ、不完全な脱灰などの進捗状況を評価するために毎日の個々のサンプルを確認してください。切片を実行、完了したら、必要に応じて取り付け、及び染色スライドさせます。 </li><li> Perfor組織工学靱帯の機能的能力を評価するための生体力学的試験をメートル。 <ol><li>個別に各骨の骨端の周りに28 G亜鉛めっき鋼線を包むことにより、大腿骨と脛骨を固定します。これは骨ではなく、興味のある靭帯でサンプルの早期引張障害から不正確な生体力学的試験データを防ぐためです。 </li><li>ポットメタクリレート（PMMA）骨セメントの混合物中に大腿骨。これを行うには、2セメント成分を混合し、すぐに完全に自由に突出した骨端及び添付靱帯との接合鍋に骨の骨幹を包む、金属中に大腿骨を固定するために、粘性混合物を使用しています。徐々に締まりのない物質に、最終的には、固体硬化マトリックス中に混合粘性のコンポーネントを変換するための自​​発的なフリーラジカル重合を許可します。 注：このプロセスは数分かかり、手作業で作らボーラスの温度を評価することによってモニターすることができる残りのセメント。温度は一過発熱重合反応の間に増加し、材料が固化した後、室温に治まる必要があります。 </li><li>理想的な機械的試験のために20°屈曲時に膝の靭帯を維持しながら除き、脛骨を接合するため、上記と同じプロセスを繰り返します。 </li><li>引張試験装置の上に接合、大腿骨 - グラフト - 脛骨複合体をマウントして、障害に張力の開始からの時間の関数としての負荷及び変位を記録するために準備する。この例では、1 kNのロードセルをインストロンモデル5564を使用した。 </li><li>プリテンションが0.5N /分のランプ速度にて2 Nに移植した後は、0.5mm /秒の歪速度での故障までの移植片をテスト。プロセスの間、靱帯半ば物質で失敗していることと、骨の大腿骨と脛骨が安全であることと早まって不正確にテストさ靱帯の生体力学的特性を評価することができるもの、失敗しないことを確認してください。 </li><li>生成された荷重 - 変位を使用してください試験された靱帯の破壊荷重および剛性を計算する曲線。 </li></ol></li></ol>

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ACL損傷は現時点での再構築のための限られた選択肢で、整形外科スポーツ手術に共通する条件である。 インビボでの再生を可能にするACLのための適切な組織工学代替を開発するために、適切な動物モデルが必要である。無胸腺ラットにACL再建の再現可能なモデルを使用して、in vivoでの移植のように、本 ​​研究では、生分解性の操作された移植片の製造は、記載されている。このモデルは、細胞の移植片との法人成長因子を有するものを含む種々の生体材料からなる別の組織工学的ACL移植片を評価するために利用することができる。 この特定の研究では、無細胞、整列した繊維とエレクトロポリカプロラクトン移植片をテストしました。組織工学靱帯再建の以前の研究では、編組または絹を含む様々な材料で作られた押出成形移植片、PLLA、およびポリウレタン27-29に移植している。これらの物質はいずれも、ACL 7の機械的性質のグラフトと要約統合の成功の両方をもたらしていない。多くのポリマーは、靭帯再建に使用するための可能性...

前十字靱帯（ACL）の破裂は、膝1の最も一般的な靱帯損傷の一つである。破裂したACLのは、外科的介入なしに治癒することができませんので、日常生活だけでなく、スポーツへの参加の活動には限界が毎年10億ドル3の推定コストで、毎年2手術を受けるために175000以上の患者をドライブ。現在、自家移植または同種移植腱のいずれかが靭帯再建のために使用されている。高い成功率は、自家移植および同種移植の交換の両方を達成することができるものの、深刻な合併症は、これらの再構成オプション4に関連している。自家移植片組織は、特に再破裂またはマルチ靭帯損傷の事例では、ドナー部位の病的状態と関連しており、供給が限られている。一方、同種移植組織は、遅延移植片統合、有害な炎症反応、理論的な感染のリスク、および限られたサップとリンクされているLY 5。合成非分解性移植片は、1970年代と1980年代に開発されたが、時期尚早グラフト破裂、異物反応、骨溶解、及び滑膜炎6によって妨げられた。これらの深刻な懸念の結果として、米国での臨床使用のために利用可能な合成移植片はまだありません。 原因既存の移植オプションと、生物学、工学、再生医療における最近の進展にこれらの制限のために、ACL移植のための組織工学的ソリューションに大きな関心が集まっている。現在の組織工学戦略が永久合成材料注入7に関連する制限を回避しながら宿主組織の内部成長を可能にするために、生物分解性合成材料を用いる。 ポリカプロラクトン（PCL）は、FDAがuのあった8ドレッシング癒着バリア、創傷などの医療用途の数、のために承認された生分解性ポリマーである血管、骨、軟骨、神経、皮膚、食道組織工学5,9-16を含む多種多様な用途でのsed。良好な生体適合性、比較的長い生体内半減期は、十分な機械的強度、高弾性、組織工学におけるこのポリマーの普及に貢献する。創傷治癒のげっ歯類モデルにおいて、移植エレクトロスピンPCLは、非免疫原性であること、および副作用13ずに局所組織に統合することが示された。エレクトロPCLのSEM像を図1に示されている。 現在のFDAの規制基準では、小規模および大規模の両方の動物モデルにおける有効性と安全性は、PCLまたは米国での臨床試験に移行するために、他の設計のACL移植のために必要とされるであろう。さらに、in vivoでの条件は、多くの場合、in vitroでの組織工学のACLグラフトのプロパティを増大させることができます。屈筋digitorと自家ACL再建のラットモデルumの伸筋腱が以前ネイティブACLが切断された、説明したが、大腿骨と脛骨のトンネルを掘削し、移植片は、縫合糸17〜22との代わりに渡され、固定した。本稿では、設計のACL置換の評価のためではなく、自家ベースの復興のために、このモデルの修正（ 図2）を説明します。 多くの動物モデルは、靱帯組織工学のために存在するが、ラットは、多くの理由のために、より大きなモデルに比べて有利である。これらの利点は、より簡単に飼育と取り扱い、より少ない倫理的配慮、そして低コスト17,23が含まれています。また、ラットモデルは、軟骨、腱、および骨組織工学24を含む整形外科組織再生のためのモデルとして広く使用されている。具体的には、無胸腺ヌードラットを最終的な移植oを可能にする、細胞媒介性免疫応答25の欠如に起因して選択したこのモデルにおけるfの異種ドナー細胞は、さらに、将来的に操作された移植片を強化する。このメソッドの論文では、ACL再建の無胸腺ラットモデルにおける製造および無細胞の外科的移植、生分解性ポリマーのグラフトを記述する。

<table><tbody><tr><td>医療グレードのエステル末端ポリ(&amp;epsilon;-カプロラクトン）、顆粒状（分子量 = 110,000）</td><td><a href="http://www.absorbables.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lactel吸収性ポリマー</a></td><td></td><td>目的の分子量に合わせてカスタム合成されたポリマー</td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>105228</td><td>PCLポリマー用溶媒</td></tr><tr><td>18G x 1&amp;#189;ベベル針</td><td>BD Medical</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>遠隔注入・回収プログラム可能シリンジポンプ</td><td>Harvard Apparatus</td><td>702101</td><td></td></tr><tr><td>VersaLaser VLS2.30 レーザー彫刻機</td><td>Microgeo USA</td><td>VLS2.30</td><td></td></tr><tr><td>拡張型プラズマクリーナー 115&amp;nbsp;V</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td>表面修飾のためのコラーゲンコーティング直前のプラズマエッチング</td></tr><tr><td>PureCol コラーゲン標準溶液、3&amp;nbsp;mg/ml</td><td>高度バイオマトリックス</td><td>5015-A</td><td>PureCol、10x PBS、0.1 M NaClを8:1:2.5の比率で混合する。&amp;nbsp;1x PBS中N NaOH (1:9)</td></tr><tr><td>縫合糸、5-0 Vicryl</td><td>Henry Schein</td><td>1086471</td><td></td></tr><tr><td>縫合糸、4-0 Vicryl</td><td>Henry Schein</td><td>6540072</td><td></td></tr><tr><td>鋭視解剖鋏（直線型; 4.5インチ）&amp;nbsp;インチ)</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>塩酸ブプレノルフィン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B9275</td><td>疼痛管理のため、術中および術後の両方で0.03 mg/kgを使用してください。</td></tr><tr><td>アンピシリン注射液</td><td>Henry Schein</td><td>1185678</td><td>処置中に25 mg/kgを皮下投与します。</td></tr><tr><td>K-ワイヤー、1.6 mm</td><td>Spectrum Surgical</td><td>SI040062</td><td></td></tr><tr><td>キース針、ストレート 1&amp;#189;"</td><td>Delasco皮膚科学研究室 &amp;amp; 供給</td><td>KE-112</td><td></td></tr><tr><td>Immunocal 脱灰液</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9491030</td><td></td></tr><tr><td>Opticrylアクリル樹脂骨セメント（PMMA）（モノマーおよびポリマー）</td><td>US Dental Depot</td><td>OPTICRYL 100410&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Instron Model 5564 引張試験機</td><td>Instron</td><td>5564</td><td>同等の性能を持つ任意の引張試験機が使用可能です。</td></tr></tbody></table>

エンジニアード前十字靭帯移植片の評価のための無胸腺ラットモデル

Athymic Rat Model for Evaluation of Engineered Anterior Cruciate Ligament Grafts

前十字靭帯(ACL)の断裂は一般的な靭帯損傷であり、ACLは介入なしではうまく治癒しないため、しばしば手術が必要になります。 現在の治療戦略には、自家移植片または同種移植片のいずれかによる靭帯再建が含まれますが、それぞれに限界があります。したがって、ACL再建に使用するための組織工学グラフトの設計に関心があります。ACL組織工学で使用するためのエレクトロスピニングポリマーグラフトの作製について説明します。このポリカプロラクトングラフトは、生体適合性、生分解性、多孔質であり、整列した繊維で構成されています。このような移植片の評価には動物モデルが必要であるため、この論文では、異種細胞を播種した移植片を含む人工移植片の評価に使用できるACL再構成の関節内胸腺ラットモデルについて説明します。術後 16 週間での代表的な組織学および生体力学的検査結果が示され、移植片は移植片が移植片を移植片としてすぐに検査し、対側ネイティブ ACL が対照として機能します。本研究は、組織改変されたACL移植片を評価するための再現可能な動物モデルを提供し、ACL破裂の治療に対する再生医療アプローチの可能性を示しています。

シングル外科医による92ラットの手術の我々の経験では、切開から傷の完了までの平均手術時間は4.7分の標準偏差は、16.9分であった。屠殺時に、ラットは356±23グラムの重さであった。すべてのラットはよく手術を許容し、合併症を経験していない。すぐに手術後、ラットを手術四肢に体重を支えることが認めたが、わずかにぐったりを示した。手術後1週間では、すべてのラットはありませんかなりのぐったりとambulatingた。動物はすべての給餌、排尿、または排便習慣の無い観測された異常に、研究の過程で着実に体重が増加した。臨床的には、肉眼創傷裂開、紅斑、腫脹、滲出液、または排水は術後認められなかった。 前述した92ラット手術は、このメソッドの原稿を目的として、主に行われていなかった。むしろ、様々な操作された移植片の状態を試験するために使用した。 detaileながらD機械的試験および組織学的結果は、本論文の範囲外で、より多くの詳細はレオンら 26の論文に記載されています。簡潔には、再構成に続く16週目に、区分された膝関節の組織学的分析は、足場マトリクスは、主...

動物モデルは、組織改変された移植片を評価するための重要なツールです。この論文では、前十字靭帯組織工学で使用するためのエレクトロスピニング生分解性ポリマーグラフトを調製するためのプロトコルと、ラットモデルに移植するための外科的プロトコルを示します。

Anterior cruciate ligament (ACL) rupture is a common ligamentous injury that often requires surgery because the ACL does not heal well without ...

本手順の全体的な目的は、げっ歯類モデルを用いて、前十字靱帯置換用の組織工学的に作製されたグラフトを評価することです。まず生分解性ポリマー足場を作製し、次にその足場をラットの膝に移植することでこれを達成します。16週間後、スキャフォールドから形成された新生靭帯を採取し、組織学的解析に供します。最終的に、コラーゲンの生体力学的強度を試験し、ACL再建に使用するこれらの組織工学的グラフトの品質を評価します。スキャフォールド評価の他の手法に対する本手法の主な利点は、このモデルがスキャフォールドを複雑なin vivo環境にさらす一方で、大型動物モデルよりも費用対効果が高く、扱いやすい点にあります。このモデルは、作製されたスキャホールドが生体内でどのように統合され、新生靭帯を形成するかといった、組織工学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本手法は、新しい治療法や前十字靭帯（ACL）再建術につながる可能性があります。小動物モデルは臨床応用に向けた第一歩であり、本手法を用いて特定のスキャホールドの評価を行うことができます。また、細胞や成長因子を含む他の組織工学的な構築物にも適用可能です。我々は、ニューヨークのHospital for Special SurgeryのScott Rodeo博士らによって採用されている手法を修正し、外科的手技を最適化しました。エレクトロスピンニングおよび外科的な手順は、書面による指示だけでは習得が困難な場合があるため、本手法の視覚的な実演が不可欠です。ポリカプロラクトン・スキャフォールドをエレクトロスピンニングする際は、ポリカプロラクトン溶液の供給口を備えた大型のアクリルボックスを使用します。また、エレクトロスピンニング工程のための独立した真空媒体として機能させるため、化学薬品用ドラフト内に設置した、モーター駆動のコレクティング・マンドレルと電源駆動の真空ポートが必要となります。手順を開始する前に、ボックスを70% ethanolで十分に洗浄し、すべての表面をパラフィルムで覆い、エレクトロスピン製品の品質を損なう可能性のある不純物を除去してください。次にファンをオンにし、調製したばかりのポリカプロラクトンポリマー3 mLを、18ゲージの鈍端針を装着した10 mLシリンジに充填します。気泡を除去した後、溶液が入ったシリンジをプログラム可能なシリンジポンプに固定し、針をアクリルボックスの導入ポートから挿入します。このとき、針の約1/2インチ分がボックスの外に残るようにしてください。続いて、回転する旋盤マンデルを薄いアルミホイルの帯で隙間なく覆い、マンデルをボックス反対側のモーターに固定します。この際、コレクターとして機能させるため、シリンジの針から約15 cm離れた位置に配置してください。最後に、真空ポートにプラスチックホースを挿入します。次に、ホースをドラフトチャンバーの真空源に接続し、電源を入れます。アクリルボックスに蓋をして、プログラム可能なシリンジポンプの注入速度を 2.5 milliliters per hour に設定します。その後、マイナスリードを接地し、モーターの電源を入れてマンドレルを 3,450 RPM で回転させ、ワニ口クリップを使用して電圧源のプラスリードをボックス外の針先に接続します。ポリカプロラクトン溶液の注入が開始されたら、電圧源の電源を入れ、動作電圧を20 kilovoltに設定します。12分間注入すると、0.5 millilitersのポリカプロラクトン溶液から均質なカフが形成されます。電圧源、モーター、真空ポンプ、シリンジポンプを含むすべての装置の電源を切ります。モーターからマンドレルを取り外し、マンドレルからポリマーカフを取り除いて、横方向に1回切断し、長方形の電界紡糸マットを作成します。次に、マットをレーザーカットして複数の小さなシートを形成し、さらにそれらをストリップ状にカットして4層に積み重ね、縫合して手術前の足場材（スキャフォールド）を作成します。まず、後肢への圧迫に対する反応がないことを確認し、十分な麻酔状態であることを確認してください。次に、膝蓋骨の高さに中心を合わせ、膝の内側に2 cmの垂直切開を加え、必要に応じて皮膚を外側に牽引します。続いて、メスを用いて、膝蓋骨のすぐ内側で内側膝蓋傍関節切開を行い、近位側は大腿四頭筋の筋腱移行部の高さまで、遠位側は脛骨粗面への膝蓋腱停止部の高さまで延長します。最後に、膝蓋腱のすぐ外側で関節包に1 cmの垂直切開を加え、膝蓋骨を外側に脱臼させます。次に、膝が伸展していることを確認し、膝蓋骨の下に細い剪刀を外側から内側へ通します。その後、剪刀を数回開閉し、膝を屈曲させた際に伸展機構を左右どちら側にも移動できるようにします。膝蓋骨を外側に移動させて膝関節内部を露出し、顆間切痕と大腿骨顆が明確に視認できることを確認してください。その後、切痕内のACLおよびPCLを切断します。次に、電動ドリルに取り付けた1.6 millimeterのKワイヤーの先端を、顆間切痕にあるACL起始部に配置し、助手が膝を固定している間に外上方に向けて穿孔します。その後、グラフトの通過を確実にするため、Kワイヤーを数回出し入れしてください。大腿骨の外側にある出口を確認し、必要に応じてメスで軟部組織を除去します。トンネルが確保されたら、助手に膝を固定してもらいながら、K-wireを脛骨プラトー上のACLフットプリントに配置し、外側に向かって穿孔します。次に、メスを使用して必要に応じて軟部組織を除去し、脛骨前外側近位部の出口点を確認して、K-wireが脛骨から出る位置を完全に可視化します。その後、長さ2インチ以下の短くしたKeith針を大腿骨トンネルに通します。続いて、グラフトの一端にある2本の縫合糸の端を針穴に通し、その針を用いてグラフトの一端を大腿骨トンネル経由で牽引します。次に、4-0 Vicryl縫合糸を用いて、針でグラフトのもう一方の端を脛骨トンネルに通します。続いて、膝を伸展させてグラフトに手動でテンションをかけながら、グラフトの大腿端を周囲の軟部組織に8の字縫合で固定します。同様に、もう一つの8の字縫合を用いてグラフトの脛骨端を周囲の軟部組織に固定し、はさみで両端の余分なグラフトを切り落とします。この際、縫合糸から各端に1〜2 mmの余裕を残します。最後に膝を伸展させ、パテラ（膝蓋骨）を整復します。次に、4-0 Vicryl縫合糸を用いて、内側関節包を閉鎖するためのシングルフィギュアエイトステッチ（8の字縫合）を1針行い、パテラの外側亜脱臼を防止し、皮下走行5-0 MonocrylまたはVicryl縫合糸で皮膚を縫合します。再建から16週後の膝関節切片の組織学的解析では、スキャフォールドマトリックスに線維芽細胞が広範囲に浸潤し、好酸性のコラーゲンを分泌して骨トンネルとうまく統合していることが示されます。本実験では、屠殺直後に関節の生体力学的特性を評価しました。試験したすべてのサンプルは、引張試験によって作成された低変位曲線を用いて、物質の中間部で破断しました。各群について、破断荷重と剛性を算出しました。移植から16週間後において、電紡ポリマーグラフトは移植直後にテストしたグラフトのピーク荷重および剛性が約2倍になっていました。これらの値は依然として天然のACLよりも低いものでした。習熟すれば、動物手術は約15分で完了できます。この処置を行う際は、外部から縫合糸が見えないように適切に閉鎖することが重要です。この手順に続き、追加の染色や生化学的アッセイなどの他のエンドポイント解析を行うことができます。この手法は、組織工学分野の研究者がACL再建術に向けた複数のグラフトの選択肢を評価する道を開きました。このビデオを視聴することで、前十字靭帯（ACL）再建の齧歯類モデルに移植するためのポリマースキャフォールドを作製する方法について、十分に理解できるはずです。生体動物を用いた操作は危険を伴う可能性があるため、本手順の実施中は、獣医師の推奨事項の遵守や個人用保護具の着用などの予防策を常に講じることを忘れないでください。

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JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

準備とラットの両側膝蓋腱欠損モデル臍帯マトリックス由来間葉系幹細胞スフェロイドの評価について述べる。このモデルは、未処理と処理の腱との間の違いを検出する発見だったし、2...

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外科用回収、単離と<em&gt;インビトロ</em&gt;組織工学アプリケーションのためのヒト前十字靭帯由来細胞の拡大

学ぶ 組織工学用の生分解性ポリマースキャフォールド製造とラット膝への移植手術。16週間後の組織学的・生物力学的評価により、前十字靭帯再建における移植片の品質と有効性を検証する方法です。

エンジニアード前十字靭帯移植片の評価のための無胸腺ラットモデル

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