エンジニアード前十字靭帯移植片の評価のための無胸腺ラットモデル

本手順の全体的な目的は、げっ歯類モデルを用いて、前十字靱帯置換用の組織工学的に作製されたグラフトを評価することです。まず生分解性ポリマー足場を作製し、次にその足場をラットの膝に移植することでこれを達成します。

16週間後、スキャフォールドから形成された新生靭帯を採取し、組織学的解析に供します。最終的に、コラーゲンの生体力学的強度を試験し、ACL再建に使用するこれらの組織工学的グラフトの品質を評価します。スキャフォールド評価の他の手法に対する本手法の主な利点は、このモデルがスキャフォールドを複雑なin vivo環境にさらす一方で、大型動物モデルよりも費用対効果が高く、扱いやすい点にあります。

このモデルは、作製されたスキャホールドが生体内でどのように統合され、新生靭帯を形成するかといった、組織工学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。本手法は、新しい治療法や前十字靭帯（ACL）再建術につながる可能性があります。小動物モデルは臨床応用に向けた第一歩であり、本手法を用いて特定のスキャホールドの評価を行うことができます。

また、細胞や成長因子を含む他の組織工学的な構築物にも適用可能です。我々は、ニューヨークのHospital for Special SurgeryのScott Rodeo博士らによって採用されている手法を修正し、外科的手技を最適化しました。エレクトロスピンニングおよび外科的な手順は、書面による指示だけでは習得が困難な場合があるため、本手法の視覚的な実演が不可欠です。

ポリカプロラクトン・スキャフォールドをエレクトロスピンニングする際は、ポリカプロラクトン溶液の供給口を備えた大型のアクリルボックスを使用します。また、エレクトロスピンニング工程のための独立した真空媒体として機能させるため、化学薬品用ドラフト内に設置した、モーター駆動のコレクティング・マンドレルと電源駆動の真空ポートが必要となります。手順を開始する前に、ボックスを70% ethanolで十分に洗浄し、すべての表面をパラフィルムで覆い、エレクトロスピン製品の品質を損なう可能性のある不純物を除去してください。

次にファンをオンにし、調製したばかりのポリカプロラクトンポリマー3 mLを、18ゲージの鈍端針を装着した10 mLシリンジに充填します。気泡を除去した後、溶液が入ったシリンジをプログラム可能なシリンジポンプに固定し、針をアクリルボックスの導入ポートから挿入します。このとき、針の約1/2インチ分がボックスの外に残るようにしてください。続いて、回転する旋盤マンデルを薄いアルミホイルの帯で隙間なく覆い、マンデルをボックス反対側のモーターに固定します。この際、コレクターとして機能させるため、シリンジの針から約15 cm離れた位置に配置してください。最後に、真空ポートにプラスチックホースを挿入します。

次に、ホースをドラフトチャンバーの真空源に接続し、電源を入れます。アクリルボックスに蓋をして、プログラム可能なシリンジポンプの注入速度を 2.5 milliliters per hour に設定します。その後、マイナスリードを接地し、モーターの電源を入れてマンドレルを 3,450 RPM で回転させ、ワニ口クリップを使用して電圧源のプラスリードをボックス外の針先に接続します。

ポリカプロラクトン溶液の注入が開始されたら、電圧源の電源を入れ、動作電圧を20 kilovoltに設定します。12分間注入すると、0.5 millilitersのポリカプロラクトン溶液から均質なカフが形成されます。電圧源、モーター、真空ポンプ、シリンジポンプを含むすべての装置の電源を切ります。

モーターからマンドレルを取り外し、マンドレルからポリマーカフを取り除いて、横方向に1回切断し、長方形の電界紡糸マットを作成します。次に、マットをレーザーカットして複数の小さなシートを形成し、さらにそれらをストリップ状にカットして4層に積み重ね、縫合して手術前の足場材（スキャフォールド）を作成します。まず、後肢への圧迫に対する反応がないことを確認し、十分な麻酔状態であることを確認してください。

次に、膝蓋骨の高さに中心を合わせ、膝の内側に2 cmの垂直切開を加え、必要に応じて皮膚を外側に牽引します。続いて、メスを用いて、膝蓋骨のすぐ内側で内側膝蓋傍関節切開を行い、近位側は大腿四頭筋の筋腱移行部の高さまで、遠位側は脛骨粗面への膝蓋腱停止部の高さまで延長します。最後に、膝蓋腱のすぐ外側で関節包に1 cmの垂直切開を加え、膝蓋骨を外側に脱臼させます。

次に、膝が伸展していることを確認し、膝蓋骨の下に細い剪刀を外側から内側へ通します。その後、剪刀を数回開閉し、膝を屈曲させた際に伸展機構を左右どちら側にも移動できるようにします。膝蓋骨を外側に移動させて膝関節内部を露出し、顆間切痕と大腿骨顆が明確に視認できることを確認してください。その後、切痕内のACLおよびPCLを切断します。

次に、電動ドリルに取り付けた1.6 millimeterのKワイヤーの先端を、顆間切痕にあるACL起始部に配置し、助手が膝を固定している間に外上方に向けて穿孔します。その後、グラフトの通過を確実にするため、Kワイヤーを数回出し入れしてください。大腿骨の外側にある出口を確認し、必要に応じてメスで軟部組織を除去します。

トンネルが確保されたら、助手に膝を固定してもらいながら、K-wireを脛骨プラトー上のACLフットプリントに配置し、外側に向かって穿孔します。次に、メスを使用して必要に応じて軟部組織を除去し、脛骨前外側近位部の出口点を確認して、K-wireが脛骨から出る位置を完全に可視化します。その後、長さ2インチ以下の短くしたKeith針を大腿骨トンネルに通します。続いて、グラフトの一端にある2本の縫合糸の端を針穴に通し、その針を用いてグラフトの一端を大腿骨トンネル経由で牽引します。

次に、4-0 Vicryl縫合糸を用いて、針でグラフトのもう一方の端を脛骨トンネルに通します。続いて、膝を伸展させてグラフトに手動でテンションをかけながら、グラフトの大腿端を周囲の軟部組織に8の字縫合で固定します。同様に、もう一つの8の字縫合を用いてグラフトの脛骨端を周囲の軟部組織に固定し、はさみで両端の余分なグラフトを切り落とします。この際、縫合糸から各端に1〜2 mmの余裕を残します。

最後に膝を伸展させ、パテラ（膝蓋骨）を整復します。次に、4-0 Vicryl縫合糸を用いて、内側関節包を閉鎖するためのシングルフィギュアエイトステッチ（8の字縫合）を1針行い、パテラの外側亜脱臼を防止し、皮下走行5-0 MonocrylまたはVicryl縫合糸で皮膚を縫合します。再建から16週後の膝関節切片の組織学的解析では、スキャフォールドマトリックスに線維芽細胞が広範囲に浸潤し、好酸性のコラーゲンを分泌して骨トンネルとうまく統合していることが示されます。

本実験では、屠殺直後に関節の生体力学的特性を評価しました。試験したすべてのサンプルは、引張試験によって作成された低変位曲線を用いて、物質の中間部で破断しました。各群について、破断荷重と剛性を算出しました。

移植から16週間後において、電紡ポリマーグラフトは移植直後にテストしたグラフトのピーク荷重および剛性が約2倍になっていました。これらの値は依然として天然のACLよりも低いものでした。習熟すれば、動物手術は約15分で完了できます。この処置を行う際は、外部から縫合糸が見えないように適切に閉鎖することが重要です。

この手順に続き、追加の染色や生化学的アッセイなどの他のエンドポイント解析を行うことができます。この手法は、組織工学分野の研究者がACL再建術に向けた複数のグラフトの選択肢を評価する道を開きました。このビデオを視聴することで、前十字靭帯（ACL）再建の齧歯類モデルに移植するためのポリマースキャフォールドを作製する方法について、十分に理解できるはずです。

生体動物を用いた操作は危険を伴う可能性があるため、本手順の実施中は、獣医師の推奨事項の遵守や個人用保護具の着用などの予防策を常に講じることを忘れないでください。