同種免疫により誘導される血管拒絶反応および移植動脈硬化症のマウスモデル

この手順の全体的な目的は、マウスにおいて大動脈の端端吻合（end-to-end）による間置移植を行い、血管拒絶反応および移植動脈硬化を研究することです。まず、ドナーマウスから腹大動脈の一節を採取します。次に、その血管片を、ドナーとは遺伝的に異なる同種レシピエントの腎動脈内に正位移植します。

最終ステップでは、移植された血管セグメントを摘出し、移植動脈硬化の発現について解析します。最終的に、内膜の肥厚と管腔の狭窄の測定、および組織内の免疫細胞蓄積に関する免疫組織化学的解析を通じて、移植動脈硬化および免疫介在性同種移植血管拒絶反応の程度を評価することができます。

一般的に、この手技に不慣れな方は、習得までに高度な器用さと練習が必要であるため、マイクロサージャリーの手技に慣れるまで時間を要します。しかし、根気強く練習を重ねれば、ほとんどの研究者が習得できるはずです。そこで、熟練した脳神経外科医であるWinnie氏と、私の研究室の優秀な博士課程学生であるAdam Roso氏による手技のデモンストレーションを行います。まず、ドナーマウスを、滅菌ドレープで包まれた清潔で薄いプレキシガラス製ボードの上に背臥位で置き、手術顕微鏡下で8〜30倍の倍率に設定します。

つま先のピンチテストで十分な外科的麻酔がかかっていることを確認した後、滅菌鋏を用いて、恥骨から剣状突起まで正中線に沿って一回切開します。次に、小型のリトラクターを使用して腹壁を開き、腹腔を露出させます。その後、滅菌綿棒を用いて、腸を動物の左側上方へ優しく避けます。

生理食塩水で湿らせたガーゼで組織を覆い、生殖器を下方へ移動させて腎下大動脈と下大静脈（IVC）を確認します。次に、医療用5番鉗子を用いて、分岐点付近の左腎動脈において大動脈とIVCを分離します。その後、10-0 polyamideモノフィラメント縫合糸を使用して、大動脈付近の細い分枝を結紮します。

ドナーの大動脈と下大静脈（IVC）を分離した後、血管を生理食塩水で飽和させ、露出した空洞を湿らせたガーゼで覆い、ドナーを滅菌エリアに置いておきます。次に、レシピエントのマウスを顕微鏡下に置き、先ほど示したようにレシピエントの大動脈をIVCから分離します。その後、目的のセグメントの近位側と遠位側に、約5 mmの間隔をあけて2つの4 mmマイクロバスキュラークランプを装着します。

次に、血管用マイクロ剪刀を用いて、腹大動脈に水平方向の切開を1か所加え、ドナーの大動脈グラフトを適合させるため、腹大動脈を0.5 mm以下切除します。ドナーを顕微鏡に戻し、先ほど示したように3〜4 mmのグラフトセグメントを切断します。その後、25ゲージの5/8インチ針を用いて、切除した大動脈をヘパリン生理食塩水でフラッシングします。

針先が血管に触れないように注意しながら、血管をヘパリン生理食塩水を入れた氷上の容器に置きます。切除から30分以内に、ドナーの大動脈グラフトをレシピエントの正位に配置し、グラフトの解剖学的方向をレシピエントのものと一致させます。次に、血管の外膜をそっと掴み、5番鉗子を用いてわずかにずらします。

次に、ピンセットを使用して、10-0ポリアミドモノフィラメント縫合糸が付いた針を血管壁の全層に刺し、ドナー大動脈グラフトをレシピエントの切除血管に固定して、連続縫合を行えるようにします。グラフトの上端と下端の両方の9時方向にステイサチュア（保持縫合）を配置します。その後、グラフトの上端の3時方向から吻合を開始します。

切除端を2本の連続縫合で縫合し、縫合糸をステイサチュアーに固定します。次に、グラフトを反転させ、血管の背側に向かって連続縫合を続けます。起点で合わせます。

縫合を維持します。血管に強い圧力をかけないように注意して縫合糸を固定し、下側の吻合についても同様に縫合を繰り返します。吻合が完了したら。

遠位側の微小血管クランプを外し、血管内に逆行性の血流を流します。出血が見られない場合は、近位側のクランプを外します。血流の遮断が認められないことを確認後、ピンセットで牽引縫合糸の一端をそっと掴み、血管を軽くずらして血管後壁を検査します。

ドナー側とレシピエント側の両方の血管に強い拍動が認められ、しわ寄せ（puckering）が見られないことを確認した後、綿棒を用いて腸管を腹腔内に戻します。最後に、持針器とグロフ鉗子を使用し、5-0ポリプロピレン縫合糸を用いて腹壁を連続縫合で閉じます。皮下縫合を行い、同じ縫合糸で皮膚層を閉じます。

手術の成否を評価するために、後肢の運動機能を観察します。移植後30日目に、移植された大動脈セグメントにおける内膜の肥厚と管腔の狭窄を定量化し、免疫介在性の同種移植血管損傷の程度を調べます。

実際に観察された通り、同種移植動脈セグメントでは顕著な内膜肥厚と管腔閉塞が認められますが、ISOグラフト対照動脈セグメントでは変化が見られません。さらに、同種移植動脈への白血球の動員は、免疫組織化学染色によりCD4およびCD8陽性T細胞およびマクロファージの集積を調べることで評価できます。予想通り、移植後のドナー動脈組織の内膜内にこれら3種類すべての免疫細胞が検出されました。

この技術により、輸送分野の研究者が同種免疫介在性の血管減少および移植動脈硬化を探索する道が開かれました。