ラットヘッドBranchiomeric筋肉から衛星細胞の単離とキャラクタリゼーション

この手順の全体的な目的は、第1、第2、および第4鰓弓に由来する代表的な筋肉からサテライト細胞を単離し、細胞外マトリックスのゲルスポット上で培養することです。これはまず、若年成体ラットの咬筋、顎二腹筋、および口蓋帆挙筋を摘出することで達成されます。

第2段階では、酵素消化とその処理時間により、各筋肉サンプルからサテライト細胞を単離します。その後、これらの細胞を細胞外マトリックスゲル上で培養します。最終的に、目的の筋肉マーカーで染色を行うことで、サテライト細胞培養における筋形成のダイナミックな状態を追跡することができます。

口唇口蓋裂は、ヒトにおいて最も一般的な頭蓋顔面奇形の一つです。裂隙がある場合、欠損部位を閉鎖し、正常な言語発達を可能にするために外科的な修復術が必要です。しかし、線維化や不十分な筋肉再生が、軟口蓋筋の機能回復を妨げることがあります。口蓋裂修復術後において、わずかミリメートルサイズの細胞外マトリックスゲルスポットコーティングを用いた、新鮮に分離したサテライト細胞の培養に関する革新的な手法を実演します。

これにより、拡張の必要性がなくなります。単離の1日前に、8ウェルチャンバースライドを100 mmペトリ皿に入れ、皿を冷却面に置きます。10分後、充填済みマイクロピペットを使用して、各ウェルに10 µLの細胞外マトリックスゲルを1滴ずつ分注します。

スライドをさらに7分間冷却した後、残っているゲルを完全に除去し、ウェルを37 degrees Celsiusで一晩乾燥させます。咬筋を解剖するために、9週齢のラットの頭部から皮膚を取り除き、皮下注射針を用いて頭部を側方に固定します。シリコンパッド上で耳下腺と顔面神経を分離し、腺を除去します。

次に、15番のメスを用いて、顔面神経を慎重に除去します。咬筋の浅頭を確認してください。次に、ストレート鑷子を用いて腱を頬骨突起の起始部から分離し、続いて解剖用鋏で腱を慎重に切断します。

メスを用いて、下顎骨下顎枝の角および外側面の後半部への停止部まで、咬筋の浅層を剥離します。顎二腹筋後腹を剥離するために、針を用いて頭部を仰向けに固定し、舌下腺および顎下腺の上の皮下脂肪を除去します。顎二腹筋の前腹と後腹を露出し、次に後腹の前方腱をストレート鉗子で保持しながら、鼓室への起始部まで慎重に腱を切り込み、剥離します。

levator veli palatini muscleを剥離するために、stylohyoid muscleを特定します。これを外側に牽引し、慎重に筋肉組織を除去します。次に、tympanic bullaに停止しているlevator veli palatiniの腱を特定し、慎重に剥離します。

次に、気管の後方から食道を持ち上げます。軟口蓋のlevator veli palatiniが挿入されている部位を特定し、この筋肉を切断して切り離します。その後、筋肉を70% ethanolに浸し、抗生物質を添加した氷冷PBSに転移させます。

サテライト細胞を単離するために、各筋肉を6ウェルプレートの個別のウェルに移動させ、組織を2 mmの小さな断片に切断します。この際、筋肉を細かく刻みすぎないように注意してください。次に、組織片を1ウェルあたり2.5 mLの0.1% pronase溶液に入れ、37 °Cで60分間インキュベートします。その間、20分ごとに緩やかに振盪させてください。

ファイバー束が緩んだ様子を示したら、各ウェルに馬血清と抗生物質を添加したDMEM 2.5 millilitersを加え、消化した組織を個別の15 milliliterコニカルチューブに移します。組織のスラリーを遠心分離し、上清をデカンテーションで除きます。その後、各チューブに5 millilitersの培地を加え、10 milliliterプラスチックピペットで組織をホモジナイズします。

組織を再度遠心分離し、上清を新しい15 milliliterコニカルチューブに移します。次に、チューブにさらに5 milliliterの培地を加え、断片がピペットで容易に通過するまで組織片を再度トリチュレートします。もう一度遠心分離した後、上清を対応する適切なチューブに回収し、細胞懸濁液を40 micrometerストレーナーでろ過して、個別の50 milliliterチューブに回収します。

細胞回収率を最大限にするため、ストレーナーを1 mLのDMEMで洗浄します。次に、細胞を遠心分離して回収し、ペレットを新鮮な培地で再懸濁させ、細胞数をカウントして単離したサテライト細胞を培養します。その後、細胞懸濁液を培養液10 µLあたり1.5×10³個になるように希釈します。

次に、あらかじめ準備した各細胞外マトリックスゲルスポットに10 µLの細胞を添加し、37 °Cで6時間インキュベートします。各ゲルスポットに400 µLの培地を慎重に添加し、スライドをインキュベーターに戻します。3日後、分離直後に適切な分化誘導培地を添加し、細胞の分化を開始させます。

freshly isolated satellite cells の 90% 以上が pax7 を発現しています。4日目までに、すべての筋肉群から得られた satellite cells で pax7 と MyoD が発現します。7日目には、すべての筋肉群で My OG が高度に発現します。細胞外マトリックスゲルスポットに播種して4日後、増殖した細胞が融合し始めて小さな多核 myotubes を形成し、これらは7日目と10日目に myosin heavy chain を発現します。

10日目までに、長く、よく整理された筋管が認められます。また、筋管の収縮（トゥイッチング）も観察できます。本プロトコルにより、口蓋帆頭筋由来のサテライト細胞の研究が可能となり、口蓋裂患者の治療に向けた新たな可能性が提示されます。