Name: キメラマウスモデルにおける組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、粘膜免疫を研究するために、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 学ぶ 組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与法を、キメラマウスモデルを用いて樹状細胞の動態とCD8陽性T細胞応答を解析する粘膜免疫研究に応用する方法です。

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私たちは、マウス実験の優れた技術サポートを提供してくださったSergio Gómez-Medinaに感謝します。この研究は、ライプニッツ協会とライプニッツ感染センターからの資金提供を受けて行われました。A.L.は、ライプニッツ大学院から博士課程前のフェローシップを受けています。

動物実験は承認されたプロトコルに従って、およびドイツの動物保護法のガイドラインに従って行いました。動物実験を実施するすべてのスタッフは、カテゴリB又は欧州実験動物学連盟のCに応じた研修プログラムに合格しました。 逆遺伝学による組換え弱毒インフルエンザワクチンの1世代注：逆遺伝学による組換えインフルエンザウイルスを生成するための詳細なプロトコールは、以前の研究5によって説明され、本報告書の範囲外であるされています。簡単に言えば、低温適合性インフルエンザワクチンの救出（CAV）はバイオセーフティーレベル2（BSL2）の封じ込め下バイオセーフティクラスIIキャビネットで行われ、以下に詳述する手順が含まれています。トランスフェクションおよび感染プロトコルは、それを次の マルティネス-Sobrido ら 5。 <ol><li>再集合体低温適応性インフルエンザの生成背景として低温適合株A / PR / 8/34（H1N1）株のA /アナーバー/ 60分の6（H2N2）、ならびに赤血球凝集素（HA）および変性ノイラミニダーゼ（NA）を（使用して、ワクチン図1A）。 NA遺伝子における修飾は、ニワトリオボアルブミン（OVA）由来のペプチドSIINFEKL（ 図1B）をコードする短いcDNA配列によるタンパク質の茎（残基65から72）で保存された配列のPCRベースの交換で構成されています。 SIINFEKLペプチドは、C57BL / 6マウス12の応答をI制限H-2B MHCクラスの文脈において非常に免疫優性ペプチドです。 </li><li>プレート1％ペニシリン/ストレプトマイシン（P / E）を補充したDMEM、10％ウシ胎児血清（FBS）を使用して、6ウェルプレート中のウェルあたり10 6個の 293T細胞。 </li><li>プラスミドトランスフェクション混合物を準備します。追加NAをコードするPB2、PB1、PA、NP、M、NSインフルエンザからのA /アナーバー/ 60分の6株についてのcDNAおよびプラスミド1μgのをコードするプラスミドのそれぞれ1μgの-SIINFEKLとインフルエンザA / PR / 8/34からのHA。追加予め温めておいたOptiMEM（100μl/ウェルの最終容量15μL）。 </li><li> RTで30分間トランスフェクション混合物をインキュベートします。 </li><li>ウェル/トランスフェクションミックスの100μLを加え、37℃で16時間、5％CO 2インキュベートします。 </li><li> 5時間、CO 2を 33℃で、DMEM、0.3％BSA、1％のP / Eで細胞培地を変更し、5％。 </li><li> L-1-トシルアミド-2-フェニルエチルクロロメチルケトン（TPCKトリプシン）で処理されたウシ膵臓からのトリプシンを1μg/ mlを含むDMSO中に10 6インフルエンザ許容MDCK細胞を追加します。 33℃で3日間、5％CO 2 - 2のための293T-MDCK共培養を維持します。 </li><li> MDCK-293T細胞の共培養物の上清を収集し、5分間、260×gで遠心分離することによって明らかにされます。 </li><li>無菌状態で10日齢の鶏孵化卵 - 9を接種します。マルティネス-Sobrido らによって示されるようにこれを行うには、卵殻の上部に穴を作る。5。 </li><li>卵殻ウィットをカバーhは綿棒を使用して、ワックスを溶融し、33℃で3日間接種鶏の卵をインキュベートします。 </li><li>感染した孵化卵から尿膜液を収穫：70％エタノールで卵の殻を洗ってください。非常に穏やか上部に亀裂や滅菌ピンセットを使用して尿膜を除去して、卵を開きます。 （ - 10ミリリットル、通常、6）できるだけ多くの流体を収集するために10ミリリットルのピペットを使用してください。 4℃で10分間、260×gで遠心分離し、新しいチューブにクリア尿膜液を移します。 </li></ol> 2.トラッキングワクチン特異的免疫<ol><li>ペプチド担持樹状細胞（DC）のトレース<ol><li>マウスのワクチン接種のために、精密な気化器を使用して、酸素中5％イソフルランでマウスを麻酔。マウスの鼻の穴に直接液滴を介して、SIINFEKLペプチドを発現するワクチンの10 3プラーク形成単位（PFU）を含む50μlのPBSを投与するために200μlのピペットを使用してください。 </li><li>三日後、ワクチン接種、euthanizイソフルラン麻酔を経由して電子マウスは頸椎脱臼が続きます。 </li><li>鉗子でちょうど胸郭の下に正中線にマウスの皮膚を持ち上げ、ハサミで皮膚を通して小さな切開をカット。長さ5cm、各端部から横方向に正中線から、次に、先頭と末尾の両方に向かって皮膚を介して2つの2cmの切開をカット - 切開の観点から、3が作ります。ピールバックスキンは、腹膜および胸腔を明らかにしました。慎重に胸部を露出させるために腹膜を囲む膜を切断。 </li><li>縦隔にアクセスするにはdiafragmaとケージリブの底を切りました。気管の腹側の近くに、腕頭動脈に内側に隣接して、わずかに背側と横方向に胸腺に隣接し、2縦隔リンパ節（mLNs）を検索し、削除します。 </li><li> mLNsを採取するためには、湾曲した鉗子を使用しています。リンパ節の下に鉗子を置き、静かにそれらをプルアップします。 1mlのDMEMを含む6ウェルプレート中のリンパ節を配置し、任意のconnectiを削除VEのか、ノードの周囲の脂肪組織。 <ol><li> 1ミリリットル注射器に取り付けられた2つの26 G針で十分に各サンプルをいじめます。他の針でリンパ節を開いて壊しながらリンパ節をいじめるために、一方の針でそれを押したままにします。これが正しく行われた場合、リンパ節から濃縮された細胞の破裂を容易培地において観察されます。単一細胞懸濁液を得るために、70μmのナイロンフィルターを通してすべての組織材料を渡します。 </li></ol></li><li>冷却遠心機で260×gで10分間遠心操作し、単一細胞懸濁液。赤血球を溶解するために赤血球細胞溶解（RBCL）緩衝液2ml中の細胞ペレットを再懸濁します。溶解は室温で3分間進行させます。 </li><li>氷冷PBSの2ミリリットルで遠心分離し、細胞の再懸濁を介しRBCLバッファを中和します。 </li><li> 100μlの最終容量で10 7細胞/ mlの濃度のU字型96ウェルプレート中のプレートの細胞。 </li><li>フローサイトメトリー分析のために、使用して細胞のFc受容体をブロックします氷上で15分間、10 6個の細胞あたり抗マウスCD16 / CD32抗体1μgの。 </li><li>遠心プレートとプレートフリックにより上清を捨てます。選択の表面抗体の組み合わせで個々のウェルをインキュベートします。典型的には、リンパ節における樹状細胞の検出のために、抗体カクテルが含まれている必要があります0.25抗CD11cのμgの、CD11bの0.25μgの、MHCクラスII0.5μgの、CD1030.25μgのと100の最終容量でCD8αの0.15μgのをμlの。 </li><li>負のゲーティングのために、抗CD3、CD19、NK1.1または系統カクテル（ 図2A）の0.25μgのを追加します。代替ゲーティング戦略だけでなく、複数の蛍光色素の適切な補償のためのプロトコルは、免疫学的ゲノム·プロジェクトのウェブサイトで見つけることができます。選択の表面マーカーに加えて、カクテルにSIINFEKLに結合したH-2K b のに対する抗体の1μgのを追加します。この市販の抗体は、DC私の可視化を可能にしますSIINFEKLペプチドは、MHCクラスIを表面に結合するN </li><li>氷上で30分間、表面抗体で細胞をインキュベートします。光からプレートを保護します。 5分間260×gで遠心分離板及び2mlのPBSで2回洗浄します。分析のためのフローサイトメトリー管を流れるように細胞を転送します。 </li></ol></li><li>ワクチン特異的T細胞の増殖の評価<ol><li>生成されたすべてのCD8 T細胞は、SIINFEKLペプチドに特異的である、市販のTCRトランスジェニックマウス（OT-Iマウス）（C57BL / 6-Tgは（TCR aTcrb）1100Mjb / J）からドナーT細胞を得ます。頸椎脱臼が続くイソフルラン麻酔によりマウスを安楽死させます。腹腔の切開を行うことによって収穫脾臓。 DMEM /脾臓の2mlに脾臓/秒を置き、結合して脂肪組織を除去。 </li><li> 2.1.2および2.1.3に記載の手順に従って、脾臓から単一細胞懸濁液を生成します。 </li><li>さらに、T細胞上の単一細胞懸濁液を富化するために、磁気ビーズ分離プロトコルを適用します正または負の選択手順12を使用して。ドナーT細胞は、CD45.2 12を表現しながら、例のレシピエントマウスは、白血球マーカーCD45.1を発現するためのように、レシピエント細胞からドナーを区別するために、コンジェニックマウスを使用します。 </li><li> T細胞を標識するために、5×10 6細胞/ mlの最適な細胞密度にカルボキシスクシンイミジルエステル（CFSE）の5μMを含む1mlのPBSでそれらをインキュベートします。露光から保護し、37℃で20分間細胞をインキュベートします。インキュベートした後、5分間260×gで遠心細胞、上清を廃棄し、細胞を再懸濁する3ml中のウシ胎児血清（FBS）CFSEを中和します。 </li><li> PBSの十分な容量で10分間再懸濁中260×gで遠心細胞溶液100μlを2×10 6個の細胞を含むように。眼窩洞注入13を介して2×10 6細胞/マウスと受信者のコンジェニックマウスを注入。 </li><li>日3,4,5後にレシピエントマウスを安楽死させます頸椎脱臼が続くイソフルラン麻酔を使用して、ワクチン接種。縦隔リンパ節を採取し、2.1.2-2.1.5に示されるように、フローサイトメトリーのための単一細胞懸濁液を調製します。 </li><li>を含む抗体カクテル100μl中の単一細胞懸濁液の染色によってドナー細胞を特定します。抗マウスCD3、CD4とCD8抗体0.25μgのを。抗マウスCD45.1またはCD45.2抗体（ドナー細胞の表現型に依存する）の0.5μgの。 CFSE 12（ 図2B）の希釈プロファイルを決定するためにオープン（FITC）フローサイトメーターのFL-1チャネルのままにしておきます。 </li></ol></li></ol>遺伝子特異的ワクチンの応答を分析する3。キメラマウス注記：DTRベースのマウスモデルを使用して、競争力のある骨髄キメラの生成は、ワクチンに対する免疫応答の間の細胞特異的な機能の識別を可能にします。ここでは、DTRを発現するドナーCの追加の戦略によって組み合わせを表示します特定の細胞区画における免疫間の遺伝子の特定の機能を研究するためのノックアウトマウスが許すから細胞とells。例では、ランゲリン+ CD103 + DCにおけるToll様受容体3（TLR3）の特定の欠失を有するマウスを作製します。 <ol><li>骨髄ドナー細胞の調製<ol><li>バイオセーフティーレベルIIキャビネットの下で働きます。排他的にオートクレーブ処理機器を使用して、汚染を避けます。 </li><li> 、骨髄キメラマウスを作製するレシピエントとしてコンジェニックCD45.1 + C57BL / 6雌マウスを使用して、TLR3使用するには- / - 、ランゲリンDTR / EGFP、またはwtマウスは、ドナーとしてCD45.2 +を発現します。コンジェニックドナーとレシピエントマウスを使用したフローサイトメトリーを介して、ドナーとレシピエント細胞の分化を可能にし、これは、移植を評価することを可能にします。 </li><li>ドナー骨髄細胞を得るために、頸椎脱臼が続くイソフルラン麻酔でドナーマウスを安楽死させます。鋭いハサミは足首の周りの切開を行うとMとなるようウーズの筋肉組織が露出しています。 </li><li>脚の筋肉が表示されるように鈍鉗子を使用すると、腰に向かって足首から静かにマウスの皮膚や被毛を引っ張ります。 </li><li>鋭いハサミで腰の高さにし、大腿骨の頭の上にマウスの足を切りました。 </li><li>ペトリ皿の上に、氷上に足を置きます。高速に動作し、骨を露出させるために、すべての筋肉を削除します。 </li><li>個別の大腿骨と脛骨。可能な細菌を除去し、無血清DMEM 5 mlを含む別のペトリ皿の上にすぐにそれらを配置するために5分間の70％エタノール溶液中に骨を置きます。骨は鋭いハサミを使用して終了カットし、DMEMに骨髄をフラッシュします。 5ミリリットルの注射器に取り付けられた26 Gの針を挿入することにより、骨に、そのDMEMのフラッシュ1ミリリットルをすることができません。骨がフラッシングした後、（空の）白に見えていることを確認します。 </li><li> DMEM 10ml中のドナーマウスからすべての骨髄細胞を収集します。 70μmのセルストレーナーを通して収穫を通過させることにより骨髄細胞の単一細胞懸濁液を生成します。 </li><li> CL冷却遠心機で4℃で10分間、260×gで遠心分離することにより骨髄細胞の耳単一細胞懸濁液。 10mlのPBSで再懸濁細胞ペレット。 2.1.3及び2.1.4に記載したようにRBCL溶液を用いて赤血球細胞を枯渇させます。 </li><li>血球計数器または自動セルカウンターのいずれかを使用して骨髄細胞をカウントします。トリパンブルー染色13を介して死細胞の決意によって、細胞生存率を評価します。最適には、少なくとも80％の生存率を持つ単一の動物利回り約3×10 7白血球細胞/マウス。 </li><li> - / -または重量ドナー細胞の総骨髄キメラの場合には、TLR-3を準備します。 100μlのPBS中の2×10 6細胞を移植のために使用されるので、最適な細胞濃度が2×10 7細胞/ mlです。すぐに使用しない場合は、10％DMSOで緩慢凍結法とFBSを用いて、-80℃でドナー細胞を保存します。混合キメラモデルでは、ランゲリンDTR-ドナー細胞とを混合TLR3 - / - </sup&gt; 75：25の割合でドナー細胞。対照マウスを生成するために、骨髄細胞重量：25ランゲリンDTR：75のミックスを調製します。 </li></ol></li><li>マウスの照射および移植<ol><li>セシウム137のソース照射で生後8週 - 6との間の雌マウスに照射されます。マウスを4時間離れて550ラドの2つの用量を与えます。分割照射は、急性肝毒性を最小限に抑えるため、照射プロトコルによるマウスの致死率を減少させます。 </li><li>照射後、2週間の抗生物質で治療を受けたマウスを保持します。バイトリル/ kgを5 mgの - 2.5で飲料水に抗生物質を与えます。 </li><li> 2 - 第2の照射後4時間、静脈内にドナーの骨髄細胞を用いた移植マウス。 2×10 6個の細胞を含む100μlのPBSの最大容量を使用して、眼窩洞注入13を介して、およびイソフルラン麻酔下でドナー細胞の注入を行います。 </li><li>四週間の移植後、100のサンプルで生着を評価します少なくとも2つの色を読み取ることができる装置を用いて、フローサイトメトリーを介して、末梢血のマイクロリットル。ドナーと放射線耐性レシピエント細胞を区別するために、100分の1と1/200の間で希釈液を用いて、市販の蛍光標識CD45.1およびCD45.2抗マウス抗体を使用しています。ドナー細胞の最適な移植は、末梢血中の全造血細胞の少なくとも80％であるべきです。 </li></ol></li><li>ワクチン接種および標的に枯渇<ol><li>鼻腔を介して組換え生弱毒化インフルエンザワクチンをマウスにワクチン接種します。マウスのワクチン接種のために、精密な気化器を使用して、酸素中5％イソフルランでマウスを麻酔。ワクチンの10 3プラーク形成単位（PFU）を含む50μlのPBSを投与するために200μlのピペットを使用してください。 </li><li>最終的なマウスモデルを生成するには、鼻腔内に50μlのPBS中に希釈したDT 50ngのでマウスを治療します。 3.3.1で説明したように麻酔したマウスの鼻孔に直接ドロップすることによりDT降下を管理します。マイルを扱います2日目ワクチン接種後（ 図3B）までワクチン接種前日-2で治療を開始する日用量でCE。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

本研究では、ワクチン誘導免疫の生理学的および分子メカニズムを解明するために利用することができますどのように逆遺伝学およびキメラマウスモデルについて説明します。インフルエンザ逆遺伝学は、多くの研究室で確立され、インフルエンザ発病、複製、および伝送17を理解する上で主な役割を果たしてきました。我々のプロトコルで重要な点は、外来エピトープを発現する寒冷適応インフルエンザワクチンの救助です。ノイラミニダーゼの茎に短いcDNAを導入する戦略は、多くのグループによって説明してきたが、研究者は、追加の突然変異が卵にワクチン製造中に導入されていないことを確認する必要があり、ワクチンが誘導することなく、気道で複製することが可能であること肺炎5,12。ウイルスノイラミニダーゼの茎ならびにNS遺伝子セグメントとPB1セグメントとしてインフルエンザゲノムの他の領域の両方は、外来配列の割り当てを可能にするので、19,20、我々のプロトコルの改変は、例えば、インフルエンザウイルスに対するT細胞免疫応答、合理的なワクチン設計のための重要なポイントの階層を理解するために追加の外来ペプチドを追加するために...

疾患の非存在下での免疫記憶の発生を効率的にワクチン接種1の生理学的基礎です。近年、システム生物学に基づくアプローチは、順番に、リードが抗原の活性化を多系列ためにどのような黄熱病ワクチンとして成功したワクチンは、強力な自然免疫応答の誘導および樹状細胞（DC）のいくつかのサブセットの活性化を誘導することを明らかにしました特異的T細胞の2,3。 DCは、抗原特異的ナイーブT細胞4を活性化する能力を持つ唯一の免疫細胞集団であるため、ワクチン接種時にその機能の研究は、ワクチンに対する免疫応答を理解し、挑戦的な病原体に対する今後の戦略を設計することが重要です。 ワクチンに対する免疫応答の間に別のDCのサブセットのトレースはリンパ組織へのDCの遊走の正確な速度を確立するために望ましいであろうため、提供することを可能にするシステムワクチン特異的適応免疫の開始を担う生理学的メカニズムへの洞察。逆遺伝学ベースのアプローチは、この目的に実験的に使用することができる修飾された、生弱毒化ワクチンを生成するための可能性を提供します。インフルエンザ研究に実装するので、プラスミドベースの逆遺伝学は広くLAIVs含む組換えインフルエンザ株を生成するために使用されてきました。組換えインフルエンザウイルスを救出するための標準的なプロトコルは、（マディンダービーイヌ腎臓として許容システムでは8個のインフルエンザウイルスのセグメントと同様に増幅を含む（正と負の両方のセンスRNAを産生する）アンビセンスプラスミドを有する高度のトランスフェクト細胞株の多トランスフェクションを必要としますMDCK）細胞および/ ​​またはニワトリ孵化卵5。しかし、ワクチン接種の免疫機構を研究するための分子ツールを生成するための逆遺伝学の適用が未開拓のままです。 世代DCを含む免疫細胞サブセットの特定の枯渇を可能にする新しいマウスモデルの、ワクチン誘発保護の根底にある基本的な免疫機構を理解するための新たな可能性を開きました。マウスおよびヒトにおけるDCサブセット機能との比較、大幅に、マウスおよびヒトDCは機能的に相同6,7であることがこれらの調査結果を明らかにした、強力にマウスモデルの開発は、定常状態でのDCの特定の枯渇を可能にすることを示唆していますおよび炎症状態の間、ヒトにおけるDC応答の生理を理解するために役立つことができます。近年、マウスモデルの数は、目的8,9の遺伝子のプロモーター領域の制御下にサルジフテリア毒素（DT）受容体（DTR）を発現する導入遺伝子を保有する生成されています。マウス組織が自然にDTRを発現しないので、これらのモデルはDTでマウスの接種時に対象となる標的遺伝子を有する細胞サブセットの条件枯渇を可能にします。したがって、我々のabili生理学的プロセスの間に、生体内で特定のDCおよび他の白血球を枯渇させるTYは、大幅にDTRベースのROの開発によって強化されました。これらのトランスジェニックマウスモデルは、免疫系の個体発生を理解するために広く使用されているがしかし、ワクチン開発への応用はほとんどテストされていません。ここでは、インフルエンザの逆遺伝学とDTRベースの競争骨髄キメラを組み合わせることによって、我々は、in vivoでのワクチンに対する免疫応答の間にワクチン免疫の動態ならびに個々の遺伝子機能を研究するための方法を提案します。挑戦的な感染症に対する新たなワクチンの前臨床評価のためのこの技術の適用は、ワクチン設計を合理化し、in vivoでのワクチン候補をテストするために助けることができます。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコ&急性;Modified Eagle Medium (DMEM 1x)</td><td>Gibco RL-Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco RL-Life Technologies</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen-Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/ml)</td><td>PAA</td><td>p11-010</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>胚卵</td><td>Valo biomedia Gmbh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu;M Nylon Filters</td><td>Greiner-Biorad</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>赤血球溶解バッファー (RBCL) 10x</td><td>BD Bioscience</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32 マウス BD Fc ブロック (2.4G2)</td><td>BD Pharmigen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16)</td><td>Biolegend</td><td>141605</td><td></td></tr><tr><td>PE-Anti-mouse CD11c (HLA3)</td><td>BD Biosciences</td><td>553802</td><td></td></tr><tr><td>eFluor 450-抗マウスMHCII (MD/114.15.2)</td><td>eBioscience</td><td>48-5321-82</td><td></td></tr><tr><td>Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td></td></tr><tr><td>PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7)</td><td>Biolegend</td><td>121416</td><td></td></tr><tr><td>PE-Anti-mouse CD45.1 (A20)</td><td>eBioscience</td><td>12-0453-82</td><td></td></tr><tr><td>V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4)</td><td>BD Bioscience</td><td>562130</td><td></td></tr><tr><td>PerCp-eFluor710 -抗マウスCD8a(53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>46-0081-80</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7-抗マウスCD3&epsilon;(145-2611)</td><td>Biolegend</td><td>100325</td><td></td></tr><tr><td>eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5)</td><td>eBioscience</td><td>48-0041-80</td><td></td></tr><tr><td>CFSE Proliferation dye</td><td>eBioscience</td><td>65-0850-85</td><td></td></tr><tr><td>Baytril 2.5%</td><td>Bayer</td><td>65-0850-85</td><td></td></tr><tr><td>Dymethil-Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>オボアルブミン&nbsp;</td><td>分子プローブ&nbsp;</td><td>O23020</td><td></td></tr><tr><td>ジフテリア毒素 (DT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0564</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-TPCK</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>BD FACsCanto II Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo cell analysis software 9.5</td><td>Flowjo inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルーステイン(0.4%)&nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automatic Cell Counter</td><td>Invitrogen-Life Technologies</td><td>C10227</td><td></td></tr></tbody></table>

キメラマウスモデルにおける組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、粘膜免疫を研究するために、

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

ワクチンは人類の最大の成果の一つであり、前世紀に何百万人もの命を救ってきました。逆説的ですが、ワクチンに対する免疫反応を媒介する生理学的メカニズムについてはほとんど知られていませんが、これはおそらくワクチン接種の全体的な成功により、ワクチン免疫の分子的および生理学的メカニズムへの関心が低下しているためです。しかし、インフルエンザウイルスを含むいくつかの重要なヒト病原体は、依然としてワクチン接種の課題となっており、免疫ベースの戦略が役立つ可能性があります。
インフルエンザ逆遺伝学は、弱毒生インフルエンザワクチン(LAIV)の生成に成功裏に適用されていますが、ワクチン調製物にトレーサー成分などの分子ツールを追加することで、in vivoでのワクチン接種の動態を追跡することは、まだ取り組まれていません。さらに、動態研究中に白血球の特異的な枯渇を可能にする最新世代のマウスモデルは、ワクチン誘発防御の根底にある基本的な免疫メカニズムを理解する機会の窓を開きました。ここでは、リバースジェネティクスとキメラマウスモデルの組み合わせが、ワクチンが生理学的および分子レベルでどのように機能するかについての新たな洞察を提供するのにどのように役立つかを、例として組換え、寒冷適応、弱毒生インフルエンザワクチン(LAIV)を使用して説明します。細胞トレーサーを保有する実験室で生成されたLAIVと競合する骨髄キメラ(BMC)を利用して、ワクチン免疫の初期動態とワクチン特異的適応免疫の開始に関与する主要な生理学的メカニズムを決定しました。さらに、この手法がワクチンに対する免疫応答中の単一動物における遺伝子機能研究をどのように促進するかを示します。この手法は、インフルエンザ、HIV、マラリア原虫、エボラウイルスなどの出血熱ウイルスなど、緊急の医学的対策が必要な病原体に対する現在の予防戦略を改善するために適用できることを提案します。

組換え生弱毒化インフルエンザワクチンの生成は、双方向性プロモーター5の制御下でインフルエンザウイルスの8つのセグメントをコードするプラスミドをトランスフェクトすることによって達成することができます。低温適応インフルエンザワクチンは通常、低温適応株と同様に、任意のインフルエンザ株のHAとNA（ 例えば 、H1N1）（ 図1A）の6つのセグメントが含まれています。冷適応の原理は、33°C、マウスとヒト14における上部気道（URT）の温度で、ウイルス制限の複製に基づいています。したがって、ワクチンは、URTである程度複製することができますが、下気道の肺炎を引き起こすことはできません。融合PCR技術を使用して、ウイルスのノイラミニダーゼ（NA）のステムで保存された領域を追跡可能OVA由来ペプチド（SIINFEKL）（ 図1B）に置換しました。 動態研究におけるワクチン特異的応答を追跡するために我々が持っています<html>ワクチン製剤に由来しトレーサブルペプチド...

ワクチンがどのように機能するかについての知識は全体的に不足しています。ここでは、逆遺伝学と骨髄キメラマウスの併用を提案するとともに、樹状細胞とT細胞免疫に特に焦点を当てて、ワクチンに対する初期の宿主免疫応答についての洞察を得ることを提案します。

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

この手順の全体的な目的は、ワクチン特異的な適応免疫の生理学的開始を評価するシステムについて記述することです。まず、リバースジェネティクスを用いて特定の免疫原性ペプチドを含む弱毒生インフルエンザワクチンを作製し、次に鶏胚を用いてウイルスを増殖させます。続いて、ワクチン接種したマウスのリンパ節から細胞を回収し、FACS解析を用いて樹状細胞の遊走を追跡します。次のアッセイでは、免疫原性ペプチドに反応するCD8陽性T細胞を標識してワクチン接種済みのマウスに注入し、その後、フローサイトメトリー解析を行ってこれらの細胞の増殖を測定し、免疫応答をより詳細に分析します。競合的骨髄キメラマウスは、ジフテリア毒素受容体を発現する骨髄細胞を放射線照射した同系マウスに注入し、次にジフテリア毒素に曝露させることで作製します。除去が成功した後、マウスにワクチンを接種し、標識抗体とテトラマーを用いてCD8陽性T細胞を同定します。特定のペプチドの認識。この手法は、ワクチンが神経学的レベルでどのように作用するのか、ワクチンの主要な細胞・分子標的は何か、そして最も重要な点として、現在の予防戦略をどのように改善できるかといった、ワクチン学における重要な疑問への回答に役立ちます。手順のデモンストレーションはSanmen Medinaが行います。当研究室のマネージャーと私は、このプロトコールにおいて、冷適応株A/Ann Arbor/6/60をバックグラウンドとし、A/PR/8/34株のヘマグルチニンおよび改変ニューラミニダーゼを組み合わせた、再集合冷適応インフルエンザワクチンを作製します。ノイラミニダーゼ遺伝子のタンパク質ストーク配列の一部を、ニワトリペプチドsyn fecalをコードする短いCDNA配列に置換します。このペプチドはH-2 b MHCクラスIにおけるC57BL/6マウスの制限的応答において非常に免疫優位であり、追跡可能な要素として機能します。まず、10%胎児牛血清および1%pen strepを含むDMEMを用い、6ウェルプレートの各ウェルに93 T細胞を1,000,000個播種します。次に、1ウェルあたり100 µL分となるプラスミド導入用混合液を調製します。別のチューブに各プラスミドを1 µgずつ合わせ、あらかじめ温めておいたOpti-MEM細胞培地を50 µLまで加えて満たします。導入するプラスミドの総量に対し、2倍の量のlipectomy 2000を加え、細胞に導入する前にOpti-MEMでチューブの全量を50 µLまで調整します。室温で30分間静置します。その後、各ウェルに導入ミックスを100 µLずつ加え、プレートをインキュベーターに移して16時間培養します。翌日、培地を0.3% BSAおよび1% pen strepを含むDMEMに交換します。その後、細胞を33 °C、5% 二酸化炭素条件下で5時間培養します。5時間後。トリプシン添加DMEM中のインフルエンザ感受性MDCK細胞100万個をオーバーレイとして加えます。ウイルスを生成および増幅させるため、共培養系を33 °Cの培養条件下で2〜3日間維持します。その後、260 Gで5分間遠心分離し、デブリを除去します。次に、上清を回収し、無菌条件下で孵卵9〜10日の鶏胚卵に接種します。そのためには、卵殻の頂点に穴を開け、100倍、10倍、または1倍に希釈したウイルスを接種します。綿棒を用いて溶けたワックスで卵殻を密封し、接種した鶏卵を33 °Cで3日間インキュベートします。その後、感染卵からアラン・ト液を回収します。卵殻を70%エタノールで洗浄します。卵の上部を非常に慎重に割り、滅菌ピンセットを用いてallantoic membrane（尿膜）を除去します。10 mLピペットを使用して、可能な限り多くの液体を回収します。通常は6から10 mLです。液体を4°Cで260 ×g、10分間遠心分離し、上清のallantoic fluidを新しいチューブに移します。ドナーマウスを麻酔し、外科的に縦隔にアプローチした後、曲がったピンセットを用いてリンパ節を採取します。リンパ節を1 mLのDMEMが入った6ウェルプレートに移します。リンパ節周囲の結合組織や脂肪組織を除去した後、片方の針でリンパ節を固定し、もう一方の針で突き破ります。これにより、リンパ節内から細胞が培地中に放出され、細胞を回収することができます。まず、すべての組織材料を70 µmのナイロンフィルターに通し、遠心分離可能な細胞懸濁液を得ます。細胞ペレットを2 mLのRBC溶血バッファーで再懸濁します。室温で3分間溶血反応を行い、氷冷したPBSを2 mL加えて反応を停止させます。その後、テキストプロトコルに従って細胞の染色を行います。抗体インキュベーションの前に、プレートを弾いて上清を除去し、廃棄してください。市販のTCRトランスジェニックマウスからドナーT細胞をラベルし、5 million cellsを5 µM CFSEを含む1 mLのPBS中でインキュベートします。37 °Cの暗所で20分間インキュベートしてください。次に、細胞をPBSを用いて100 µLあたり2 million個となるように回収し、レシピエントの同系マウスに後方眼窩静脈叢注入により100 µLを一括投与します。3〜5日後、マウスを安楽死させ、縦隔リンパ節を採取し、前述の手法に従ってフローサイトメトリー用の単一細胞懸濁液を調製します。次に、単一細胞懸濁液を抗体カクテルで染色し、ドナー細胞を同定します。解析にあたり、CFSEの希釈プロファイルを決定するため、フローサイトメーターのFL1チャンネルをオープンにしておいてください。安楽死させたマウスの脛骨と大腿骨を取り出して洗浄し、DMEMを入れたディッシュに回収します。鋭い鋏で骨端を切断し、骨髄をDMEM中に洗い出します。次に、標準的な手法を用いて、6〜8週齢の雌マウスをセシウム137線源照射装置で照射します。照射から2〜4時間後にマウスを麻酔し、PBS 100 µLに懸濁した200万個のドナー骨髄細胞を後眼窩静脈叢に注射して移植します。その後2週間、マウスの飲水に1 kgあたり2.5〜5 mgのBaalを添加して投与します。ワクチン接種の2日前から、PBS 50 µLに希釈した50 ngのDTを、麻酔下にあるマウスの鼻腔に一滴ずつ直接投与します。この処置をワクチン接種後3日間継続してください。最終的なマウスモデルの作製に関する詳細は、テキストプロトコルを参照してください。麻酔下で、組換え生弱毒化インフルエンザワクチンを鼻腔内投与によりマウスに接種します。200 µLピペットを用いて、50 µLのPBSに溶解した1000 PFUのワクチンを投与します。組換え生弱毒化インフルエンザワクチンの作製は、双方向性プロモーターの制御下でインフルエンザウイルスの8つのセグメントをコードするプラスミドをトランスフェクションすることで達成されます。冷適応インフルエンザワクチンには、通常、冷適応株の6つのセグメントと、H1N1などの選択したインフルエンザ株のHAおよびNAが含まれています。寒冷適応により、マウスおよびヒトの上気道温度である33 °Cでのウイルス複製が制限されますが、下気道での複製は許容されないため、肺炎を引き起こすことはありません。PCRを用いて、ウイルスノイラミニダーゼのステム領域にある保存領域を、追跡可能なOVA由来ペプチドに置換しました。この追跡可能ペプチドモデルを、ワクチン接種後3日から6日の間のマウスに接種しました。追跡可能なタンパク質 syn fecal が肺排液リンパ節で検出されました。マルチパラメトリックフローサイトメトリーを用いて、ワクチン由来抗原の提示をリアルタイムで定量しました。同様に、syn fecal 特異的 T 細胞を注入することで、ワクチン特異的な CD8 T 細胞応答を定量し、ワクチン接種中の遺伝子特異的機能を評価しました。DTR技術と競合的骨髄移植を組み合わせたマウスモデルが利用されました。これにより、ワクチン接種に対する免疫応答の過程において、特定の細胞コンパートメントにおける遺伝子機能の喪失を標的とすることが可能となりました。このビデオを視聴することで、宿主におけるワクチン誘発免疫の調節に関与する分子および生理学的経路を分析する方法について、十分に理解することができます。さらに、この手法はワクチンの標的細胞の決定に新たな知見を提供し、これにより新しいワクチンプラットフォームの評価を促進します。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Lenhard, A. ほか。 ウイルス共感染による肺炎連鎖 球 菌の感染者から病原体への移行をマウスモデルで示すものは、加齢による悪化疾患を再現しています。 J. Vis. Exp. (2022年)この動画は、インフルエンザウイルスが 肺炎球菌...

ウイルス共感染後の 肺炎連鎖球菌 の病原性移行を研究するためのマウスモデル

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

このビデオは、マウスの鼻腔内 BCG 免疫を実証し、自然免疫応答と適応免疫応答の両方を活性化し、肺に常在するメモリー T 細胞とエフェクター B...

マウスモデルにおけるBCGによる鼻腔内免疫

このビデオでは、寒冷適応型組換えインフルエンザウイルスを作成する方法を紹介しています。これには、ヒト細胞に双方向プラスミドをトランスフェクションした後、低温でインキュベーションして、暖かい条件下での複製が減少するという特徴を持つワクチン製造に適したウイルスを生成するというものです。...

ワクチン用の組換え弱毒生インフルエンザウイルスの作製

マウスの下気道へのインフルエンザ菌の気管内接種手順を実演します。これは、マウスモデルで気道の炎症を調節するシグナル伝達経路を研究するための非常に有用なツールです。...

の気管内の管理<em&gt;インフルエンザ菌</em&gt;マウスモデルにおいて気道炎症を研究します

インフルエンザ A ウイルス (IAVs) は、重要な人間の呼吸器病原体です。IAVs の病原性を理解して新しいワクチン接種のアプローチの臨床テストを実行するには、人間の生理を模倣した動物モデルが必要です。ここでは、IAV...

感染症のマウスモデルでの A 型インフルエンザ ウイルス研究

本研究ではマウスの気管粘膜のインフルエンザ ウイルスに感染後 2...

イメージング 2 光子生体顕微鏡を用いたインフルエンザ ウイルス感染症の中に気管粘膜の細胞相互作用

ここで生体内でワクチンの評価のためのエレガントなプロトコルの有効性と宿主免疫応答を提示します。このプロトコルは、ウイルス、細菌、ワクチンのモデルまたは寄生病原体に対する適応ことができます。...

宿主-病原体応答とマウスでワクチンの有効性の評価

本論文では、インフルエンザウイルス感染のマウスモデルにおけるTfhおよびGC...

マウスにおけるインフルエンザAウイルス感染時のT濾胞ヘルパー細胞と胚葉センター応答の評価

このプロトコルは、IAVの鼻腔内投与およびマウス肺損傷および関連する肺細胞型への転写変化の下流分析の指示を提供します。...

インフルエンザ感染後の異形成および機能的肺胞修復のモデル化

学ぶ 組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与法を、キメラマウスモデルを用いて樹状細胞の動態とCD8陽性T細胞応答を解析する粘膜免疫研究に応用する方法です。

キメラマウスモデルにおける組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、粘膜免疫を研究するために、

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