エンジニアリング3D細胞化血管組織再生のためのコラーゲンゲル

この手順の全体的な目標は、血管組織再生のための管状構造を設計することです。これは、まず1型コラーゲンと平滑筋細胞を円筒状に組み合わせ、成形技術を用いて実現します。2番目のステップは、特別に設計された静的バイオリアクターでコンストラクトを成熟させることです。

次に、成熟したコンストラクトを慎重に収穫し、回転壁バイオリアクターを使用して内皮細胞をコンストラクトの内腔に装着します。最終的には、組織学、代謝アッセイ、および機械的試験が行われ、これらの管状構造物の特性が評価されます。この技術の独創性は、細胞とコラーゲンを結合するために1つのステップを使用するだけで、追加の物理的または化学的処理なしで、標的を絞った機械的特性を持つ組織工学的構築物が得られることです。

さらに、コンストラクトは、操作とエンドリンクを可能にする特別に設計されたグリップのおかげで簡単に操作できます。この手法は、血管組織再生のための成長およびリモデリング中の細胞と細胞外マトリックスとの間の相互作用に関する洞察を提供することができます。さらに、腱、皮膚移植片、心臓パッチ、神経系など、多くの標的組織に適用することができます。

付属のテキストプロトコルに記載されているように、静的バイオリアクターの製造と組み立てを開始するには、リザーバーとガーゼ、グリップ製造、マンドレルキャップ、ハウジングの金型組み立てと滅菌技術の詳細が含まれています。次に、ブタ大動脈平滑筋細胞を175平方センチメートルの組織培養フラスコで90%コンフルエントになるまで拡大します。標準的な培養技術を使用して細胞を回収し、完全培地で1ミリリットルあたり400万個の細胞で再懸濁します。

次に、緩衝液1部、滅菌コラーゲン溶液2部(1リットルあたり4g)、細胞懸濁液1部を混ぜ合わせます。この順序で、混合物のpHを測定し、pH 7.0から7.4の間にあることを確認します。次に、細胞コラーゲン混合物を組み立てたハウジングモールドコンプレックスに静かに注ぎます。

混合物に気泡がないことを確認してください。コラーゲンゲルを室温で1時間、無菌環境下に置いておきます。1時間後、ハウジングチューブを取り外し、35ミリリットルの予温培地が入ったリザーバーにコンストラクトを慎重に移します。

コンストラクトを垂直位置でインキュベートし、1週間または2週間の静的熟成を行います。下部セプタムポートから古い培地を吸引し、リザーバーに同量の新鮮な培養物を補充することにより、2日ごとに培地を交換します。中程度。必要に応じて、生化学分析のために各培地交換で、最初の12時間およびその後24時間ごとに、古い培地と新鮮な培地の両方を1ミリリットル収集します。

無菌条件下で培養培地からコンストラクトを取り出し、走査型レーザー干渉計の経路に直交して置き、1〜2週間の静的熟成後にコンストラクトの厚さを測定します。バイオリアクターを細胞培養フードに移し、コンストラクトをマンドレルから静かに取り出します。空いたら、40ミリリットルの新鮮な培地が入った直径100mmのシャーレに入れます。

次に、5〜10ニュートンのロードセルと、摂氏37度に保たれたPBSの浴に伸びるグリップを備えたマイクロメカニカルテスターをセットアップします。コンストラクトをペトリ皿から取り出し、縦方向の試験用に専用のグリップ装置に接続し、ゲルをつぶさずにコンストラクトのガーゼ部分に接続するように設計されています。テフロンテープを使用して、テスト中にグリップデバイスが滑らないようにします。

次に、コンストラクトをマイクロメカニカルテスターに取り付けます。次に、最初に構造物を最初のゲージ長まで伸ばし、そこに10分間保持することにより、長手方向の疲労試験を実行します。次に、10%の周期ひずみを毎秒5%の割合で30サイクル適用します。

サンプルが円周方向の試験を実行できなくなるまで、10%の周期ひずみの増分ステップでひずみを増やします。まず、試験片を長さ10ミリメートルのリング構造に切片化します。次に、グリップの代わりに使用されるステンレス鋼棒にリングを取り付けます。

縦方向テストと同様に、まず、コンストラクトを初期のゲージ長まで伸ばし、10分間保持します。次に、10%の周期ひずみを毎秒5%の割合で30サイクル適用します。コンストラクトが成熟し、マンドレルから取り出されたら、両端のコンストラクトをリザーバーに固定し、リザーバーアセンブリに配置します。

ここに示すように。貯水池の外側を30ミリリットルの文化で満たします。中程度。次に、コンストラクトの管腔容積の75%をタンパク質の混合物で満たし、コンストラクトの両端を閉じます。

タンパク質溶液の漏れを避けるために、バイオリアクターをインキュベーター内に置き、バイオリアクターを10の4.02倍から負の5GForceで1時間回転させ、照明がコーティングされている間に管腔表面をタンパク質でコーティングします。標準的な技術で培養されたヒト臍帯静脈および臍帯細胞を採取し、90%のコンフルエントの場合、Resusは細胞を懸濁し、M1 99培地を補充しました。次に、ヒトの臍帯静脈と尿路上皮細胞をコンストラクトの内腔に見ます。

平方センチメートルあたり1000セルの密度で、セル溶液の漏れを避けるために、コンストラクトの上端を閉じます。回転壁バイオリアクター培養物にホストされたコンストラクトを、負の5G力に対して10の4.02倍一定の回転で2日間インキュベートします。血管構造の静的成熟中に、細胞上昇構造の外径は急速に減少します。

ここに示すように、コンストラクトの直径は、静的培養の初日に初期値の60%減少しました。7日目までに、構築物はほぼ85%減少しました構築物の縦方向と円周方向のひずみサイクルの両方が、コラーゲンベースの構築物に典型的な粘弾性特性に従いました。全体として、同じひずみ範囲でのコンストラクトは円周方向と比較して長手方向に強く、内皮コンストラクトに対して行われたMassenトリコン染色は、非常に均質な内皮を示しました。

平滑筋細胞は紡錘体のような形状の形態を示し、壁全体に均一に分散しているように見えましたが、内皮細胞は管腔側によく広がっているように見えました。彼の開発の後。この技術は、バイオメカニクスと再生医療の研究者が、人工組織と天然組織の機械的挙動を探求する道を開きました。

このビデオを見た後、血管構造が迅速に設計され、最終的に動的装置の機械的調整に処理および使用されるのに十分な強度になる方法について十分に理解しているはずです。私たちの努力と結果が、生物学的機能組織の開発のための細胞外マトリックスのモデルにおける細胞の高い可能性についてあなたに納得させたことを願っています。