Name: リボフラビンとUVライトと血小板製品の治療：高力価の細菌汚染に対する有効 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学ぶリボフラビンとUV光を用いた血小板製品の病原体減少法。高力価細菌培養を調製し、リボフラビン添加後にUV照射して細菌数を測定する。この技術は輸血安全性を向上させ、HIVやHCVなど多様な病原体を不活化できる。

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1.細菌懸濁液の調製： <ol><li>画線培養プレートから、無菌的に無菌の接種ループを介して適切な成長培地（ 表1）の100 mlを含む250 mlの滅菌ボトルに単一コロニーを接種します。 </li><li>定期的成長のためにチェックする、1〜2日間適切な条件（ 表1）での軌道振盪インキュベーターにボトルを置きます。 140 RPMにシェーカー速度を設定します。 </li><li>無菌的に23℃で20分間3000×gで2滅菌50mlコニカルチューブと遠心チューブに細菌懸濁液を移します。 </li><li>上清を吸引除去し、滅菌ペプトン水15mlで各細菌ペレットを再懸濁します。必要に応じて渦。 1チューブ/容器内に浮遊細菌文化を結合します。 </li><li>保存培養力価を決定するために、セクション4につき三連でストック培養物を力価。 </li><li> 4時までの2週間冷蔵77; 2°C必要になるまで。再タイター使用時の文化は、ステップ4.8を参照してください。 </li></ol> 2.血小板製品の製造： <ol><li>認定血液バンクでの標準的なアフェレーシスヒト血小板製品を収集します。 90〜360ミリリットルの容量と0.8 -3.8×10 6血小板/μlの濃度：血小板製剤は、次のコレクションの仕様を満たしている必要があります。 <ol><li>血小板製剤は、病原体低減のための前処理に2時間の最小値のため休養していることを確認してください。これら2時間攪拌することなく、血小板インキュベーターで22±2℃で製品を保管してください。 2時間後、血小板製剤は、血小板インキュベーターで22±2℃で撹拌されていることを確認。最大22時間後の収集のために製品を使用してください。 </li></ol></li><li> 3ミリリットルの注射器を使用すると、血小板製剤のpH 22Cを測定するための2ミリリットルのサンプルを削除します。製品を確実にするために、血液ガス分析装置を使用して、pHを&gt; 6.6有し。血液学的分析器を用いて血小板製剤の血小板濃度を測定するために、同じサンプルを使用してください。製品は0.80から3.8×10 6血小板/μlの回収濃度の要件を満たしていることを確認します。 </li><li>視覚的に血小板製剤の渦を評価します。製品は「0」を有する場合、製品が廃棄される渦。 </li><li>直接白色光源下で血小板バッグを持ち、簡単に血小板バッグを絞ります。視覚的に血小板サンプルの旋回パターンを観察します。以下のスケールを使用して製品をスコア。 注：2 - 正渦巻き：強いコントラストでバッグ全体を通して目に見える不均一性を渦巻きます。 1 - 中級渦巻き：一部の不均一性の可視が、唯一のいくつかの場所でとコントラストが低いです。 0 - 負渦巻き：前と血小板バッグを圧搾した後、残りの濁り均質性</li></ol> 3.リボフラビンとUVライトプロセス： <ol><li>トラン滅菌チューブドッキングデバイスを使用して、リボフラビンおよびUV光照明や収納袋に血小板製剤sfer。転送後、チューブシーラーを使用して空の血小板ユニット収集袋を取り外し、バイオハザード廃棄物として空の袋を捨てます。 </li><li>その光保護外側ラップから原液リボフラビン、500μMの35ミリリットルの袋を取り出します。治療と収納袋の入口ライン上に無菌ドックリボフラビンキット。内容は血小板ユニットに排出できるようにします。 </li><li>リボフラビンポーチ/治療およびリボフラビンポーチから設定保存用バッグを掛け、ゆっくりと治療と収納袋の外へとリボフラビンバッグに残留空気を発現します。血小板製剤の少量はまた、血小板製剤に任意の残留リボフラビンをすすぐためにリボフラビンの袋の中に表現されていることを確認します。リボフラビンおよび血小板ソリューションが戻って治療や収納袋に排出できるようにして、入口ラインをクランプ。空のリボフラビンバッグ私たちを削除チューブシーラーをるとバイオハザード廃棄物として空の袋を捨てます。 </li><li>無菌ドック照明およびストレージ袋の入口ライン上にメスシリンジコネクタと6 &quot;チューブライン。メスシリンジコネクタに（プランジャーを削除）を10 mlシリンジバレルを取り付けます。 </li><li>無菌ピペットシリンジバレルに株式細菌の5ミリリットルを追加します。入口ラインのクランプを開き、細菌が血小板製剤に排出することができます。いくつかの血小板製品を10mlのシリンジバレルに逆流することを可能にすることによって、シリンジバレルをすすぎます。 10ミリリットルのシリンジバレルを削除します。 </li><li>無菌的に30mLのシリンジを接続して、血小板製剤に混入されたストック・細菌を確実にするために、入口ポートを最低2回フラッシュします。製品が十分に混合された後、きれいな5〜10ミリリットル注射器を使用し、2ミリリットルの前処理サンプルを削除します。新しい注射器を使用すると、接種工程やサンプリングステップから導入された空気がないことを確認してください。 <ol><li>部4ごとの前処理試料を滴定。 </li></ol></li><li>処理及び貯蔵バッグから入口ラインを取り外し、製品の重量を量ります。 </li><li>照明に製品を置き、標準血小板治療を開始するために、画面上のコマンドを実行します。 <ol><li>オペレータIDに入力します。 </li><li>照明装置のプラテンにバッグを固定し、マウントします。 </li><li>バーコードリーダーまたは手動入力キーパッドのいずれかを使用して照明装置にサンプルIDを入力します。 </li><li>スキャンの製品タイプ。 </li><li>石英クランプを閉じます。 </li><li>照明装置は、自動的にエネルギーの6.24 J / mlにお届けします。典型的な処理時間は5〜10分かかります。 </li></ol></li><li>治療と収納袋のサンプル電球ラインにメスシリンジコネクタと6 &quot;チューブライン治療無菌ドックの後。製品が十分に混合されていることを確認した後、5 mlシリンジを接続し、2ミリリットル後処理サンプルを削除します。 <ol><li>後処理SAMを滴定セクション4あたりPLE。 </li></ol></li></ol> 4.細菌力価<ol><li>前処理および後処理のサンプルの力価を推定し、各サンプルの終点連続希釈を行うために必要な5 mlの希釈チューブの適切な数を準備します。無菌ペプトン水1.8 mlを必要とチューブを埋めます。 </li><li>力価が10倍連続希釈スキームを用いて、各サンプル。無菌的には、最初の希釈用チューブ（10 -1）に希釈していないサンプルから0.2ミリリットルを転送します。渦この希釈管と、次の希釈チューブに0.2ミリリットルを転送します。希釈液の必要数を介して段階希釈を続行します。 <ol><li>無菌的に転送各希釈液100μlを、適 ​​切な寒天プレート（ 表1）にメッキします。 </li></ol></li><li>滅菌細胞スプレッダーを使用して、均等に各寒天プレート上にサンプルを配布します。 </li><li> （反転して、適切な条件でプレートをインキュベート<stroNG&gt;定期的に成長するためのチェック1-2日間表1）。 </li><li> 30〜300個のコロニーを有するプレートを数えます。 300より大きいコロニーを含むプレートを（TNTC）をカウントするためには多すぎると考えられています。 30未満のコロニーを含むプレートを、定量限界（LOQ）以下であると考えられます。 </li><li>各試験サンプルの力価を計算し、CFU / mlとして結果を記録。 <ol><li> CFU / mlのを計算するには、次の式を使用します。 <img alt="式（1）" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq1.jpg" width="250" /></li><li>最低希釈プレートにはコロニーが存在しない場合は、検出（LOD）の限界を計算するために、以下の式を使用します。 <img alt="式（2）" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq2.jpg" width="100" /> と <img alt="式3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq3.jpg" width="100" /> ここで： P中の粒子のNは=最低数（CFU）自信を持って検出することができroduct。 微生物が検出されないであろうと、Pは=確率。微生物を検出する95％の信頼性のため、Pは0.05を=。 ミリリットルで、V =総生産量 プレートのV =ボリュームメッキ（ミリリットル）×希釈レベル</li></ol></li><li>ネガティブコントロールのために、2つの寒天プレートのそれぞれの上に連続希釈のために使用されるペプトン水0.5mlをプレート。サンプルをテストするのと同じプレート型を使用します。裏返し、1~2日は、定期的に成長するためにチェックするために適切な条件でプレートをインキュベートします。 <ol><li>成長がいずれかの寒天プレート上で観察されている場合は、使用ペプトン水のボトルを廃棄しなければなりません。この研究の結果はまた、無効化されています。 </li></ol></li><li>陽性コントロール、再タイターを使用した細菌の保存培養のために。裏返し、1~2日は、定期的に成長するためにチェックするために適切な条件で培養します。力価は、レコードの1.0ログCFU / mlの±でなければなりません有効と見なされるための研究のために（1.5節を参照してください）​​株式価を編。 </li></ol>

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この論文のすべての著者は、現在テルモBCT、ミラソルPRTシステムの開発メーカーで採用されています。このビデオ記事の出版料はテルモBCTによって支払われています。

細菌スクリーニングは、血液金融機関で一般的になってきているし、多くの場所のためには、細菌汚染された血小板の輸血を防止するための主な方法として機能します。細菌のスクリーニングは、一般的に、Sのような急成長中のグラム陰性菌の大部分をinterdictsが、 マルセッセンス、E。大腸菌およびE.クロアカ 、それは 、Sのような成長の遅いグラム陽性菌を検出するのに苦労黄色ブドウ球菌 、 連鎖球菌属および S. 表皮8。残念ながら、これらの3グラム陽性細菌は、すべての汚染された血小板単位の50％の上方に関与していると、これら三つの生物を含む血小板製剤の輸血は、患者の死亡率1につながりました。 細菌のスクリーニングは、少なくとも一つの生物は、典型的な4-8 mlのスクリーニング試料内に含まれるように十分に十分に高いことが血小板製剤中の細​​菌力価に依存しています。細菌は、4-8 mlのサンプル容積内に捕捉されるために、細菌力価が十分に高くない場合、ユニットは、誤って陰性としてフラグが設定され、それは輸血のために解放されます。細菌のスクリーニングに別のアプローチは、すべての血小板単位で行うことができ、かつ、非機能などの汚染生物をレンダリングすることができ積極的なプロセスを採用する可能性があります。 本研究では、細菌の高い力価は、意図的に、リボフラビンおよびUV光の病原体低減プロセスの総削減容量をテストするために血小板ユニットに添加しました。この研究で試験された細菌の負荷がはるかに寄付する際に、通常の血液製品に見られるものを超えているが、この研究では、リボフラビンおよびUV光処理が著しくによって汚染血小板ユニット内生菌の力価を低下させることができることを実証するのに役立ち2.6 5.4ログ（細菌汚染の99.7から99.9996まで％減少）（ 図2）。 ACCURAを取得するにはTE対数減少値は、細菌力価の手順を実行する際に、オペレータが正確なピペッティングのスキルと一緒に良い無菌技術を持っていることが重要です。連続希釈液を実施不正確なピペッティングは、誤差の蓄積、したがって、不正確な力価測定につながることができます。 この研究で収集されたデータは、低レベルに対してシステムに挑戦リボフラビンおよびUV光で前の仕事、臨床的に関連する菌血症（&lt;20 CFU /ユニット）をサポートしています。以前の研究は、実際の臨床汚染事象を模倣するように設計され、その結果は、リボフラビンおよびUV光を7日間血小板保存期間にわたって細菌増殖を防ぐのに有効であったが示されました。以前の研究からのデータに基づいてモデル化は、血小板生成物の細菌汚染の現在のリスク推定値は、現在のレベルが8からできるだけ多く98％削減することができることを示唆しています。リボフラビンおよびUV光プロセスは、細菌の画面に匹敵します臨床的に関連する細菌負荷8でチャレンジしたときにのみ血小板単位の細菌の汚染物質を検出するために、66％の有効性を示している、る。 全ての技術と同様に、細菌で汚染された血小板ユニットに関連した合併症を防止するための血小板製剤のPRT処理は限界があります。 PRTシステムは、細菌胞子に対して有効ではなく、PRTシステムは残りのエンドトキシンがまだ受信者に敗血症性ショックを引き起こす可能性がグラム陰性菌の高力価を不活性化することができるので、場合でも、エンドトキシンを不活性化しません。細菌が高力価に伝播することができる前に、PRTは、最適なストレージの初期に行われています。 結論として、これらの二つの試験の組み合わせによって示されるように、リボフラビンおよびUV光処理の両方、グラム陰性およびグラム陽性生物の細菌負荷を減少させるのに有効であり、細菌のスクリーニングの実行可能な代替案を提供することができます。定期treatinリボフラビンおよびUV光でグラム血小板製剤はまた、ウイルスや寄生虫のような他の血液由来の薬剤の潜在的な伝達を低減させる付加的な利点を持っています。

血小板、血漿、濃厚赤血球、全血液製剤の輸血は、現代医学に大きな役割を果たしていると、様々な医学的状態を処置するための重要な流体を交換し、最終的には命を救うために使用することができます。血小板は、どちらかの全血から単離され、輸血投与量にプール又は血小板アフェレーシスの過程で収集されている細胞の産物です。体内の血小板の主な役割は、創傷部位での出血を停止し、止血を維持するのを助けるためにあります。低い血小板細胞数（血小板減少症）に罹患している患者は、自発的な出血事象に感受性であり、それらの血小板細胞は正常範囲内に戻ってカウントをもたらすために血小板と輸血されます。収集された血小板は、5-7日の最大のために保存され、一定の攪拌下にしながら、22±2℃で保存されています。 血小板輸血の救命性質にもかかわらず、そこに共同による輸血レシピエントへのわずかなリスクのまま寄生虫、細菌やウイルス11でこれらの製品のntamination。ウイルス核酸検査（NAT）の実装を大幅にそのようなC型肝炎ウイルス（HCV）、B型肝炎ウイルス（HBV）およびヒト免疫不全ウイルス（HIV）5などの主要な血液媒介剤のウイルス伝播の危険性を減少しました。カナダ血液サービスからの最近の刊行物は、これらの薬剤は、HBV 15 170万の寄付につき670万HCVの寄付や1あたりHIV、1のための100万8あたり寄付されるようにするための残存リスクを推定します。 細菌は、通常、一般の人々にあまり注目を集めるものの、血小板製剤中の細菌汚染の頻度は1と高いと推定されている：1,000 7および血小板製品の何百万人が毎年輸血されているため、多数の受信者は、合併症を脅かす潜在的に生命にさらされています敗血症6のように。研究では、一度に細菌負荷ことを示唆しています汚染が低いの、&lt;100コロニー形成単位（CFU）/製品2,16は、しかし 、栄養豊富な環境と室温保存は輸血前に危険な高力価に増殖する細菌を汚染することができます。現在、血小板の受信者に届くの細菌汚染された製品を防ぐために利用可能な唯一の承認された方法は、文化ベースのシステムとケア検査の迅速なポイントを使用することです。簡単に述べると、培養ベースのシステムのための血小板製剤は、4-8 mlのサンプルを瓶に血小板生成物から除去し、接種された際に細菌が、製品中で増殖することができるように、12-24時間、22℃で攪拌機に保存されています栄養培地を含みます。ボトルは、細菌の増殖のためのボトルを監視する機器内に配置されます。器具はボトル内細菌増殖を検出した場合には、フラグが設定され、対応する血小板ユニットは破棄されます。このプロセスは、高速GROを検出することを合理的に成功しているが翼の生物は、成長の遅い種の多くは、このように輸血7,12,14,16,22のためにリリースされる偽陰性ユニットの可能性を作成し、検出することが十分に高い力価に成長しません。細菌負荷が有意に増加した場合、培養ベースの検出システムとは異なり、医療検査の迅速な点は、典型的には、血小板の保存期間後に行われます。ケア検査のポイントは文化ベースのシステムよりも敏感であり、彼らは力価に達するとだけ確実に細菌を検出≥1×10 3 CFU / mlの17以来、高い力価が必要です。しかし、そのようなテストは、サンプリングの1時間以内に結果を提供することができます。これらのテストの性能の変動は、受信者9で致命的な敗血症反応を引き起こし、偽陰性製品のリリースにつながっています。 血小板製剤の細菌汚染の問題に対処する別の方法は、病原体低減のprocの日常使用によるものです汚染細菌を不活性化する代わりに、それらを検出しようとすることができESS。 UV光との組み合わせで、光増感剤としてリボフラビン用いて、細菌3,4,8,10,19-21リボフラビンおよびUVの【選択使用を含む、病原性の血液由来の汚染物質の広範囲の感染性を減少させることが示されています病原体低減のための光は、非毒性および非変異であり、リボフラビンおよびUV光で処理されたコンポーネントは、輸血レシピエントのためだけでなく、血液製剤18を扱う人のために安全であることが示されています。簡単に言えば、リボフラビン分子は、細菌、寄生虫、ウイルス、および任意の有核細胞（ 例えば、白血球）の核酸（DNA及びRNA）と結合することができます。 UV光への曝露は、このように複製および/ ​​または核酸の転写を防止し、13を不活性化生物を残して、核酸（主にグアニン塩基）の官能基に化学的変化を引き起こし、リボフラビンを活性化します。プレートなどの無核細胞でき及び赤血球を伴う核酸の欠如にリボフラビン化学により影響されません。 リボフラビンおよびUV光技術による以前の研究は、臨床的に関連する細菌負荷（&lt;20 CFU /製品）8で汚染された血小板製剤を模倣することを目的と実験計画を用いて細菌の選択グループを評価しました。この研究の目的は、高い力価の細菌汚染に対するリボフラビンおよびUV光のプロセスを評価することであった（&gt; 1.0×10 5 CFU / ml）をシステムの全細菌還元能力を測定するために、プラズマで処理血小板製品。 hemovigilance研究1から収集したデータに基づいて、一般的に存在するグラム陰性およびグラム陽性生物のパネルが、本研究で評価のために選択し、以下の種含まれていました： 表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌、ストレプトコッカス・ミティス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、セラチア菌、腸炎エルシニアを、ブルセラneotomae、セレウス菌（栄養型）、エシェリキア・コリ、緑膿菌や肺炎桿菌 。 B.除くすべての生物、 セレウスは 、ATCCから入手し、優先度は、血液成分から単離されていると同定された細菌株を得る上に置きました。 B.この研究でテストしたセレウスは、汚染された血小板製剤から内部で分離された臨床株です。

<table><tbody><tr><td>Mirasol Illuminator</td><td>Terumo BCT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mirasol Treatment/Storage Bag</td><td>Terumo BCT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Hematology Analyzer</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Ac&bull;Tデフ&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>血液ガス分析器</td><td>Siemens</td><td>RapidLab 1265&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ドッキング装置</td><td>テルモ BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>血小板インキュベーター</td><td>ヘルマー</td><td>PC2200</td><td></td></tr><tr><td>オービタルインキュベーター シェーカー</td><td>ラボライン</td><td>4628</td><td></td></tr><tr><td>ドライインキュベーター</td><td>フィッシャー</td><td>アイソテンプ</td><td></td></tr><tr><td>クラスII A/B3 バイオセーフティキャビネット</td><td>サーモフォーマ</td><td>1286</td><td></td></tr><tr><td>チューブシーラー</td><td>セブラ</td><td>スマートシーラーII</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離機</td><td>IEC</td><td>セントラGP8R</td><td></td></tr><tr><td>10mlシリンジ</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>30mlシリンジ</td><td>BD</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>5ml希釈チューブ</td><td>VWR</td><td>211-0058</td><td></td></tr><tr><td>50mlコニカルチューブ</td><td>コーニング</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット</td><td>ギルソン</td><td>P-200</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペット</td><td>レイニン</td><td>R-200</td><td></td></tr><tr><td>リピートピペット</td><td>Eppendorf</td><td>4780</td><td></td></tr><tr><td>1-200 &micro;lフィルターチップ</td><td>Costar</td><td>4810</td><td></td></tr><tr><td>25 ml使い捨て血清ピペットCostar</td><td></td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>5 ml使い捨て血清ピペット</td><td>Costar</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>35 ml 500 & マイクロ;Mリボフラビン</td><td>テルモBCT</td><td>35 mL 500 &M&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ブルセラ寒天、5% 馬の血液</td><td>BBL</td><td>221547</td><td></td></tr><tr><td>脳心臓注入</td><td>Teknova</td><td>B9993</td><td></td></tr><tr><td>ペプトン水</td><td>BD</td><td>257087</td><td></td></tr><tr><td>トリプチカーゼ大豆スープ</td><td>BD</td><td>299113</td><td></td></tr><tr><td>トリプチカーゼ大豆寒天</td><td>Remel</td><td>R01917</td><td></td></tr><tr><td>熱不活性化馬血清</td><td>Gibco</td><td>26050</td><td></td></tr></tbody></table>

リボフラビンとuvライトと血小板製品の治療：高力価の細菌汚染に対する有効

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

細菌による血小板単位の汚染が長く、それらの供血後の保存条件に重大な輸血のリスクとして認識されています。製品は、日常的に、攪拌シェーカー上で22℃での細菌の増殖を促進することができる条件が記憶されています。血小板製剤中に導入されると考えられた細菌の総数が非常に低いが、これらの細菌は、潜在的に重篤な有害事象が生じる前輸血に非常に高い力価に増殖することができます。本研究の目的は、血小板製剤の一般的な汚染物質として同定された細菌のパネルに対してリボフラビン基づく病原体低減プロセスを評価することでした。 S.：このパネルには、以下の生物が含まれます表皮、黄色ブドウ球菌、S。ミチス、化膿レンサ球菌、S。マルセッセンス、Y。エンテロコリチカ、B。neotomae、セレウス菌、大腸菌、緑膿菌および K. ニューモニエ 。各血小板ユニットは高細菌負荷を接種し、サンプルをBを除去し、処理前後のOTH。コロニー形成アッセイは、終点希釈スキームを使用して、前処理および後処理の細菌力価を決定しました。 log減少は、治療前の力価から後処理力価を差し引いて計算しました。以下の対数減少が観察された。S.表皮 4.7ログ（99.998パーセント）、黄色ブドウ球菌 4.8ログ（99.998パーセント）、Sは 3.7ログ（99.98パーセント） ミチス、化膿連鎖球菌 2.6ログ（99.7％）、S。マルセッセンス 4.0ログ（99.99％）、Y。エンテロコリチカ 3.3ログ（99.95％）、B。neotomae 5.4ログ（99.9996パーセント）、セレウス 2.6ログ（99.7％）、大腸菌 ≥5.4ログ（99.9996パーセント）、緑膿菌 4.7ログ（99.998パーセント） および K 。ニューモニエ 2.8ログ（99.8％）。この研究の結果は、プロセスが細菌汚染に関連した重篤な有害事象輸血のリスクを低減するのに役立つ可能性があり示唆しています。

11の異なる細菌種の減少は、リボフラビンおよびUV光ベースのPRTプロセスを使用して評価しました。これらの薬剤は、血小板製剤のより一般的な汚染物質のいくつかを表しており、5グラム陽性および6グラム陰性生物を含みます。少なくとも6つの血小板生成物は、生物ごとに評価し、各製品は、血小板生成物中の細菌の&gt; 1.0×10 5 CFU / mlの最終力価を得るために十分な細菌を接種しました。治療前のサンプルは、血小板生成物は速やかにリボフラビンおよびUVプロセスで処理した後、前処理の力価を決定するために除去しました。以下の対数減少が観察された血小板製剤の治療を以下：Sを表皮 4.7ログ（99.998パーセント）、黄色ブドウ球菌 4.8ログ（99.998パーセント）、Sは 3.7ログ（99.98パーセント） ミチス、化膿連鎖球菌 2.6ログ（99.7％）、S。マルセッセンス 4.0ログ（99.99％）、Y。エンテロコリチカ 3.3ログ（99.95％）、B。neotomae 5.4ログ（99.9996パーセント）、セレウス菌 2.6ログ（99.7％）、大腸菌 ≥5.4ログ（99.9996パーセント）、P。緑膿菌4.7ログ（99.998パーセント）と肺炎桿菌2.8ログ（99.8％）（ 図2）。リボフラビンとUVプロセスのために上述したようにすべてのユニットは、システムの仕様を満たしていました。追加の還元試験を用いて行ったS.バフィーコート由来の血小板を用いて、 化膿連鎖 。有意差は、Sの減少は観察されませんでした。アフェレーシス血小板に対する軟膜由来の血小板においてピオゲネス （データは示さず）。 <img alt="表1" src="/files/ftp_upload/52820/52820table1.jpg" /> 表1：リボフラビンおよびUV光を用いて評価した細菌種の成長条件 。血小板製剤を汚染することが示されている両方のグラム陰性およびグラム陽性細菌のパネルは、この研究のために選択しました。成長条件（温度およびメディア種類）を伝播するために使用され、タイトR生物が表示されます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig1.jpg" /> 図1：リボフラビンおよびUV光の病原体低減プロセス 。リボフラビンは、500μMの名目上の濃度で、0.9％生理食塩水に溶解しました。解決策は、接続されており、各血小板製剤中に排出滅菌しました。細菌は、各血小板ユニットに無菌的に添加し、次いでUVエネルギー（約6-10分）の6.2 J / mlで処理しました。 このインビトロで後処理血小板部が最終細菌力価を決定するためにサンプリングした研究。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig2.jpg" /> 図2：種々の細菌種の還元リボフラビンおよびUV光で処理リボフラビンおよびUV光は、血小板製剤の一般的な細菌汚染物の細菌負荷を減少させるために使用しました。ログ10減少が違いです平均前処理力価と平均後処理力価との間である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52820/52820fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

血小板製品の保管条件は、細菌汚染物質が危険なレベルまで増殖するための理想的な環境を作り出します。 この研究の目的は、コロニー形成アッセイを使用して、ヒト血小板製品の高力価細菌汚染に対するリボフラビンベースの病原体減少プロセスを評価することでした。

リボフラビンとUVライトと血小板製品の治療：高力価の細菌汚染に対する有効

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

この手順の全体的な目的は、リボフラビンとUVを用いた病原体低減法を用いて、血小板製剤に含まれる一般的な細菌汚染物質の減少を評価することです。まず、高タイターの細菌ストックを調製します。次に、ヒト血小板製剤を入手し、ユニットセル品質を評価します。次に、血小板ユニットにリボフラビンを投与し、既知濃度の細菌を接種します。最終ステップとして、ユニットにUV光を照射します。最終的に、エンドポイント希釈平板法で測定した生存細菌数を、処理前と処理後のサンプルで比較することにより、細菌の減少率を測定します。細菌スクリーニングなどの既存の方法に対する本手法の主な利点は、リボフラビンとUV光によって、H-I-V-H-C-V、マラリア、Babesiaなどの他の病原体を不活化できる点にあります。この技術の影響は血中病原体にとどまらず、白血球や献血血液製剤を不活化することも可能です。これらは、輸血関連移植片対宿主病などの有害な輸血事象に関連しています。私が、血液中の病原体を不活化するためにこの手法を用いると考え出したきっかけは、光化学化合物と核酸の相互作用に関する研究を行っていたことにあります。この技術は、赤血球、血小板、血漿タンパク質とは異なり、病原体は複製および疾患伝播に不可欠なゲノム核酸を含有しているという事実を利用しています。したがって、血液製剤中に存在する環境下で核酸の化学的特性を標的にすることで、赤血球、血小板、血漿タンパク質成分の品質を維持しつつ、より選択的に病原体を不活化することが可能です。それでは、手順を実演します。本日は、研究員のNick HOAと、研究技術者のDenise Gilmoreが担当します。まず、目的の細菌に適した増殖培地100 mLを入れた、滅菌済みの250 mLボトルを用意します。滅菌済みの白金線を用い、ストリーク平板培養から単一の細菌コロニーを培地に接種します。次に、ボトルを振盪インキュベーターに入れます。振盪速度を140 RPMに設定し、1〜2日間培養します。定期的に培養液を確認し、細菌の増殖を確認してください。インキュベーション後、菌懸濁液を2本の滅菌済み15 milliliter円錐チューブに移します。これらのチューブを23 degrees Celsiusで3000 times Gにて20分間遠心分離します。次に、上清を吸引し、菌ペレットを15 millilitersの滅菌済みペプチド水で再懸濁します。チューブをボルテックスして懸濁を促進し、その後、再懸濁した細菌培養液を合わせてストック培養液を作成します。5 mL希釈チューブに、それぞれ1.8 mLのペプチド水を満たします。未希釈のサンプル200 µLを最初のチューブに移してボルテックスし、その後、そのチューブから200 µLを次のチューブに移します。適切な希釈倍率に達するまで、この操作を繰り返します。各希釈液 100 µL を適切な寒天プレートに分注します。滅菌済みのセルスプレッダーを用いて、サンプルをプレート全体に均一に塗布します。陰性対照プレートについては、サンプルを AER 全体に分散させてください。ペプチド水を500 µLずつ2枚のアガープレートに分注します。滅菌済みのセルスプレッダーを用いてサンプルをアガー上に均一に広げ、すべてのプレートを倒置し、適切な温度で1〜2日間インキュベートします。陰性対照プレートのいずれかで菌の増殖が認められた場合、ペプチド水は汚染されており、タイターは無効となります。陰性対照プレートが陰性であれば、コロニー数が30から300個のすべてのプレートのコロニー数を計測します。次に、各試験サンプルのタイターを計算し、1 mLあたりの個数を結果として記録します。細菌培養物は4 °Cで最大2週間まで冷蔵保存してください。正確性を期すため、使用前に培養液のタイターを再測定してください。1 µLあたり0.80〜3.8 million個の血小板濃度を持つ、90〜360 mLの標準的なアフェレーシスヒト血小板製剤を用意します。血小板インキュベーター内（22 °C）でバッグを少なくとも2時間静置した後、使用まで60 RPMで緩やかに撹拌してください。血小板製剤から2 mLのサンプルを採取し、22 °Cの血液ガス分析装置を用いてpHが6.6以上であることを確認します。同じサンプルを用いて、血球計数装置で血小板濃度を測定し、目的の範囲内にあることを確認してください。次に、血小板バッグを直接的な白色光源の下に保持し、外観検査を行います。バッグを軽く絞り、サンプルの渦巻き状のパターンを観察します。バッグを絞る前後に濁った均質性が認められる場合は、チューブドッキングデバイスを用いて血小板を使用しないでください。血小板をリボフラビンおよびUV光照射・保存用バッグに移します。チューブシーラーを使用して空の血小板バッグを取り除き、バイオハザード廃棄物として廃棄します。次に、500 micromolar リボフラビンストック溶液滅菌済みの遮光外装を取り除きます。リボフラビンプリザーブ袋を処理・保存バッグの入口ラインに接続し、内容物を血小板ユニットに注入します。次に、リボフラビンポーチからポーチと処理バッグのセットを吊り下げます。処理バッグ内の残留空気をゆっくりと押し出し、リボフラビンバッグへ移動させます。少量の血小板製剤を用いて、残留したリボフラビンを血小板ポーチ内へ洗い流します。リボフラビンおよび血小板溶液を処理バッグに戻します。次に、入口ラインをクランプします。チューブシーラーを用いて空のリボフラビンバッグを取り外し、適切に廃棄してください。滅菌済み。メス型シリンジコネクタを備えた6インチのチューブラインを、照明および保存バッグの入口ラインに接続します。チューブラインに10 mLのシリンジバレルを取り付けます。次に、5 mLの細菌柄懸濁液をシリンジバレルに加えます。次に、入口ラインのクランプを開き、細菌を血小板製剤に排出させます。血小板製剤を一部逆流させて、シリンジのバレルを洗浄します。洗浄後、シリンジのバレルを取り外します。30 mLのシリンジを取り付け、製品を十分に混合させた後、入口ポートを少なくとも2回フラッシュします。清潔な5 mLのシリンジを使用して、2 mLの前処理サンプルを採取します。新しいシリンジを使用して、バッグ内に混入した空気を除去してください。次に、処理バッグから流入ラインを取り外し、血小板溶液の重量を量ります。オペレーターIDを入力して血小板処理を開始し、バッグをイルミネータープレートに装着します。続いて、バーコードリーダーを使用してサンプルIDを入力します。製品タイプを入力し、その重量をソフトウェアに入力します。次に、クオーツクランプを閉じて、1 mLあたり6.24 joulesの紫外線エネルギーを自動的に照射します。通常、処理時間は5～10分です。その間に、UV処理後の前処理サンプルを定量し、細菌の生存率を評価するために処理後のサンプルを定量し、続いてポジティブコントロールとして細菌のストック培養液を定量します。ストック培養液の定量値は、記録されている定量値の1 log unit CFU/mL以内である必要があります。リボフラビンとUV光ベースの病原体低減技術プロセスを用いて、11種類の異なる細菌種の減少を評価しました。個体あたり少なくとも6種類の血小板製剤を評価し、それぞれに接種を行った。十分な細菌量（最終力価が1mLあたり10,000 CFU超）を用いて、治療前、ならびにリボフラビンおよびUVによる治療直後のサンプルを採取し、治療前の溶液と比較した。リボフラビンとUV光による処理により、すべての細菌量は少なくとも2.6 logユニット（約400倍）減少した。高タイターの細菌を用いたこれらの研究に続き、より臨床的に関連のあるスパイクタイターを用いて追加の研究を行うことができます。これらは、献血時に製品中に存在し得る細菌レベルを実際に表しています。低タイターのスパイクを用いたこれらの研究の目的は、細菌の増殖を抑制し、保存期間中、特に室温での長期保存期間において、培養陰性を維持させる手法の能力を評価することです。本技術の導入により、研究者や医療従事者が広範な病原体を不活化させる能力を評価し、輸血伝播性疾患の拡大を防止するためにこの技術を利用することが可能になりました。このビデオを視聴することで、リボフラビンとUV光で処理した高度に汚染された血小板製剤における細菌のログ減少量の測定方法について、十分な理解を得ることができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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