Name: 無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 学ぶマウス胚性幹細胞の無血清単層培養による神経前駆細胞への分化法。ゼラチンコーティング、適切な植え付け密度、免疫蛍光顕微鏡による確認を含む。この再現性の高いプロトコルは神経発生研究と化合物スクリーニングに適用可能です。

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仕事は、タイ教育省からW.W.への科学技術の発展と振興の奨学金と、テノバスとアノニマストラストからのM.P.S.への助成金によって資金提供されました。

1.メディアの準備注：プロトコルは、2つの別のメディアのミックスの使用に依存している：変更されたN2サプリメントを補充したDMEM / F12とするNeurobasalは、典型的には1に、B27サプリメントで補充：1の比率。 <ol><li> 15mlチューブに成分を混合することによって修正されたN2サプリメントを準備します。これをボルテックスしたりフィルタリングしません。溶液が透明になるまでチューブを転倒混和。 <ol><li> （0.01 M HClに作られた）25 mg / mlのインスリンの1ミリリットルを加え、チューブを反転させてよく混ぜ、その後、DMEM / F12の7.2ミリリットルをピペットで起動します。溶液が透明になるまでには数分かかります。 </li><li> 100ミリグラムの1ミリリットルを追加/ mlの（水の中に作られた）アポトランスフェリン、0.6ミリグラム/ 33μlのミリリットルprogesternone（エタノール中に作られた）、水に作られた160 mg / mlの（1 M）プトレシン（100μlの）、水の中に作られた3ミリモルの亜セレン酸ナトリウム（）10μlの7.5％ウシ血清アルブミンの666μlを、よくチューブを混ぜます。 -20℃で2.5ミリリットルに小分けとストア最大2ヶ月間C。 </li></ol></li><li>メディアを準備します。 <ol><li> DMEM / F12 250 mlにN2の2.5ミリリットルを追加します。よく混ぜますが振動やフィルタはありません。 </li><li>神経基礎の250ミリリットルにメディアはB27サプリメントの5ミリリットルを追加します。よく混ぜますが振動やフィルタはありません。 </li><li> 1：1の比のステップ1.2.1と1.2.2からメディアをミックス。いくつかのケースでは1：3混合物は、（：ステップ1.2.4で1ミックス1のように補足した）必要な場合があります。 </li><li>ミックスにL-グルタミン（最終濃度0.2 mM）の2-メルカプトエタノール（最終濃度0.1 mM）の3.5μlを0.5 mlのを追加し、振盪せずによく混ぜます。 3週間まで4℃でメディアを格納し、光にさらすことは避けてください。この最終的なミックスはN2B27と呼ばれています。 </li></ol></li><li>ゼラチン溶液を準備します。 <ol><li> 15分間、121℃、15 psiで超純水、オートクレーブ中の1％ゼラチン溶液を準備します。それは、このために使用ボトルは洗浄剤や消毒剤から完全にクリーンであることが重要なので、新しいボトルがあることをお勧めしますこのために使用されるとしか使用の間、超純水でリンスされます。 50ミリリットルのアリコートに1％溶液を分注し、数ヶ月のために4℃で維持。 </li><li>溶解するまで37℃の水浴中で1％ゼラチンのアリコートを温め、温かいリン酸緩衝食塩水（PBS）500ml中に加えます。十分に混合し、各ウェルまたはプレートの底をカバーするのに十分ピペット。少なくとも30分間コートにゼラチンを表面を許可します。 </li></ol></li></ol> 2.細胞をプレーティング注：このプロトコルは、白血病阻害因子（LIF）で10％血清中で増殖させたマウスESC、LIFおよび骨形成タンパク質4（BMP4）またはMEKとGSK3阻害剤（2Iメディア）とLIFまたは無血清培地と血清代替に等しく適用されますでまたはLIFなしで。しかし、分化のタイミングおよび効率は、細胞培地（説明を参照）に依存して変化し得ます。ここに示した実験のために、我々はEGFPレポーターがOにノックした46CマウスESC株を（使用しました10％血清およびLIFとGMEM中で増殖させた内因性SOX1対立遺伝子のNE）。最適な結果のためには、細胞が解離し、N2B27培地中に再プレーティングすることが重要です。単にGMEM /血清/ LIFからN2B27にメディアの変更は、常に細胞を再プレートと比較して減少分化効率をもたらします。 <ol><li> 10％血清、1mMピルビン酸ナトリウム、1×非必須アミノ酸、0.1 M 2-メルカプトエタノール、100ユニット/ mlのLIF 13 GMEM中で細胞を成長させます。 3日- 2かかりますT25培養フラスコにマウスESC、プレート1×10 6細胞のサブコンフルエント培養物を取得します。 </li><li>明視野顕微鏡で細胞を観察します。細胞がサブコンフルエントと通過する準備ができたら、PBS中で2回、それらをすすぎます。細胞解離試薬の1ミリリットルを追加し、2インキュベーターに戻す - 5分。トリプシンおよび他の酵素は、細胞分離のために用いることができるが、めっき密度があることが必要となるので、それらはadju細胞接着に悪影響を与えることができSTED。 </li><li>細胞がプレートから持ち上げるために始めているしたら、単一細胞懸濁液にそれらを取り除くために、容器をタップします。 15mlの遠心チューブに培地と細胞解離試薬およびピペットの10ミリリットルの合計に細胞を回収します。 </li><li> RTで3分間、300×gで細胞をスピン。 </li><li>慎重に上清を吸引し、ピペッティングにより3ダウン予め温めておいたN2B27 10mlにペレットを再懸濁 - 5回。ダウンサスをピペットすると、チューブの側面にピペットは、泡を作成しないように。自動細胞カウンターまたは血球計数器で細胞をカウントし、濃度を記録します。 </li><li>予め温めておいN2B27にウェルあたりするボリュームの単位当たりの細胞の所望の数を含む細胞懸濁液を準備します。 6ウェルディッシュ中で1cm 2当たり10,500細胞の密度（ すなわち、6ウェル皿のウェル当たり1×10 5個の細胞）が最適です。 cm 2であり、PLAあたりの細胞の推奨数については、表1を参照してください。細胞培養容器の様々なティンメディアボリューム。 </li><li>培養容器からゼラチンを吸引し、 表1で推奨密度とボリュームに応じて細胞懸濁液をプレート。これは中央に細胞を集中するようにプレートを旋回しないでください。 37℃、5％CO 2の湿潤インキュベーター内で培養を配置します。 </li><li>新鮮N2B27で全てのメディアを交換することによって、2日 - すべての1のメディアを変更します。ピペットは、細胞を穏やかにフラッシュなどの密度に影響を与え、次の日に分化効率を低下させる可能性があります。めっき後の初期の生存率が悪い場合には、1で細胞をプレート：N2及びB27添加培地の3ミックスと最初の2日後N2B27に変更。細胞が分化するように開始され、4の内部（ここで使用46C細胞株におけるレポーターの緑色蛍光によって可視）SOX1の発現を示すべきである- 6日。 </li></ol> 3.免疫蛍光染色 NOTE：プロトコルは、任意の容器型に適用することができます。各試薬の量は、6ウェルプレートのウェル毎に記載されており、任意の表面領域にスケーリングすることができます。再プレーティングは、その後低い生存能力にはお勧めしません。 <ol><li>分化培地を除去し、4％の500μL（v / v）のパラホルムアルデヒドを添加することにより、細胞を固定、15分間放置します。 </li><li>洗浄し、PBS-T（リン酸緩衝生理食塩水0.5％（v / v）のトゥイーン20）を2 mlの細胞透過性を2回。細胞を4℃で最長2ヶ月間、PBS-T中で維持することができます。 </li><li> 10％（二次抗体と同じ種に由来する）（v / v）の血清をPBS-T 1mlのPBS-Tを交換してください。任意の非特異的結合をブロックするために室温でロッカープレート上で1時間インキュベートします。 </li><li> 1時間後、PBS-Tを2 mlの細胞を2回洗浄し、（1希釈した10％の血清をPBS-Tで1000）、βIIIチューブリンに対する500μlのマウスIgGでインキュベートします。プレートロッカーに入れ、4℃でO / Nのままにしておきます。 </li><li>この段階から、常に血管を保護光から。次に（10％血清をPBS-T中の2μg/ mlに希釈した）蛍光標識抗マウスIgG抗体500μlを添加、PBS-Tで細胞を2回洗浄します。室温で1時間プレートロッカーの上に置きます。 </li><li>その後、DAPIの500μlを添加、PBS-Tで細胞を2回すすぎ（PBS-Tで0.5μg/ mlに希釈し）、5分間のままにします。 </li><li>再び細胞を洗浄し、PBS-Tに保管してください。細胞を撮影する準備ができていると、4℃で2週間まで維持することができます。それは固定され、生細胞の、又は異なる時間に固定された細胞のGFPの強度を比較することは不適切であるので、GFPシグナルが経時フェード注意。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

単層神経分化プロトコルは、十年6オーバーのために使用されてきました。プロトコルが定義された媒体で構成され、前臨床のためのシステムをより適用になり、単層システムで行われ、非常に効率的である（ 例えば、薬物スクリーニング）を使用しています。しかし、分化効率を決定するいくつかの重要な要因があります。この記事では、これらの要因と各障害物のためのソリューションを指摘しています。 分化状態でプレーティング後の細胞の密度は、おそらく最も重要な要因です。あまりにも低密度でプレーティングする細胞死につながるながらあまりに高密度に細胞をプレーティングすることは、分化効率を低下させます。この現象は、自己分泌成長因子シグナル伝達に起因する可能性が高いです。 FGF4は、MAPKカスケードを活性化し、ESCの分化11を駆動するオートクリン増殖因子です。 LIFは、ESCによって生産別のサイトカインです。これは、STAT3経路を活性化し、自己再生を促進します&lt;SUP&gt; 15。このプロトコルは、神経細胞を作るためにN2B27を利用します。...

胚性幹細胞（キメラを形成することによって）適切な段階の胚に再導入後のすべての成体細胞型に分化する能力を保持しながら、in vitroで無限に増殖する能力を有する初期胚から誘導された多能性細胞、同系または免疫無防備状態の宿主に注入されています適切な手がかりに（奇形腫を形成することにより）、またはインビトロ 、対象における 1。神経系統へのマウス胚性幹細胞のin vitroでの分化は、1995年に初めて記載され、モルフォゲン、レチノイン酸2-4を補った血清含有培地中の多細胞懸濁凝集体（胚様体に、EB）の形成を関与していました。それ以来、種々のプロトコルは、神経分化5を可能にするために開発されてきました。まだ凝集を利用する多くの、他の細胞型を誘導するとの共培養を、いくつかの無血清培地の使用を含みます。すべてのプロトコルの利点持っていますND欠点及び神経または神経細胞の正確な性質は、また、使用するプロトコルに応じて変化する生じました。 理想的なプロトコルは、堅牢で拡張性の高い、完全に定義された培地と基質を利用する、分化過程の非侵襲的モニタリングに適して、外部の手がかりによってパターニングすることができる神経前駆細胞の純粋な集団の生成をもたらすと区別するためであろう比較的短時間で高効率と収率で、すべてのニューロンとグリアサブタイプに。最後の十年では、低密度、無血清の接着性単層培養6-10にマウスESCから神経前駆細胞と神経細胞を生成するための方法を使用しています。このプロトコルは、上述した多くの基準を満たす：我々の手に分化効率は、長年にわたって非常に一貫しており、種々の細胞株は、スケールアップすることができ、またはダウン（我々が正常に96ウェルプレートから容器を用います直径15cmジシーズ）と使用するメディアは、明確に定義されています。プロセスは、（ドーパミン作動性ニューロン6のために、例えば、ShhのとFGF8）ニューロンのサブタイプの別個の種類の生成を誘導するために添加することができる分化のモニタリングおよびパターニング手がかりの様々なタイムラプス顕微鏡に適しています。 それにもかかわらず、このプロトコルの成功のアプリケーションにはいくつかの課題があります。重要な側面の一つは、メディアの入念な準備です。我々は常に商業選択肢の利用可能性にもかかわらず、社内メディアを準備します。使用サプリメントの一つ（N2; プロトコルを参照）は、標準的な市販のバージョンに比べて変更されています。最後に、この方法の成功した適用のために最も重要なステップの一つは、めっきに最適な細胞密度です。誘導信号（FGF4 11）のいずれかの自己分泌性質が最適viabilを可能にするのに十分な細胞が存在することを必要とするので、これは主に高すぎる密度分化における性と分化は、（おそらくLIF 12の自己分泌産生に起因する部分で）損なわれています。これは、培地調製および細胞のプレーティングの両方が最適な結果を保証するために慎重にかつ一貫して行われることが重要です。

<table><tbody><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 11320-074</td><td></td></tr><tr><td>ニューロベース中</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 21103-049</td><td></td></tr><tr><td>StemPro アキュターゼ細胞解離試薬</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>B-27 サプリメント、無血清</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ 17504-044</td><td></td></tr><tr><td>インスリン</td><td>シグマ</td><td>I6634</td><td>滅菌 0.01 M HCl</td></tr><tr><td>アポトランスフェリン</td><td>シグマ</td><td>T1147</td><td>滅菌水で再構成</td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>エタノールで再構成</td></tr><tr><td>プトレシン</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>滅菌水で再構成</td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td>ΣS5261</td><td></td><td>滅菌水で再構成します</td></tr><tr><td>牛アルブミン画分 V</td><td>Life Technologies</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>グルタミンは通常沈殿するので、使用前に完全に溶解していることを確認してください</td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル組織培養皿</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル組織培養皿</td><td>Thermo科学</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>96ウェル組織培養皿</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>白血病阻害因子</td>は<td>、スミス1991年組織培養法</td><td></td><td></td>ジャーナル</tr><tr><td>Tween-20</td>シ<td>グマ</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩(DAPI)</td><td>シグマ</td><td>D9542</td>光<td>から保護する</td></tr><tr><td>マウス抗&ベータ;III チューブリン IgG 抗体</td><td>コーヴァンス</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>蛍光標識抗マウス IgG 抗体</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>A31571</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 組織培養フラスコ</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td></td></tr></tbody></table>

無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

神経前駆細胞にマウス胚性幹細胞（ESC）の分化する能力は、神経の仕様を制御する機構の研究だけでなく、さらなる研究のために成熟した神経細胞型の生成を可能にします。このプロトコルでは、無血清、単層培養を用いて、神経前駆細胞へのESCの分化のための方法を説明します。この方法は効率的で、拡張可能であり、4内の70％の神経前駆細胞〜の産生をもたらす - 6日。これは、様々な条件下で成長させた様々な株からESCに適用することができます。神経前駆細胞は、機能性ニューロンおよびグリアへとさらに分化させ、または顕微鏡検査によって分析し、フローサイトメトリーまたは分子技術を流すことができます。分化過程をタイムラプス顕微鏡検査に適していると神経仕様プロセスを監視するためのレポーター系の使用と組み合わせることができます。私たちはBに処理を可能にするために、メディアの準備と細胞密度の最適化に関する詳細な指示を与えますEは最もESC株および細胞培養容器の様々な適用しました。

この実験では、神経分化を追跡するために、内因性SOX1-GFPレポーターと46C細胞ライン14、マウス胚性幹細胞を使用します。この細胞株、SOX1の発現は、神経前駆細胞のマーカーを使用することにより、緑色蛍光により検出することができます。密度をメッキすることは、神経分化を達成するための重要な要因です。マウス胚性幹細胞は、10,500 88500個の細胞/ cm 2で変化する異なる密度で6ウェルプレートに播種した。 図1Aは、6ウェルプレート中の異なるめっき密度によって達成分化効率を示しています。分化の6日目に、細胞を4％パラホルムアルデヒド中で固定し、ニューロンマーカーβIIIチューブリンについて染色しました。最適密度（10,500細胞/ cm 2）で、細胞は、神経前駆細胞およびニューロンに分化しました。これは、ニューロンマーカー、βIIIチューブリンに対するSOX1-GFPレポーターおよび免疫蛍光から緑色蛍光シグナルにより観察しました。見よWERメッキ密度が3日以内に細胞死をもたらしました。しかし、あまりにも高密度でプレーティング（&g...

このプロトコルは、無血清単層法を使用して胚性幹細胞から神経前駆細胞を生成する方法を詳細に説明しています。これらの前駆細胞は、成熟した神経細胞タイプの誘導や神経仕様のプロセスの研究に使用でき、化合物スクリーニングのためのマルチウェルフォーマットスケーリングに適しています。

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

本手順の全体的な目的は、無血清単層細胞培養においてマウス胚性幹細胞を神経系へと分化させることです。まず、培養容器をゼラチンでコーティングします。次に、胚性幹細胞を分化培地中で単一細胞懸濁液にし、適切な播種密度まで希釈します。最終ステップとして、細胞をgel ENCコートプレートに播種します。最終的に、免疫蛍光顕微鏡を用いて目的の神経マーカーを可視化し、分化の成功を確認します。一般的に、この手法に不慣れな方は、適切な密度での播種が良好な分化を達成するための鍵となるため、苦労することがあります。また、プレーティング密度に直接的および間接的に影響を与える要因がいくつかあります。細胞をプレーティングする前に、1%ゼラチンの分注量を37 °Cの恒温水槽で溶解するまで加温します。次に、ゼラチンを500 millilitersの温めたPBSと混合し、ゼラチンでコーティングしている間に、細胞培養容器の底面を表面が覆われる量だけの溶液で満たします。サブコンフルエントなマウス胚性幹細胞の培養物をPBSで2回洗浄します。次に、培養物に解離試薬1 mLを添加します。2〜5分後、容器をタッピングしてモノレイヤーを剥離させて単一細胞懸濁液にし、合計10 mLの培地および細胞解離試薬で培養物を回収します。細胞を50 mLのコニカルチューブに移し、遠心分離機で遠心分離します。その後、上清を注意深く吸引して取り除き、チューブの壁面でピペッティングして、あらかじめ温めておいたN2B27 10 mLでペレットを再懸濁します。気泡が発生しないように注意しながら細胞数を計測して濃度を記録し、表に従って、あらかじめ温めておいたN2B27を用いて、ウェルあたりの単位体積あたり適切な細胞数になるように再懸濁します。次に、培養容器からゼラチンを吸引し、容器を揺らさないように細胞を播種します。培養物を37 °C、5% carbon dioxideの加湿インキュベーターに入れ、1〜2日ごとに培地を交換してください。新鮮なN2 B27を添加すると、細胞は分化を開始し、4〜6日以内にSOX1の発現を示します。免疫蛍光イメージングのために細胞を染色します。培養液から分化培地を除去し、500 µLの4%パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。15分後、PBS-Tween 2 mLで細胞を2回洗浄し、透過処理を行います。その後、細胞を1時間インキュベートして、非特異的結合をブロックします。先ほど実演したように細胞を洗浄した後、血清を添加した1 mLのPBS Tweenに入れ、プレートロッカーで振盪させます。マウス抗β3 tubulin IgGを500 µL培養液に加え、4°Cのプレートロッカーで一晩インキュベートします。翌日、細胞を洗浄した後、蛍光標識した抗US IgG二次抗体中でサンプルを室温、遮光下にて1時間ロッキングしながらインキュベートします。再度細胞をリンスし、500 microlitersのDPIで5分間染色します。最後に、もう一度細胞を洗浄し、PBS tween中で4 degrees Celsiusにて最大2週間保存します。イメージングを行うまで培養します。本実験では、内因性SOX1 GFPレポーターを有するマウス胚性幹細胞を用い、神経分化を追跡しました。6日目に細胞を固定し、神経細胞マーカーであるbeta three tubulinで染色しました。最適な密度において、細胞は神経前駆細胞およびニューロンへと分化したが、より高い密度で播種した場合は、SOX1 GFP陽性細胞およびbeta III tubulin陽性細胞の数が減少した。また、細胞培養容器の容量も最適な播種密度に影響を与える。例えば、96ウェルプレートで培養する細胞には、その約10倍の細胞密度が必要である。6ウェル培養皿に細胞を播種し、最適および2つのコンフルエンス細胞密度に達するようにします。分化過程において、胚性幹細胞は徐々に形態を変化させます。例えば、これらの画像では、最適細胞密度で播種後1日から6日目までの細胞およびコロニーの形態を観察できます。4日目になると、SOX1 GFPレポーターからの緑色蛍光シグナルの出現によって、細胞が神経前駆細胞になり始めることがわかります。そして6日目までには、ほとんどの細胞がSOX1陽性となります。一部に非神経細胞が存在することは予想されますが、このビデオを視聴することで、単層細胞培養においてマウス胚性幹細胞の神経分化を誘導する方法を十分に理解できたはずです。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

我々は運動ニューロンにマウス胚性幹細胞のインビトロ分化の効率を改善するための新しいプロトコルを開発しました。として免疫組織化学的手法を用いてニューロンと運動ニューロンマーカーの発現によって証明機能を分化したES細胞は運動ニューロンを取得しました。...

運動ニューロンにマウス胚性幹細胞の効率的な分化

このビデオは、マウス胚性幹細胞から神経前駆細胞を生成するために無血清培地を使用するプロトコルを示しています。無血清培地に懸濁した所望の濃度の胚性幹細胞を、ゼラチンコーティングされたカバースリップに播種します。最適な細胞密度で、細胞は自己分泌シグナル伝達因子を産生し、無血清培地中の神経分化誘導因子とともに、胚性幹細胞の神経前駆細胞への分化を引き起こします。...

無血清単層培養における胚性幹細胞からの神経前駆細胞の生成

このビデオでは、マウス胚性幹細胞(mESC)から神経前駆細胞(NPC)をin...

マウス胚性幹細胞から神経前駆細胞を作製する技術

このビデオでは、神経前駆細胞をニューロンに分化させる細胞培養方法を紹介しました。成長因子を補充した栄養豊富な培地で細胞をインキュベートすることにより、前駆細胞は発達した軸索と樹状突起を持つニューロンに成熟しました。安定化剤は、細胞の生存率を確保し、分化プロセス全体を通じて酸化的損傷から保護します。...

神経前駆細胞のニューロンへの分化

このビデオは、胚性幹細胞を機能しているシナプスを持つニューロンのネットワーク集団に分化する技術を示しています。胚性幹細胞のニューロンへの分化、ニューロンネットワーク形成の誘導、およびネットワーク化されたニューロンによる培養の濃縮に関与するステップを概説しています。...

マウス胚性幹細胞のネットワーク化ニューロン集団への分化

胚培養に利用される血清は、特にシグナル伝達の相互作用を含む研究での実験の結果に影響を与えることができ、未知のコンポーネントが含まれています。ここでは、無血清酸素化培養系を利用し、16〜40時間培養妊娠中期のマウス胚が子宮内で発生中の胚に匹敵する形態的発展を示すことを示している。...

無血清全胚培養系で、マウス胚発生

我々は2人のまたは3次元の胚様体を生成するために、マウスの胚性幹細胞を使用するためのテクニックを説明します。私たちは、その後、レチノイン酸によって胚様体細胞の神経分化を誘導する方法を説明し、どのように前駆細胞マーカーの免疫蛍光およびイムノブロッティングによりそれらの分化の状態を分析します。...

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

E13マウス胚神経節隆起から顕微鏡下神経幹細胞の分離法を紹介します。...

マウス萌芽期の神経幹細胞の分離と培養

ここで提示するプロトコルは、ヒト胚性幹細胞の単細胞培養の生成とその後の神経前駆細胞への分化のためのプロトコルである。プロトコルは、シンプルで堅牢でスケーラブルで、薬物スクリーニングや再生医療用途に適しています。...

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

ここでは、低コストで使いやすい方法を確立し、胚性幹細胞からニューロンへの迅速かつ効率的な分化を導く方法を確立しました。この方法は、研究室間で普及に適しており、神経学的研究のための有用なツールとなり得る。...

インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

吊り下げドロップ法を用いて、マウス胚性幹細胞を神経細胞に分化する手順について説明する。また、RT-qPCR、免疫蛍光、RNA-seq、フローサイトメトリーを通して包括的なフェノミック解析を行っています。...

マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

学ぶマウス胚性幹細胞の無血清単層培養による神経前駆細胞への分化法。ゼラチンコーティング、適切な植え付け密度、免疫蛍光顕微鏡による確認を含む。この再現性の高いプロトコルは神経発生研究と化合物スクリーニングに適用可能です。

無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

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