Name: 反応性神経膠症のトリガインビボ前脳刺し損傷によって (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: 学ぶ マウス前脳刺し損傷による反応性神経膠症の誘導法。GFAP発現上昇と星状細胞増殖を観察し、脳損傷後の細胞応答と治療介入研究に有用な簡便なモデルを提供する。

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技術支援についてキャサリン・クラークに感謝します。A.D.R.G.は、5K01MH097957-03によって部分的に資金提供されています。

混合C57BL / 6バックグラウンド上の成体（3-4ヶ月齢）雄マウスは、このプロトコルで使用しました。動物は、12時間の明/暗サイクルで維持し、食物および水に自由にアクセスさせました。このプロトコルで実行されるすべての手順は、ドレクセル大学施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行いました。 1.手術領域の準備<ol><li>吸収パッドで全体の外科ベンチをカバーし、定位に隣接する手術器具を配置し、その後、70％エタノールで手術台を消毒。 </li><li>マニピュレータアームなし定位装置を設定します。定位の加熱パッドを配置し、37℃に設定してください。動物と加熱パッドとの間のペーパータオルの小片または外科パッドを配置することによって、動物の過熱を防ぎます。 </li><li>オートクレーブはさみを使用して、REAまで0.9％滅菌生理食塩水を含む滅菌ペトリ皿にオートクレーブゲルフォームの小片をカット使用するためにDY。 注意：オートクレーブ処理機器および無菌手術用消耗品を使用して滅菌作業環境を維持します。必要に応じて、10〜15秒間ビーズ滅菌器に浸漬することにより、動物の間で処置中または手術器具を再滅菌します。消毒するために、必要に応じて、70％エタノールで手を擦ることによって作業中は清潔な手袋を維持します。 </li></ol>外科2.プレッピングマウス<ol><li>ホームケージからマウスを削除し、（g）を量ります。 </li><li>場所イソフルラン誘導チャンバ内にマウスや麻酔の外科的平面、約3〜5分を誘導するために2〜5 L /分およびイソフルラン気化器に酸素を設定します。緩徐呼吸や固定化のために監視します。マウスが完全につま先ピンチ反射を使用して鎮静されていることを確認してください。 </li><li>マウスが完全に鎮静されると、イソフルランにチューブが取り付けられているノーズコーンに鼻を確保、定位フレームに配置します。外耳道に耳棒を挿入し、締め、頭が安定して確保します。 </li><li>耳にし、目の間から耳の後ろに耳から頭を剃ります。 </li><li> 、イソプロピルアルコール及びベタジンヨウ素溶液のワイプを交互に3回ずつ肌を殺菌。 </li><li>外科手術中に乾燥からそれらを防ぐために、両眼に人工涙液を適用します。 </li></ol> 3.手術手順<ol><li>つま先や尾をつまんで麻酔深度を監視します。応答がないとき、マウスは、適切な外科的な平面であり、呼吸がゆっくりとさえあります。 </li><li>ちょうどほぼ11番手術用メスの刃を使用して、単一の、しっかりした動きで耳の間に、目の後ろから矢状皮膚切開を行います。脇の皮膚を移動し、止血剤で右側をクリップ。 </li><li> 11番メスと綿の鈍い側を使用して、上層膜の明確な頭蓋骨は、アプリケーターをひっくり返しました。必要に応じて、0.9％の食塩水に浸した綿先端のアプリケーターで頭蓋骨を拭きます。完全に乾燥することができます。 </li><li>米国小さ ​​な定規をる、1ミリメートルの冠状縫合の尾、および恒久的なマーカーと矢状縫合（ 図1）に対して横1ミリメートル、で開頭の左端に開頭術の前縁をマーク。そして、矢状および冠状縫合、それぞれ（ 図1）から4ミリメートルで開頭術の権利と尾側の境界をマークします。 </li><li> 0.5ミリメートルドリルビットを使用して、恒久的なマーカーアウトライン次ゆっくり穿孔することによって開頭を作るために開始します。完全に頭蓋骨を突破しないように注意してください。を押して、優しく第5鉗子で頭頂骨の孤立片に、弱さの領域は、圧力に道を譲るだろう。薄くなった骨が周囲全体に十分に弱い場合、骨片を除去するための準備ができています。 注：調査員が困難一体に骨を除去するが発生した場合、これは、骨が十分に掘削時に間引かれなかったことを示唆しています。 facilita以降の動物で、さらに頭蓋骨をドリル考えてみましょう骨片を容易に除去するTE。 </li><li> 23 G針を装着した10mlシリンジを用いて、単離された骨と掘削面積を浸して0.9％生理食塩水を少量を適用します。 </li><li>定位機器にマニピュレータアームを取り付けます。吻方面した刃の鋭い側とプローブホルダに新しい11番手術用メスの刃を取り付けます。 注：吻側および尾側の組織が刃の鋭く尖っていないエッジを経験しているが、それぞれ、貫通損傷によって誘発される機械的な損傷は、病変の程度全体に匹敵します。私たちは、頭側と尾部の間、GFAP発現または増殖のアップレギュレーションを含む反応性神経膠症の主な機能にはかなりの違いを観察していません。 </li><li>邪魔にならないようにマニピュレータアームを保ち、慎重5/45角度のついたピンセットを用いて、単離された骨を持ち上げます。 FUL 1に残さ骨の一部をやってのけるレバレッジを使用して、孤立した骨やリフトの側面に鉗子の先端部を挿入Lの動き。 注：脳を刺すか、頭蓋骨の下に硬膜を乱さないように注意してください。 </li><li>浸した吸収性ゲルフォームの小片を取り、乾燥からそれを防止し、存在する可能性のある血液を吸収するために覆われていない脳に置きます。 </li><li>ゲルフォームが適所に配置されると、所定の位置にマニピュレータアームを揺動し、ゲルフォーム上に開頭の中央にブレードを調整します。ゲルフォームを取り外し、先端が硬膜を穿刺せずに硬膜に接触​​するまで、ブレードを下げます。定位の垂直アームのバーニアスケールを使用してマーク背/腹座標。 </li><li>マニピュレータアームを使用して、ゆっくりと脳にブレード正確に3ミリメートルを下げます。これは、マニピュレータアームにバーニヤ目盛りを使用することによって達成されます。ブレードは5〜10秒のための場所に滞在することができます。ブレードはopposiに移動する前に、開頭の吻側および尾側の境界に到達することを可能にする3回尾側するブレード取付吻側に定位アームを移動TE終了。 注：硬膜は、ブレードを挿入する前に除去されていません。厚さ7〜80μmであるラットの硬膜とは対照的に、マウスの硬膜がかなり薄くなっている（わずか数細胞層の厚さ）、挿入時のメスの刃にかなりの抵抗を生成しません。各動物が一貫性の損傷を受けることを確実にするために、各マウスのための新しい手術用メスの刃を使用してください。 </li><li>ゆっくりと脳からブレードを取り外し、定位アームを持ち上げます。ブレードを除去した後、すぐに余分な血液や体液を吸収するために、脳の表面にゲルフォームの別の部分を配置します。 </li><li>一方、定位アームを取り外し、11番手術用メスの刃を処分。出血が停止した後、ゲルフォームを削除します。 </li><li>このようなethilonまたはプロレンとして、非吸収性縫合糸で皮膚を縫合することによって傷を閉じます。縫合糸は、手術後9-10日に削除する必要があります。 </li><li>そのホームケージにマウスを返し、マウスがheatinにゆっくりと回復することができます苦痛の兆候がないかのGパッドとモニター。イソフルラン誘発性の麻酔からの回復は、典型的には、イソフルランから除去した後、2〜5分以内に発生します。それは胸骨recumbancyを取り戻したまで無人動物を放置しないでください。 </li><li>水和を確実にするために乳酸リンゲル液の皮下0.5〜1 mlで管理します。 </li></ol> 4.手術後のケア<ol><li>密接植民地に戻る前に麻酔から回復するまで、手術後の動物を監視します。 <ol><li> 、術後の痛みや不快感を軽減直ちに手順に従って、腹腔内注射により0.05〜0.1ミリグラム/ kgのブプレノルフィンを投与すること。 </li><li>このような制限された運動、グルーミングの欠如、または体重減少などの苦痛の重症徴候について術後2〜3日間動物を観察します。苦痛のこれらの兆候のいずれかを実証する動物を安楽死させると研究から取り外します。 </li></ol></li><li>損傷組織の病理組織学的検査を検討するために、スタンにより動物を安楽死させます準の心臓内灌流。 <ol><li>簡単に述べると、ケタミン/キシラジンの過剰摂取で動物を麻酔し、心臓内の0.9％NaCl 15〜20ミリリットルで灌流、または肝臓、実験の終了時に4％パラホルムアルデヒドの60ミリリットル、続いて血液のクリアされるまで。 </li></ol></li><li> 30％ショ糖溶液に移す前に、4％パラホルムアルデヒド中で2〜4時間、脳とポストフィックスを分析。セクション40〜60ミクロンで、クライオスタットの脳、および標準的な組織学的または免疫組織化学的手順による処理、またはガルシア8,9に記載されているように。 </li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

それは、頭蓋骨や、基礎となる硬膜を掘削中に損傷していないことが重要です。頭蓋骨がパンクされていないことを確認するために掘削しながら、軽い圧力を使用してください。硬膜が骨にリフトオフされていないことを確認するために頭蓋骨片を持ち上げながら加えて、注意が必要です。 前脳刺し損傷はこちらCNSへの浸透傷害モデルを説明しました。このようなFPIやCCIなどTBIモデルよりも少ない臨床的に翻訳可能なものの、前脳刺し病変モデルは、様々な生化学を調査することを目的とした研究、携帯電話、または個別のCNS傷害によってトリガー分子事象の広い範囲のための有用なツールとして機能します。認知障害は、3週間の両側性スタブ11損傷後、ラットで報告されているが、片側刺し病変モデルことに留意すべきである、ここに記載されるように、損傷に対する細胞応答に対処する研究に最適です。このような再などの様々な神経病理学的プロセスの基本的な側面、アクティブグリオーシスおよび瘢痕形成が容易に観察され、研究され得ます。拡散し広範囲の神経病理を生成FPIまたはCCI、ローカライズされたグリア活性化および病理学と...

負傷した中枢神経系を治療するための成功した治療法を開発するための主要な課題は、トラウマによって引き起こされる複雑な多細胞事象の不完全な理解です。反応性アストロサイトは、新しい治療法の有望な標的としてますます認識されています1。歴史的には神経修復に敵対的であると考えられてきたが、反応性アストロサイトは、現在では、炎症過程の減弱や二次損傷や神経変性の制限など、複雑で多細胞的な神経保護反応の重要な構成要素として認識されている2-6。反応性神経膠症の神経病理学的特徴は長い間明確に定義されてきましたが、反応性神経膠症を調節する細胞および分子メカニズム、およびさまざまな下流の結果は、まだ十分に理解されていません。反応性神経膠症を引き起こすメカニズムと、それに続く細胞および分子イベントを理解することは、反応性神経膠症の神経保護特性を促進し、有害な影響を弱めることを目指す戦略を開発するための重要なステップです。
ここでは、刺し傷を使用して成体マウスの前脳に重度の反応性星膠症を誘発する方法を実演します。制御皮質衝撃(CCI)や体液打楽器損傷(FPI)などの他の外傷性脳損傷(TBI)モデルが損傷を引き起こすために特殊な機器を必要とするのとは対照的に、前脳刺し傷は頭部を安定させるための定位固定装置とNo.11メスブレードのみを必要とします。したがって、前脳刺し傷モデルでは、FPIまたはCCI損傷の作成に必要な特殊なデバイスにアクセスできない幅広い検査室で、より広くアクセス可能です。ここで説明する方法により、研究者は信頼性と再現性を持って堅牢な神経膠症応答をトリガーし、その後の細胞および分子イベントを調査できます。手術から回復すると、前脳刺し傷を負った動物は、専門的な治療を必要とせずに長期間生存することができ、急性、中期、または慢性の研究のためにコロニーに戻すことができます。TBIのFPIモデルやCCIモデルよりも臨床的に翻訳しにくいですが、刺し傷によって生じる前脳病変は、反応性神経膠症や中枢神経系への外傷後の他の神経病理学的事象の根底にある基本的な生物学的メカニズムを調査するための単純でありながら有用な実験モデルとして機能します。

<table><tbody><tr><td>Stereotax</td><td>Harvard Apparatus</td><td>726049</td><td></td></tr><tr><td>高速マイクロドリル</td><td>ハーバードApparatus</td><td>724950</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼メスブレード、#11</td><td>MedVet</td><td>JOR581S</td><td></td></tr><tr><td>5/45角度付き鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11251-35</td><td></td></tr>ゲル<tr><td>フォームスポンジ12 cm x 7 mm</td><td>Fisher</td><td>NC9841478</td><td></td></tr><tr><td>Rb anti-GFAP</td><td>ダコ</td><td>&nbsp;Z033429-2</td><td>希釈 - 1:20,000 (明視野); 1:1,000 (蛍光)</td></tr><tr><td>Shp anti-BrdU</td><td></td><td>Abcam ab1893</td><td>希釈 - 1:20,000 (明視野); 1:500 (蛍光)</td></tr><tr><td>ビオチン化ヤギ抗ウサギ</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000&nbsp;</td><td>希釈 - 1:400(明視野)</td></tr><tr><td>ビオチン化ウサギ抗羊</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-6000</td><td>希釈 - 1:400 (明視野)</td></tr><tr><td>Alexafluor 488 ヤギ抗ウサギ</td><td>Life Technologies</td><td>A-11008</td><td>希釈 - 1:400 (明視野)</td></tr><tr><td>Alexafluor 568 ロバ抗羊</td><td>Life Technologies</td><td>A-21099</td><td>希釈 - 1:1,000 (蛍光)</td></tr><tr><td>DAPI Nucleic Acid Stain</td><td>Life Technologies</td><td>D3571</td><td>希釈率 - 1:1,000 (蛍光)</td></tr><tr><td>Cresyl Violet Acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td>希釈率 - 1% (明視野)</td></tr></tbody></table>

反応性神経膠症のトリガ<em&gt;インビボ</em&gt;前脳刺し損傷によって

Triggering Reactive Gliosis In Vivo by a Forebrain Stab Injury

中枢神経系の損傷後、アストロサイトは広範囲の生化学的、形態学的、分子的変化を経験します。これらは総称して反応性アストログリオーシスと呼ばれます。反応性アストロサイトは、炎症作用と防御作用の両方を発揮し、それぞれ神経修復を阻害および促進します。反応性アストリオーシスの多様な機能特性の根底にあるメカニズムはよく理解されていません。これらのメカニズムをより深く理解することは、損傷した中枢神経系を治療するための治療戦略を開発するために重要です。ここでは、前脳刺し傷病変を用いて成体マウスの前脳に反応性星膠症を誘発する方法を実演します。この病変モデルはシンプルで信頼性が高く、脳定位固定装置とメスの刃だけで損傷を生じます。前脳の損傷モデルとしての刺し傷病変の使用は十分に確立されており、ニューロンの変性、神経炎症、血液脳関門(BBB)の破壊など、幅広い神経病理学的結果に対処する研究に適しています。したがって、前脳刺傷モデルは、外傷に対するCNSの反応に関する幅広い研究に適用できる強力なツールとして機能します。

この処置を受けた動物は、専門的な術後のケアを必要としないので、短期または長期の時間の生存期間は容易に損傷後の急性または慢性の病状を調査する必要性に応じて、試験に組み込まれています。このようなソーマのGFAPおよび肥大のアップレギュレーションのような反応性神経膠症の主要な特徴は、早ければ、損傷後2〜3日のように観察することができます。反応性星状細胞のための増殖のピーク位相は、傷害10次の日3-5中です。以下に示す代表的な結果は7日早く刺し傷病変を受けた動物からのものです。 前脳刺し損傷後の前脳の一般的な形態および細胞構築はニッスル染色（ 図2）によって可視化することができます。ブレードトラックが病変の中心を通して最も顕著であるが、破壊された皮質細胞構築は、損傷を受けたTの吻側および尾側の程度を明らかに問題。反応性星状細胞は、GFAP（ 図3）のために免疫組織化学によって観察することができます。多くの皮質星状細胞は、傷害の非存在下でのGFAPの免疫組織化学的に検出可能なレベルを示さないことに注意し...

この記事では、成体マウスで前脳刺し傷を引き起こすための詳細なプロトコルについて説明しています。刺し傷は、重度の反応性神経膠症とグリア瘢痕形成を誘発し、その後、標準的な免疫組織化学法で検査することができます。

Following injury to the CNS, astrocytes undergo a broad range of biochemical, morphological, and molecular changes collectively referred to as reactive ...

本実験の全体的な目的は、成マウスの前脳に機械的病変を作成して反応性アストログリオーシスを誘発し、反応性グリオーシスの根底にある細胞および分子プロセスを調査することです。これは、開頭術を行い、その後、滅菌済みのメス刃を前脳に深さと長さともに3〜4 mm挿入して病変を作成することで達成されます。動物は急性または慢性のタイムポイントまで生存させることができ、実験の終了時に組織を採取します。次に、組織を組織学的、生化学的、または分子生物学的アッセイに供し、反応性アストログリオーシスを駆動する分子および細胞プロセスを解析することができます。結果として、GFAPの劇的な発現上昇と反応性アストロサイトの増殖に基づき、この処置が強力な反応性グリオーシスを誘発することが示されます。流体パーカッション損傷や制御皮質衝撃などの他の手法と比較した本手法の主な利点は、追加の装置を必要とせず、反応性グリオーシスを容易に誘発し、研究できる点にあります。この手順を開始するには、手術台を70% ethanolで消毒し、手術ベンチ全体を吸収パッドで覆い、手術器具を手術台の上に配置します。次に、マニピュレーターアームを装着せずに脳定位固定装置をセットアップします。ヒーティングパッドを脳定位固定装置のフレームに設置し、37 °Cに設定します。ヒートパッドの上に少量のペーパータオルまたはサージカルパッドを敷き、動物が過熱されないようにします。次に、使用するまで、0.9%滅菌生理食塩水を入れた滅菌ペトリ皿に、ゲルフォームを小さく切って入れておきます。このステップで、十分に鎮静させたマウスを脳定位固定装置にセットします。ノーズコーンに鼻を固定します。ノーズコーンはイソフルランに接続されています。次に、イヤーバーを締め、頭部が安定していることを確認します。目の高さから耳の高さまで頭部の毛を剃ります。次に、イソプロピルアルコールとベタジンヨード溶液を用いて、皮膚を3回交互に擦って滅菌します。その後、眼の乾燥を防ぐために両眼に軟膏を塗布します。動物の趾（あしゆび）または尾をつまみ、麻酔深度を確認してください。反応がなく、呼吸が緩やかになった状態で、マウスが適切な手術麻酔深度にあることが確認できたら、眼の直後から両耳の中間点付近まで、一度のしっかりとした切開で矢状方向の皮膚切開を行います。皮膚を脇に寄せ、顕微鏡下で止血鉗子を用いて右側を固定します。メスの鈍い側と綿棒を使用して、頭蓋骨上の被膜を除去します。次に、0.9%生理食塩水に浸した綿棒で頭蓋骨を洗浄し、完全に乾燥させます。小さな定規と油性マーカーを用いて、冠状縫合から1 mm中隔側に開頭術の前縁を、また正中縫合から1 mm外側に開頭術の左縁をマークします。続いて、正中縫合および冠状縫合からそれぞれ4 mmの位置に、開頭術の右端および後縁の境界をマークします

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JoVE Journal

Medicine

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このビデオは、頭蓋骨の露出と脳病変の作成を含む、マウスの皮質刺し傷の手順を示しています。アストロサイトの神経保護反応である反応性アストログリオーシスを誘導し、中枢神経系の外傷、炎症、修復メカニズムを研究します。...

反応性星膠症を誘発するためのマウスモデルにおける皮質刺し傷の発生

中枢神経系の再生および修復を調査するために、ショウジョウバエの幼虫腹神経索を用いた傷害のパラダイムが記載されている。意図的に開発されたソフトウェアと遺伝との定量的な分析と組み合わせタイムラプスおよび固定標本でレーザー走査共焦点顕微鏡法、続いて刺すことは中枢神経系の再生および修復の分子メカニズムを解明するために使用されます。...

中枢神経系の修復を調査するために傷害パラダイム<em&gt;ショウジョウバエ</em

急性脳外傷は現在まで適切な治療を持っていない重傷です。多光子顕微鏡は、縦方向に急性脳外傷開発のプロセスを研究し、げっ歯類における治療的戦略をプロービングできます。脳のin vivo二光子イメージングに師事急性脳外傷の二つのモデルは、このプロトコルで実証されています。...

縦二光子イメージングに続いてマウスの急性脳外傷

表現型の野生型アストロサイトと神経幹細胞は、floxed、条件付き発癌性対立遺伝子で操作され、ウイルスCre媒介組換えを介して形質転換されたマウスから採取され、同系で免疫能力のある同腹仔の脳に形質転換細胞を同所性注射することにより、in vitroおよびin...

モデル星細胞腫発症機序体外とインビボ皮質アストロサイトまたは条件付き、遺伝子改変マウスから神経幹細胞を使用した

二光子生体内イメージングは、背柱外傷性脊髄挫傷を負った骨髄キメラ動物の天然組織環境における脊髄の異なる細胞タイプ間の相互作用を調査するために使用することができます。...

マウス背側列のクラッシュ損傷におけるミクログリアおよびマクロファージと軸索の相互作用の生体内イメージング

この体系的なプロトコルは、反復的な軽度の外傷性脳損傷後の心的外傷後てんかんの新しい動物モデルを記述する。最初の部分は、変更された体重減少モデルを使用して外傷性脳損傷誘導のためのステップを詳述する。第2部では、単一および多チャンネルの脳波データ集録システムの外科的アプローチについて説明します。...

反復性びまん性外傷性脳損傷のマウスモデルにおける心的外傷後てんかんの誘導

我々は、頭蓋骨に安定させることができる先端に曲がった針を採用するインタセラセナーナル注射を記述し、したがって、基礎となるパレンチマへの損傷のリスクを排除する。このアプローチは、レプトメニンゲ細胞の遺伝的運命マッピングおよび操作や脳脊髄液の動きを追跡するために使用することができます。...

インタビセナーリナーリ注射によるレプトメニンゲ細胞改変の誘導

プロトコルは、マウスモデルにおける軽度の外傷性脳損傷について説明しています。特に、軽度の正中線閉鎖頭部外傷を誘発するための段階的なプロトコルおよび動物モデルの特徴付けが完全に説明されている。...

マウスにおける軽度外傷性脳損傷の電磁制御クローズドヘッドモデル

この研究は、マウスへの反復性外傷性脳損傷の送達と、2光子顕微鏡を使用したニューロン発現EGFPのその後の生体内イメージングのための頭蓋窓の同時移植を示しています。...

2光子顕微鏡を用いた閉鎖頭蓋外傷性脳損傷マウスおよび頭蓋窓における蛍光タンパク質発現の生体内イメージング

簡略化された外傷性脳損傷(TBI)モデルは、治療アプローチの開発を促進しました。このプロトコルは、針を使用して刺し傷マウス皮質の作成を概説し、出血と炎症の分析を可能にします。刺し傷TBIマウスモデルは、特殊な機器を必要とせずに実行できるという利点があります。...

外傷性脳損傷における出血と炎症を研究するための刺し傷マウスモデル

ここでは、マウスの眼から網膜を分離し、 ex vivo での長時間の実験を行うための詳細な方法論を提供します。このプロトコルは、生体組織中に網膜グリア をin situ...

マウス網膜におけるグリア相互作用を研究するための ex vivo 外植片モデル

学ぶ マウス前脳刺し損傷による反応性神経膠症の誘導法。GFAP発現上昇と星状細胞増殖を観察し、脳損傷後の細胞応答と治療介入研究に有用な簡便なモデルを提供する。

反応性神経膠症のトリガ

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