Name: 水生微生物Metaproteomicsワークフロー：細胞からのトリプシンペプチドのタンデム質量分析ベースの分析に適し (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 学ぶ 海水微生物バイオマスからのタンデム質量分析ベースのメタプロテオミクスワークフロー。トリプシン消化とLC-MS/MSを用いてタンパク質とDNAを同時抽出し、海洋微生物生態系の機能解析を実現します。

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著者は、ナノLC MS/MSのサンプル調製に関する専門知識とアドバイスを提供してくださったMarcos Di Falco氏と、LC MS/MS分析のためのレジャイナ大学のZoran Minic博士に感謝したいと思います。 この研究は、NSERC(DG402214-2011)およびCRC(950-221184)の資金提供によって支援されました。DCは、Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable SystemsとFQRNTの支援を受けました。

1.試薬を準備<ol><li> 0.1 MのTris-HCl pH7.5で、5％グリセロール、10mMのEDTA及び1％SDS：SDS抽出溶液を調製します。 4℃で0.22μmフィルターとストアを使用してフィルター滅菌します。 </li><li>ポリアクリルアミドゲルに必要な株式試薬を準備します。 <ol><li> 1.5 Mトリス塩酸pHが8.8を準備します。室温で0.22μmフィルターとストアを使用してフィルター滅菌します。 </li><li> 0.5 Mトリス塩酸pHは6.8。室温で0.22μmフィルターとストアを使用してフィルター滅菌します。 </li><li> 10％SDSを準備します。フィルターは、室温で0.22μmフィルターとストアを使用して滅菌します。 </li></ol></li><li>ゲル内トリプシン消化およびペプチド抽出に必要なソリューションを準備します。 <ol><li> 100mMの重炭酸アンモニウムを準備します。 4℃で0.22μmフィルターとストアを使用してフィルター滅菌します。 </li><li> 1 M DTTストックを準備します。 -80℃で100mMの重炭酸アンモニウムとストアに懸濁しました。 </li><li> 550 mMのヨードアセトアミドストックを準備します。に懸濁100 mMの-80℃での重炭酸アンモニウムとストア。 </li><li> 100 ngの/μlのトリプシンストックを準備します。 -80℃で1.5 mlマイクロチューブに60μlのアリコートとストア。 </li><li> 1％ギ酸、2％アセトニトリル：抽出液を準備します。 </li><li> 5％アセトニトリルおよび0.1％ギ酸：再懸濁溶液を調製します。 </li></ol></li></ol> 2. RNA安定化策に保存された細胞とカートリッジフィルターユニットで細胞溶解を実行<ol><li>カートリッジフィルターユニット（1.5 ml）でのフィルタのルアーロック端部に取り付けられた60 mlの注射器を使用して、2 mlのマイクロ遠心チューブにRNA安定化溶液を追い出します。 </li><li>任意の細胞破片をペレットに17000×gで10分間、2 mlのマイクロ遠心チューブを遠心。ステップ2.3でフィルターが目詰まりしないようにするためです。 </li><li>凍結/ THAから溶解した細胞に由来する任意のタンパク質を捕捉するために、10K超遠心フィルターユニットに上清を移しますサンプルのワットペレットを廃棄しないでください。なお、ステップ2.5で使用されます。 30分間、または体積が約600μlに減少するまで、3,270×gで超遠心フィルターユニットの遠心分離を行います。 </li><li> P10チップの先端を溶融し、先端の開口端とカートリッジフィルターユニットの非ルアーロック側を遮断します。これには、抽出緩衝液とバイオマスがステップ2.5から2.7の間に脱出しないことを保証します。 </li><li> 1ミリリットルのSDS抽出液中にペレットを中断し、元のカートリッジフィルターユニットにそれをピペット。カートリッジフィルターユニットにピペットする最も簡単な方法は、P1000の先端にP200チップをスタックし、ピペッティングのために、この二重のヒントを使用することです。 </li><li>総容積が約2mlとなるようにカートリッジフィルターユニットにSDS抽出液1mlを添加し、ハイブリダイゼーションオーブン中で回転させながら室温で10分間インキュベートします。 3しわくちゃラボを50mlコニカルチューブの底にワイプ置きます。閉じたカートリッジフィルター部の両端をパラフィルム50 mlのチューブにカートリッジフィルターユニットを置きます。蓋を閉じて、ハイブリダイゼーションオーブンにチューブを入れます。 </li><li> 10分の場所Sterivex後発泡フローターでフィルタとルアーロック端に5ミリリットルの注射器で固定します。フロート、15分間95℃の水浴中でインキュベートします。 </li><li>クールカートリッジフィルターユニットをしようとする（ステップ2.6のように）、室温で1時間回転します。 </li><li> （ステップ2.3）前と同じ超遠心フィルターユニットに60 mlシリンジにフィルタのうちSDS抽出液/細胞溶解物を放出します。カートリッジフィルターユニットに新鮮SDS抽出液1mlを加え、手で30秒間混合し、60 mlの注射器を用いて超遠心フィルターユニットに追い出します。これは、すべてのタンパク質が除去されていることを確認するためにカートリッジフィルターユニットを洗浄することです。 </li><li> 3,270×gでまたはフィルタユニット内の容積が600未満μLになるまで、45分間超遠心フィルターユニットに遠心分離を行い。 </li><li>フロースルーを捨て、新鮮なSDS抽出液を補充して超遠心フィルターユニットを。 </li><li>遠心3270×gでさらに45分間、フィルタユニット。 </li><li>繰り返し二回より2.11と2.12を繰り返します。超遠心フィルターユニット内の最終容量は、最終的なスピンの最後に最も600μlのであることを確認します。 </li><li>この時点で、二つに濃縮物を分割します。一つの画分は、DNA沈殿および他のタンパク質のための沈殿のために使用されます。 注：分別量をろ過したバイオマス量や製品の使用目的によって異なります。私たちのケースでは、DNA沈殿に向かって10％とタンパク質沈殿に向かって90％に濃縮物を分割します。 </li></ol> 3.タンパク質の沈殿<ol><li> 10秒のための濃縮物および渦の一冊にアセトン（50:50）：4倍量のメタノールを追加します。 -20℃で一晩インキュベートします。 </li><li> 30分間17000×gでスピンダウン。上清を除去そしてペレットを1時間（または乾燥するまで）のためにスピードバックで乾燥（目に見えないかもしれない）しましょう​​。 注意：これはそれが困難な再懸濁するために行うことができるようにオーバーペレットを乾燥させないでください。 </li><li> SDS抽出溶液25μlにペレットを一時停止します。その後、ピペッティングにより再懸濁一時間座ってみましょう。 </li><li>タンパク質アッセイキットおよび製造業者の指示に従って用いてタンパク質を定量化します。 </li></ol> 4. DNAを沈殿<ol><li> 500μlのマークまで、DNA沈殿のために使用される濃縮液画分をSDS-抽出溶液を加えます。このステップは、単にそれが簡単で動作するようになって、溶液の体積を増加させることです。 </li><li> 10秒間ボルテックス（例えばMPCタンパク質沈殿試薬として）タンパク質沈殿試薬の0.583ボリュームを追加します。あなたは、白色の沈殿物フォームが表示されるはずです。 注：我々はまた、フェノール使用している：クロロホルムDNA抽出法を、それが低いボリュームにより困難です。我々は、使用してより優れたDNA収量を得ましたMPCタンパク質沈殿試薬。 </li><li> 17000×gで遠心分離し、10分間、4℃。 </li><li>さらに1.5 mlのマイクロ遠心チューブに上清を移し、イソプロパノール0.95ボリュームを追加します。 30〜40回転倒。 </li><li>最大速度で4℃で10分間遠心。 </li><li>慎重にデカントし、上清を捨てます。 </li><li> 70％エタノール750μlので二回洗浄します。 </li><li>空気乾燥をさせた後、ピペッティングによりできるだけ多くのエタノールを除去します。 注意：これはそれが困難な再懸濁するために行うことができるようにオーバーするDNAを乾燥させないでください。 </li><li>低TEバッファー、pH 8（10 mMトリス塩酸、0.1mMのEDTA）25μlの再懸濁。 </li><li>二本鎖DNAアッセイキット及び製造業者の指示を用いてDNAを定量化します。その品質を確認するために、DNAの3μLにアガロースゲル（1％）電気泳動を行います。 </li></ol> 5. SDS-PAGEタンパク質のゲル<ol><li>サンプルバッファー（950μlのレムリ試料緩衝液および50μlのβメルカプトエタノール）を準備します。&lt;/ LI&gt; <li> 15μgのタンパク質に対応する量、またはサンプル緩衝液の等体積の20μLの最大を追加し、4分間沸騰。 SDS-PAGEを行うことができるまで、サンプルは現在-80℃で保存することができます。 </li><li> 5％アクリルアミドスタッキングゲルを有する10％アクリルアミド分離ゲルを準備します。 </li><li>サンプルおよびタンパク質ラダーの4μlのゲルをロードします。 250 kDaのラダーマーカーはちょうど分離ゲルに達するまで一定の120 Vでゲルを実行します。 </li><li>製造者の指示に従って染色ベースのクマシーを用いてゲルを染色。 </li></ol> 6.ゲル内トリプシン消化し、ペプチドの抽出注：6.10までここからすべてのステップは、汚染を最小限にするために生物学的安全キャビネット内で実行されます。 <ol><li>各レーンのための10 kDaのラダーマークの下に余分なゲルを切り取ります。各レーンは、個別MS / MSで分析します。表面積を増加させ、すべてのsquaを配置するために1ミリメートル×1ミリメートルの正方形の中に各レーンをカット低結合マイクロ遠心チューブにレーンからのres。全てのレーンのためにこれを繰り返します。 （1％酢酸を乾燥し、切断することが困難になってからゲルを防止するために使用することができます）。 注：汚染を最小化することは、この段階で重要であるので、ゲルスライスを、ゲルを作るために使用されるガラスSDS-PAGEゲル上で金型生物学的安全キャビネットの中で行われます。 </li><li>脱染色<ol><li>各低結合管、近くにキャップ内に100mMの重炭酸アンモニウムの50μLを分注し、37℃で10分間インキュベートします。 </li><li>アセトニトリル、近いキャップの50μLを分注し、37℃で5分間インキュベートします。 </li><li>吸引し、150μlのを捨てます。 </li><li>繰り返しは6.2.1と6.2.2を繰り返します。 </li><li>吸引し、95μLを破棄します。 </li></ol></li><li>脱水<ol><li> 50μlのアセトニトリル、近くにキャップを分注し、5分待ってください。吸引し、45μLを破棄し、10分待ってください。 </li></ol></li><li>削減<ol><li> 100 mMのAMMで希釈した50μlのDTT（10 mMのを、分注オニウム重炭酸塩）、近くにキャップし、37℃で30分を待ちます。 </li></ol></li><li>アルキル化<ol><li> 50μlのヨードアセトアミド（100mMの重炭酸アンモニウムで希釈した55 mMの、）、近くにキャップを分注し、37℃で20分を待ちます。 </li><li>アセトニトリル、近いキャップの100μLを分注し、37℃で5分間インキュベートします。吸引し、195μ​​Lを破棄します。 </li></ol></li><li>ウォッシュ<ol><li> 50μlの重炭酸アンモニウム、クローズキャップを分配し、37℃で10分間インキュベートします。 </li><li>アセトニトリル、近いキャップの50μLを分注し、37℃で5分間インキュベートします。吸引し、120μLを破棄します。 </li></ol></li><li>脱水<ol><li> 50μlのアセトニトリル、近くにキャップを分注し、5分待ってください。吸引し、45μLを破棄します。 </li><li>アセトニトリル50μLを分注し、5分待ってください。 </li><li>吸引し、75μLを破棄し、5分待ってください。 </li></ol></li><li>消化<ol><li> 6 NG /μlのトリプシン（Uの25〜30μLを分注しntilすべてのゲル断片）が覆われています。閉じるキャップし、室温で30分待ちます。 </li><li> 37℃で一晩（4.5時間以上）インキュベートします。 </li><li>室温で30分間座ってみましょう。 </li></ol></li><li>抽出およびペプチド転送<ol><li>抽出溶液の30μLを分注し、氷上で30分間、蓋をカバーしています。 </li><li>吸引し30μlの、新しいラベル低結合チューブで吸引量を分注します。 </li><li> （ゲルと）元の管に抽出溶液12μlのアセトニトリルの12μLを分注します。閉じるキャップと氷上で30分間インキュベートします。 </li><li>吸引し、新しいチューブに15μlの預金。 </li><li>ステップ（6.9.3および6.9.4）を繰り返します。 </li></ol></li><li>乾燥するまでスピードバックで新しいチューブを置きます。 </li><li>再懸濁溶液50μlで再懸濁します。再懸濁し、10分間培地上で渦。 </li><li>ナノナノ/ LCバイアルまたは適切な96ウェルプレートのいずれかにピペットペプチド溶液/ LCMS / MSの仕事。 </li></ol>

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<li>Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -J., Weber, N., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+environmental+sequences+using+MEGAN4%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4.</a> Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).</li>
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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

サンプル保存はmetaproteomic研究の鍵であると前作は、RNA安定化溶液は、前タンパク質抽出28に細胞を収納するのに便利記憶バッファであることを実証しました。理想的には、サンプルは33,34を取り扱い中のタンパク質発現の変化を打ち消すために、その場で保持されることになります。実際には、 その場でサンプリングし、固定技術が船配備楽器による自律的な収集とサンプルの保存を可能にする、開発されています。しかし、これらの技術へのアクセスは、常に現実的ではありません。そうでない一般的なケースでは、サンプルは採取後できるだけ早く保護されるべきです。 ここでは、一般的に水生微生物学で使用されたカートリッジフィルターユニット上に収集RNA安定化溶液格納されている細胞からタンパク質を抽出するためのプロトコルを提示します。プロトコルは、PRに続いて、SDS-溶解液および加熱を用いて細胞溶解を含みます必要に応じて脱塩工程として倍増超遠心フィルターユニットを使用してotein濃縮工程。これは、濃縮および脱塩ステップは見過...

微生物は、ユビキタスであり、地球の物質循環1に重要な役割を果たしています。現在、微生物群集の構造と機能を特徴づけるために利用可能な多数の分子アプローチがあります。 4 -最も一般的な16S rRNA遺伝子配列の分析は、環境DNA 2からPCR増幅されます。 16S rRNA遺伝子解析の欠点は、それが唯一の代謝機能にはほとんどの情報を、系統発生的アイデンティティと社会構造についての情報を提供することです。これとは対照的に、このようなメタゲノミクス、metatranscriptomicsとmetaproteomicsとしてのアプローチは、コミュニティの構造と代謝に​​関する情報を提供しています。 8 -メタゲノミクス、または生物の集合体の遺伝子含有量の分析は、社会5の構造と機能の可能性についての情報を提供します。強力なものの、この機能の可能性は、代謝に対応しない場合があります生物の活動。生物の遺伝子型は、RNAに転写し、さらに表現型をもたらす、タンパク質に翻訳することができるそれらの各々は、その遺伝子によって表されます。従って、環境中の微生物の機能的活性の理解を助けるために、ポストゲノム解析は、9実行されるべきです。それは任意の環境で転写される遺伝子を明らかにするためMetatranscriptomics、またはRNA転写物の分析に便利です。しかし、mRNAのレベルは、常に翻訳調節、RNAの半減期、および複数のタンパク質コピーは、すべてのmRNAの10のために生成することができるという事実に起因し、それらの対応するタンパク質のレベルと一致しません。 これらの理由のmetaproteomicsのために今の環境微生物学のための重要なツールとして認識されています。共通metaproteomicは、複雑なサンプル中のタンパク質のほぼ完全な補完は、通常エンを通して、精製し、同時に分析されているショットガンプロテオミクスのアプローチを使用して分析します質量分析計のペプチドおよび分析にzymatic消化。続くタンデム質量分析（MS / MS）「ペプチドフィンガープリント」は、タンパク質データベース検索によって、ペプチド配列および起源の可能性タンパク質（概説については11を参照）を決定するために使用されます。プロテオミクスの研究は、過去25年間で、ゲノムデータの可用性の増加や高スループットのタンパク質の同定および定量11,12を可能にする質量分析計の感度および精度の向上のおかげで長い道のりを歩んできました。タンパク質は、遺伝子発現の最終産物であるので、metaproteomicデータは、任意の与えられた環境で活性である生物、それらが発現しているものタンパク質を判断するのに役立ちます。環境変数の特定のセットは、生物やコミュニティの表現型にどのように影響するかを決定しようとする場合に有利です。初期の段階では、海でのMS / MSベースmetaproteomic研究が対象となるの特定のタンパク質を同定するために使用されましたSAR11の海洋細菌13の光駆動プロトンポンプテオに焦点を当てた最初の研究で、微生物系統、。より最近では、比較metaproteomic分析が複雑な地域社会との差タンパク質発現パターンを解明しました。例としては、沿岸北西部大西洋14または南極半島5における代謝の時間的シフトの識別が含まれます。他の研究では、生産性の高い沿岸湧昇システム 15に低栄養環流から地理的トランセクトに沿って、例えば、空間スケールを越えタンパク質発現パターンの変化を説明しています。 metaproteomicsのさらなるレビューのために我々はシュナイダーら （2010）9、ウィリアムズら （2014年）16をお勧めします。標的プロテオミクスはまた、環境17,18における特定の代謝経路の発現を定量するために近年使用されています。 THEReはmetaproteomic分析には、主な3つの相です。第一段階は、試料収集、細胞溶解及びタンパク質の濃度を含むサンプル調製です。海洋微生物のサンプルの収集は、多くの場合、一般に、0.22μmのカートリッジを使用して、自由生活微生物細胞の捕捉のためにろ過し、より大きな真核生物細胞、粒子と粒子に関連する細菌を除去するためにプレフィルターを通して海水の濾過を伴いますフィルタユニット19,20。これらのフィルタは、プラスチックシリンダーでincasedされ、フィルタユニット内で実行することができる細胞溶解及びタンパク質抽出プロトコルは、貴重なツールであろう。バイオマスが得られると、細胞は、タンパク質抽出を可能にするために溶解されなければなりません。いくつかの方法は、溶解法をベースグアニジン-HCl溶解21とドデシル硫酸ナトリウム（SDS）を含む、使用することができます。 SDSのような界面活性剤は、膜を破壊し、多くのタンパク質の種類を可溶化でconcentrati非常に効率的であるが、下流タンパク質消化及びMS分析22に干渉することが0.1％と低く、ONS。主要な関心事のイオン源23内の逆相液体クロマトグラフィーとイオン抑制または蓄積の解像力、トリプシン消化効率にSDSの悪影響です。 第二段階は、タンパク質が、最初のトリプシンペプチドの一次アミノ酸配列を確認するために使用することができるAM / zの断片化パターンをもたらす、LC MS / MS分析に続いて酵素消化に供される分画及び分析です。さまざまな消化方法が使用される界面活性剤の種類、ならびに下流の質量分析ワークフローに応じて行うことができます。我々のプロトコルでは、ゲルのSDSを除去した1次元PAGE電気泳動は、任意の洗剤汚染を除去するために利用されています。このような膜タンパク質として、可溶化することが困難であるタンパク質の分析は、高いconcenの使用を必要としますSDSまたは他の界面活性剤のtrations。これは、SDSゲル電気泳動との互換性の問題につながります。研究の目的は、タンパク質を可溶化するために、これらの硬質の可溶化を必要とする場合、チューブゲルシステムは、22,24を使用することができます。チューブゲル法、電気泳動を使用することなく、ゲルマトリックス内のタンパク質を組み込みます。続いて可溶化するために使用される任意の界面活性剤は、タンパク質消化の前に削除されます。 第三段階は、バイオインフォマティクス解析です。この段階でMS / MSペプチドデータは、サンプル中に存在するペプチドおよびタンパク質を決定するために翻訳されたヌクレオチド配列データベースに対して検索されます。ペプチドの同定は、それがに対して検索されているデータベースに依存しています。マリンmetaproteomicデータは、一般的に参照ゲノムから成るデータベースに対して検索され、そのようなグローバル・オーシャン・サンプリングデータセット25、ならびに単一セルとメタゲノムのデータが未培養のLiからゲノムを増幅します26,27 neages。タンパク質同定はまたmetaproteomicデータは 5導出されたのと同じ試料からメタゲノム配列を含めることによって増加させることができます。 ここでは、微生物バイオマスからのMS / MSに基づく分析を濾過により回収し、RNA安定化溶液中で保存するのに適したペプチドを生成するためのプロトコルを提供します。 DNAとタンパク質は、同じ試料から単離するためのタンパク質およびDNAの沈殿に至るまでのすべてのステップが同じになるように、ここで説明されたプロトコルができます。唯一のフィルタは、タンパク質およびDNA抽出の両方のために必要とされるので、実用上の観点から、より少ない濾過が必要とされます。また、このプロトコルは2以前に公開されたプロトコルの組み合わせ、適応及び改変によって作成されたことを感謝したいです。細胞溶解工程は、斎藤ら。（2011）28、コンポーネントがShevcheから適応されるダイジェストゲル内トリプシンから適応されていますNKOら。 （2007年）29。

<table><tbody><tr><td>ステリベックス -GP 0.22 &mu;mフィルターユニット</td><td>Millipore</td><td>SVGP01050</td><td>Sampling</td></tr><tr><td>RNAlater Stabilization Solution</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td>Sampling</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>バイオベーシック</td><td>77-86-1 または TB0196-500G</td><td>タンパク質抽出/ SDS PAGEゲル</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>タンパク質抽出</td></tr><tr><td>SDS</td><td>バイオベーシック</td><td>15-21-3</td><td>タンパク質抽出/ SDS PAGEゲル</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>バイオベーシック</td><td>6381-92-6</td><td>タンパク質抽出</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>56-81-5</td><td>タンパク質抽出</td></tr><tr><td>10K アミコン フィルター</td><td>ミリポア</td><td>UFC801024</td><td>タンパク質抽出</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-4L</td><td>タンパク質沈殿</td></tr><tr><td>アセトン</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>67-64-1</td><td>タンパク質沈殿</td></tr><tr><td>MPC タンパク質沈殿試薬</td><td>エピセンター</td><td>mmP03750</td><td>DNA 沈殿</td></tr><tr><td>2-プロパノール</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>67-63-0</td><td>DNA沈殿物</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>DNA 定量</td></tr><tr><td>Qubit Protein Assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q33211</td><td>タンパク質定量</td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>バイオ ベーシック</td><td>57-50-1</td><td>SDS PAGE ゲル</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio Rad</td><td>161-0800</td><td>SDS PAGE ゲル</td></tr><tr><td>APS</td><td>Bio Rad</td><td>161-0700</td><td>SDS PAGE ゲル</td></tr><tr><td>30%アクリルアミド</td><td>Bio Rad</td><td>161-0158</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio Rad</td><td>161-0718</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>B-mercaptoethanol</td><td>Bio Basic</td><td>60-24-2</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio Rad</td><td>161-0737</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein万華鏡ラダー</td><td>バイオラッド</td><td>バイオ Rad 161-0375EDU</td><td>SDS PAGE ゲル</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>VWR</td><td>CABDH6044-4</td><td>インゲル トリプシン消化</td></tr><tr><td>NH4HCO3</td><td>バイオ ベーシック</td><td>1066-33-7</td><td>インゲル トリプシン消化</td></tr>器 <tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>インゲル トリプシン消化</td></tr><tr><td>ギ酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507-500ML</td><td>インゲル トリプシン消化</td></tr><tr><td>HPLCグレードH2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733-4L</td><td>インゲルトリプシン消化</td></tr>物 <tr><td>ヨードアセトアミド</td><td>バイオベーシック</td><td>144-48-9</td><td>インゲルトリプシン消化</td></tr>物 <tr><td>トリプシン</td><td>プロメガ</td><td>V5111</td><td>インゲルトリプシン消化</td></tr>物タンパク質<tr><td>LoBindチューブ1.5 ml</td><td>エッペンドルフ</td><td>22431081</td>イン<td>ゲルトリプシン消化</td></tr>物 <tr><td>2 ml ROBOバイアル9 mm</td><td>Candian Life Science</td><td>VT009/C395SB</td><td>ゲル内トリプシン消化</td></tr>物<tr><td>PP BMインサート、スプリングなし</td><td>Candian Life Science</td><td>4025P-631</td>ゲル<td>内トリプシンダイジェ</td></tr></tbody></table>スト

水生微生物metaproteomicsワークフロー：細胞からのトリプシンペプチドのタンデム質量分析ベースの分析に適し

An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

メタゲノム技術、メタトランスクリプトミクス、メタプロテオミクスなどのメタオミクス技術は、微生物群集の構造と代謝の理解を助けることができます。メタゲノミクスだけでは強力ですが、機能的な可能性を解明することしかできません。一方、メタプロテオミクスは、発現したin situ代謝とコミュニティの機能の記述を可能にします。ここでは、カートリッジフィルターユニット(Sterivexフィルターユニットなど)で収集され、RNA安定化溶液(RNAlaterなど)で保存された海洋微生物細胞からのペプチド消化と抽出、および細胞溶解、タンパク質およびDNAの単離のためのプロトコールについて説明します。質量分析に基づくプロテオミクス研究では、ペプチドタンデム質量スペクトルを翻訳ヌクレオチド配列のデータベースと比較することにより、ペプチドとタンパク質の同定が行われます。サンプルのメタゲノムを検索データベースに含めると、マススペクトルから同定できるペプチドとタンパク質の数が増えます。したがって、このプロトコルでは、DNAは同じフィルターから単離され、その後メタゲノム解析に使用することができます。

デモンストレーションとして、我々は、二つの表面から採取した海水サンプルとカナダ北部の沿岸海洋のクロロフィル最大でプロトコルを行いました。海で、海水の6-7 Lが3μmのGF / Dをプレフィルターに通したが、その後、微生物細胞は、ウォルシュら 20のプロトコルに従って、0.22μmのカートリッジフィルターユニットに収集しました。細胞はすぐにさらに処理されるまでRNA安定化溶液中で保存しました。それがここに提示されると研究室に戻ると、私たちはプロトコルを行いました。濃縮された細胞溶解物を分けました。 DNAは、ボリュームの残りの10％から沈殿させながら、タンパク質は、体積の90％から沈殿させました。我々は、タンパク質の24〜26μgのこれらのサンプルから高品質のDNAの250から308 ngの（ 図1）を回収しました。ゲル内トリプシン消化とペプチド抽出した後、我々は、オービトラップエリに結合されたナノLCを用いてMS / MS分析に供したペプチドをテ質量分析計（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、マサチューセッツ州、米国）。ペプチドから、我々はサンプ...

このプロトコルは、海水から採取された微生物バイオマスからのタンパク質とDNAの抽出と濃縮、その後のタンデム質量分析に基づくプロテオミクス分析に適したトリプシンペプチドの生成のためのものです。

水生微生物Metaproteomicsワークフロー：細胞からのトリプシンペプチドのタンデム質量分析ベースの分析に適し

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

本手順の目的は、海水中の微生物バイオマスからタンパク質およびDNAを抽出することであり、続いてタンデム質量分析に基づくプロテオーム解析のためのトリプシン消化ペプチドを生成することです。これはまず、カートリッジフィルター上に蓄積させた細胞を溶解させることで達成されます。次に、超遠心ろ過ユニットを用いて細胞溶解物を濃縮します。次に、溶解液をタンパク質沈殿用とDNA沈殿用の2つの画分に分けます。最終ステップとして、タンパク質のゲル内トリプシン消化を行い、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）に適したペプチドを抽出します。最終的に、その後のバイオインフォマティクス解析を用いてサンプル中の発現タンパク質を同定でき、また、単離されたDNAはメタゲノム解析および/または16S rRNA遺伝子解析に使用できます。この手法の既存の方法に対する主な利点は、タンパク質とDNAの両方を同一のサンプルから同時に単離できることです。まず、フィルター遠心分離装置のルアーロック端に60 mLシリンジを取り付け、カートリッジフィルターユニットからRNA安定化溶液を2 mLマイクロ遠心チューブに排出します。その後、2 mLマイクロ遠心チューブを17,000 ×gで10分間遠心分離し、細胞残渣をペレット化します。上清を10 K超遠心フィルターユニットに移し、サンプル中の溶出した細胞由来のタンパク質を回収します。ペレットを廃棄しないでください。超遠心フィルターユニットを 3,270 ×g で 30 分間、または液量が約 600 µL になるまで遠心分離します。その間に、P10チップの先端を溶かし、カートリッジフィルターユニットのノンルアーロック側をチップの開口端で塞ぎます。これにより、以降のステップで抽出バッファーやバイオマスが漏出することを防ぎます。ペレットを1 mLのSDS抽出溶液に懸濁させ、元のカートリッジフィルターユニットにピペットで分注します。カートリッジフィルターユニットへの分注において最も簡単な方法は、P 200チップをP 1000チップの上に重ね、このダブルチップを使用してピペッティングすることです。さらに1 mLのSDS抽出溶液をカートリッジフィルターユニットに加え、総容量を約2 mLにします。パラフィルムで、カートリッジフィルターユニットのルアーロック端を密閉し、50 mLチューブに入れます。次に、50 mLコニカルチューブの底に、丸めたラボワイプを3枚置きます。蓋を閉め、チューブをハイブリダイゼーションオーブンに入れ、回転させながら室温で10分間インキュベートします。10分後、フィルターをフォームフローターに載せ、5 mLシリンジのルアーロック端を用いて固定し、95 °Cのウォーターバスで15分間インキュベートします。その後、カートリッジフィルターユニットを室温で1時間回転させて冷却します。冷却後、60 mLシリンジを用いて、フィルターからSDS抽出溶液（細胞ライセート）を同じ超遠心フィルターユニットに排出します。前と同様に、1 mLの新鮮なSDS抽出溶液をカートリッジフィルターユニットに加え、手で30秒間混ぜ合わせます。次に、60 mLシリンジを用いてフィルターの内容物を超遠心フィルターユニットに押し出し、洗浄することで、すべてのタンパク質が除去され、回収されたことを確認します。超遠心フィルターユニットを用いて、3,270 ×gで45分間、またはフィルターユニット内の液量が600 µL未満になるまで遠心分離を行います。フロースルーを廃棄し、超遠心ろ過ユニットに新鮮なSDS抽出溶液を満たします。このろ過ユニットを3,270 ×gでさらに45分間遠心分離し、この工程をあと2回繰り返します。最終遠心終了時の超遠心ろ過ユニット内の液量が最大600 µLであることを確認してください。この時点で濃縮液の容量を測定し、濃縮液を2等分します。一方の分画はDNA沈殿に、もう一方はタンパク質沈殿に使用します。タンパク質沈殿では、1容量の濃縮液に対し、メタノールとアセトンを50:50の比率で合計4容量加え、10秒間ボルテックスし、-20 °Cで一晩インキュベートします。翌日、混合物を17,000 ×gで30分間遠心分離します。上清をデカンテーションで除いた後、ペレットをスピードバックで1時間乾燥させます。ペレットを乾燥させすぎると、再懸濁が困難になる場合があるため注意してください。ペレットを25 µLのSDS抽出液に懸濁させます。1時間静置した後、ピペッティングにより再懸濁します。コンタミネーションを最小限に抑えるため、バイオセーフティーキャビネット内で、テキストプロトコルに詳しく記載されている通りにタンパク質のSDS-PAGEを行います。各レーンの10 kDaラダーの印より下の余分なゲルを切除します。各レーンをタンデム質量分析計で分析します。別途、表面積を増やすために各レーンを1 mm × 1 mmの正方形に切り分け、そのレーンのすべての正方形を低吸着マイクロ遠心チューブに入れます。すべてのレーンでこの操作を繰り返します。ゲルの乾燥を防ぎ、切りやすくするために1% 酢酸を使用してもかまいません。テキストのプロトコルに従ってインゲルtrypsin消化およびペプチド抽出を行うか、あるいはDNA沈殿に用いる濃縮分画に対し、SDS抽出溶液を500 µLの標線まで加えてDNA沈殿の手順に進みます。この工程は単に溶液量を増やし、操作しやすくするためのものです。次に、MPCタンパク質沈殿試薬などのタンパク質沈殿試薬を0.583倍量加え、ボルテックスで混合します。17,000 ×g、4 °Cで10分間遠心分離し、白い沈殿を形成させます。遠心分離後、上清を別の1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、0.95容量のイソプロパノールを加えて30〜40回転倒混和し、最大速度、4 °Cで10分間遠心分離した後、上清を慎重にデカンテーションして除去します。次に、ペレットを750 µLの70%エタノールで2回洗浄します。ピペットを用いてエタノールをできるだけ取り除き、その後ペレットを風乾させます。DNAを乾燥させすぎないようにしてください。乾燥しすぎると、再懸濁が困難になる場合があります。ペレットを25 µLのlow T buffer P eightに懸濁させます。二本鎖DNAアッセイキットを用い、製造元の指示に従ってDNA定量を行います。また、DNA 3 µLを用いてアガロースゲル電気泳動を行い、その品質を確認します。得られたペプチドについてタンデム質量分析を行い、1サンプルあたり23,000以上のスペクトルを生成し、そこからペプチドおよびタンパク質を同定しました。メタプロテオームの分類学的および機能的組成を、blast Pとmetagenome analyzerソフトウェアパッケージを組み合わせて分析した。データセットの中で最も多く検出されたのはalpha proteobacteriaに割り当てられたタンパク質であり、その大部分はSAR 11クレードに分類された。Alpha ProteobacteriaのRoterクレードも高い割合で検出され、同定されました。多くは表層水で見られました。細菌性疾患に関連するタンパク質は表層とクロロフィル最大層の間で均等に分布していましたが、鞭毛細菌のタンパク質はクロロフィル最大層でより多く同定されました。ガンマプロテオバクテリアのタンパク質は水柱全体に均等に分布していましたが、ベータプロテオバクテリアのタンパク質は主に表層で検出されました。この手法を習得すれば、適切に実施することで3日間で完了させることができます。

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環境

キャプチャ化合物は、光架橋および精製に続いて​​機能的な可逆小分子 -...

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学ぶ 海水微生物バイオマスからのタンデム質量分析ベースのメタプロテオミクスワークフロー。トリプシン消化とLC-MS/MSを用いてタンパク質とDNAを同時抽出し、海洋微生物生態系の機能解析を実現します。

水生微生物Metaproteomicsワークフロー：細胞からのトリプシンペプチドのタンデム質量分析ベースの分析に適し

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