水生微生物Metaproteomicsワークフロー：細胞からのトリプシンペプチドのタンデム質量分析ベースの分析に適し

本手順の目的は、海水中の微生物バイオマスからタンパク質およびDNAを抽出することであり、続いてタンデム質量分析に基づくプロテオーム解析のためのトリプシン消化ペプチドを生成することです。これはまず、カートリッジフィルター上に蓄積させた細胞を溶解させることで達成されます。次に、超遠心ろ過ユニットを用いて細胞溶解物を濃縮します。

次に、溶解液をタンパク質沈殿用とDNA沈殿用の2つの画分に分けます。最終ステップとして、タンパク質のゲル内トリプシン消化を行い、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（LC-MS/MS）に適したペプチドを抽出します。最終的に、その後のバイオインフォマティクス解析を用いてサンプル中の発現タンパク質を同定でき、また、単離されたDNAはメタゲノム解析および/または16S rRNA遺伝子解析に使用できます。

この手法の既存の方法に対する主な利点は、タンパク質とDNAの両方を同一のサンプルから同時に単離できることです。まず、フィルター遠心分離装置のルアーロック端に60 mLシリンジを取り付け、カートリッジフィルターユニットからRNA安定化溶液を2 mLマイクロ遠心チューブに排出します。その後、2 mLマイクロ遠心チューブを17,000 ×gで10分間遠心分離し、細胞残渣をペレット化します。上清を10 K超遠心フィルターユニットに移し、サンプル中の溶出した細胞由来のタンパク質を回収します。

ペレットを廃棄しないでください。超遠心フィルターユニットを 3,270 ×g で 30 分間、または液量が約 600 µL になるまで遠心分離します。その間に、P10チップの先端を溶かし、カートリッジフィルターユニットのノンルアーロック側をチップの開口端で塞ぎます。

これにより、以降のステップで抽出バッファーやバイオマスが漏出することを防ぎます。ペレットを1 mLのSDS抽出溶液に懸濁させ、元のカートリッジフィルターユニットにピペットで分注します。カートリッジフィルターユニットへの分注において最も簡単な方法は、P 200チップをP 1000チップの上に重ね、このダブルチップを使用してピペッティングすることです。さらに1 mLのSDS抽出溶液をカートリッジフィルターユニットに加え、総容量を約2 mLにします。

パラフィルムで、カートリッジフィルターユニットのルアーロック端を密閉し、50 mLチューブに入れます。次に、50 mLコニカルチューブの底に、丸めたラボワイプを3枚置きます。

蓋を閉め、チューブをハイブリダイゼーションオーブンに入れ、回転させながら室温で10分間インキュベートします。10分後、フィルターをフォームフローターに載せ、5 mLシリンジのルアーロック端を用いて固定し、95 °Cのウォーターバスで15分間インキュベートします。その後、カートリッジフィルターユニットを室温で1時間回転させて冷却します。冷却後、60 mLシリンジを用いて、フィルターからSDS抽出溶液（細胞ライセート）を同じ超遠心フィルターユニットに排出します。

前と同様に、1 mLの新鮮なSDS抽出溶液をカートリッジフィルターユニットに加え、手で30秒間混ぜ合わせます。次に、60 mLシリンジを用いてフィルターの内容物を超遠心フィルターユニットに押し出し、洗浄することで、すべてのタンパク質が除去され、回収されたことを確認します。超遠心フィルターユニットを用いて、3,270 ×gで45分間、またはフィルターユニット内の液量が600 µL未満になるまで遠心分離を行います。

フロースルーを廃棄し、超遠心ろ過ユニットに新鮮なSDS抽出溶液を満たします。このろ過ユニットを3,270 ×gでさらに45分間遠心分離し、この工程をあと2回繰り返します。最終遠心終了時の超遠心ろ過ユニット内の液量が最大600 µLであることを確認してください。

この時点で濃縮液の容量を測定し、濃縮液を2等分します。一方の分画はDNA沈殿に、もう一方はタンパク質沈殿に使用します。タンパク質沈殿では、1容量の濃縮液に対し、メタノールとアセトンを50:50の比率で合計4容量加え、10秒間ボルテックスし、-20 °Cで一晩インキュベートします。

翌日、混合物を17,000 ×gで30分間遠心分離します。上清をデカンテーションで除いた後、ペレットをスピードバックで1時間乾燥させます。ペレットを乾燥させすぎると、再懸濁が困難になる場合があるため注意してください。

ペレットを25 µLのSDS抽出液に懸濁させます。1時間静置した後、ピペッティングにより再懸濁します。コンタミネーションを最小限に抑えるため、バイオセーフティーキャビネット内で、テキストプロトコルに詳しく記載されている通りにタンパク質のSDS-PAGEを行います。各レーンの10 kDaラダーの印より下の余分なゲルを切除します。

各レーンをタンデム質量分析計で分析します。別途、表面積を増やすために各レーンを1 mm × 1 mmの正方形に切り分け、そのレーンのすべての正方形を低吸着マイクロ遠心チューブに入れます。すべてのレーンでこの操作を繰り返します。ゲルの乾燥を防ぎ、切りやすくするために1% 酢酸を使用してもかまいません。

テキストのプロトコルに従ってインゲルtrypsin消化およびペプチド抽出を行うか、あるいはDNA沈殿に用いる濃縮分画に対し、SDS抽出溶液を500 µLの標線まで加えてDNA沈殿の手順に進みます。この工程は単に溶液量を増やし、操作しやすくするためのものです。次に、MPCタンパク質沈殿試薬などのタンパク質沈殿試薬を0.583倍量加え、ボルテックスで混合します。

17,000 ×g、4 °Cで10分間遠心分離し、白い沈殿を形成させます。遠心分離後、上清を別の1.5 mLマイクロ遠心チューブに移し、0.95容量のイソプロパノールを加えて30〜40回転倒混和し、最大速度、4 °Cで10分間遠心分離した後、上清を慎重にデカンテーションして除去します。次に、ペレットを750 µLの70%エタノールで2回洗浄します。

ピペットを用いてエタノールをできるだけ取り除き、その後ペレットを風乾させます。DNAを乾燥させすぎないようにしてください。乾燥しすぎると、再懸濁が困難になる場合があります。ペレットを25 µLのlow T buffer P eightに懸濁させます。

二本鎖DNAアッセイキットを用い、製造元の指示に従ってDNA定量を行います。また、DNA 3 µLを用いてアガロースゲル電気泳動を行い、その品質を確認します。得られたペプチドについてタンデム質量分析を行い、1サンプルあたり23,000以上のスペクトルを生成し、そこからペプチドおよびタンパク質を同定しました。

メタプロテオームの分類学的および機能的組成を、blast Pとmetagenome analyzerソフトウェアパッケージを組み合わせて分析した。データセットの中で最も多く検出されたのはalpha proteobacteriaに割り当てられたタンパク質であり、その大部分はSAR 11クレードに分類された。

Alpha ProteobacteriaのRoterクレードも高い割合で検出され、同定されました。多くは表層水で見られました。細菌性疾患に関連するタンパク質は表層とクロロフィル最大層の間で均等に分布していましたが、鞭毛細菌のタンパク質はクロロフィル最大層でより多く同定されました。

ガンマプロテオバクテリアのタンパク質は水柱全体に均等に分布していましたが、ベータプロテオバクテリアのタンパク質は主に表層で検出されました。この手法を習得すれば、適切に実施することで3日間で完了させることができます。