成人ヒト線維芽細胞の導出と拡張神経前駆細胞へのそれらの直接変換

この手順の全体的な目標は、治療用途のために患者の皮膚生検から誘導された神経前駆細胞を直接生成することにより、古典的な山中IPSアプローチを短縮することです。これは、まず患者からパンチ生検を行い、in vitroで培養できる初代線維芽細胞を採取することによって達成されます。第2のステップは、培養線維芽細胞を拡大し、その後、トランス分化を誘導するリプログラミング因子をコードするウイルスに感染させることです。

次に、推定される変換された誘導神経前駆細胞またはINPCコロニーは、目視検証によって慎重に選択し、その後、感染の約20日後に手動ピッキングによって単離する必要があります。最後のステップは、モノクローナルに、神経誘導媒体中のIPCを拡大し、最終的には標的を絞ったin vitro分化と免疫蛍光顕微鏡を使用して、患者自身の直接変換されたIPCがニューロン細胞とグリア細胞に分化できることを示すために使用され、生物医学的応用のための事実上無制限の供給源となっています。この直接変換技術は、誘導された青色の強力な幹細胞の山中型誘導とその後の分化のような既存の方法よりも優れている点が2つあります。

多能性誘導神経幹細胞(INS細胞)へのDI変換は、かなり速いだけでなく、より安全です。したがって、トランス分化手順は、治療用途のための患者特異的細胞を作製することがはるかに達成可能になり、IPS細胞と比較して腫瘍形成のリスクが劇的に低くなります。これにより、私たちは現在、地域の医療率の2つの主要な障害を解体することができます。

それが臨床の安全性と効率性です。パンチ生検を開始するには、患者の皮膚を消毒し、生検が行われる皮膚に麻酔をかけます 0.5〜1ミリリットルの塩酸メピバカインを皮内に投与します。滅菌済みの3mm生検パンチを使用して皮膚生検を行います。

ドベエコーのリン酸緩衝生理食塩水またはDPBSに加えて、ゲンタマイシンのミリリットルあたり1マイクロリットルで生検をすすぎます。.メスと鉗子を使用して生検から脂肪を取り除きます。次に、生検を完全に吸引する前に、バッファーでさらに2回すすぎます。

生検をディスペースト2で覆い、摂氏4度で16〜18時間インキュベートします。インキュベーション後、DPBSで生検を2回洗浄する前に、ディスペーストを完全に吸引します。ピンセットで表皮を取り除き、DPBSで生検をさらに2回洗います。

次に、2ミリリットルのコラゲナーゼタイプ2を加え、チューブ内の15ミリリットルのチューブに移します。コラゲナーゼを最大5ミリリットルまで加えます。総量を37°Cで45分間インキュベートします。

サンプルを180倍Gで5分間遠心分離し、その後スナットを廃棄します。10ミリリットルのDMEMウシ胎児血清ゲンタマイシン培地にペレットを再懸濁してから、180倍G.上清を捨て、同じ培地の1.5ミリリットルにペレットを再懸濁します。次に、サンプルをT 25接着組織培養フラスコに移し、摂氏37度5%CO2でインキュベートし、約2週間後に3日ごとに培地を交換します。

細胞が皮膚部分の周りでコンフルエントになったら、テキストプロトコルで説明されているようにトリプシンEDTAを使用して細胞を分割します。3日ごとに培地を交換し、細胞がコンフルエントになったら分裂させることで、細胞をさらに拡大します。標準的なアッセイでマイコプラズマ汚染を排除した後、DPPSで細胞を一度洗浄し、DPBSを吸引し、2.5ミリリットルのトリプシンEDTAを添加することにより、直接変換実験のための細胞を準備します 細胞を摂氏37度、5%CO2で5分間インキュベートした後、フラスコを軽くたたいて細胞を切り離します。

細胞を2.5ミリリットルの線維芽細胞培地に再懸濁し、15ミリリットルのチューブに移します。チューブをGの180倍で5分間遠心分離し、スナットを吸引します。細胞を1ミリリットルの線維芽細胞培地に再懸濁し、ピペットで上下に動かして、単一細胞懸濁液を生成します。

プレーティング前にセルカウンティングチャンバーを使用して細胞の数をカウントします。ウェルあたり30, 000個の細胞。24ウェルプレートで細胞を摂氏37度で一晩インキュベートし、ウイルスを処理する5%CO2ステップは、粘膜への曝露を防ぐためのサージカルマスクを含む適切な個人用安全装置を備えた生物学的安全キャビネットで実行する必要があります。

最初に感染を行うには、既存の細胞培地を100マイクロリットルの線維芽細胞培地に交換します。その後、T 4、KLF 4、SOX 2、およびcmix sendiウイルスの解凍したアリコートを1ミリリットルの線維芽細胞培地に再懸濁します。各ウイルスをMOI3で細胞に加え、細胞を摂氏37度で一晩、24時間後に5%CO2で穏やかにインキュベートし、培地を吸引し、500マイクロリットルの神経誘導培地培養物を追加し、39°Cの細胞、5%CO2で、感染後6日目に1日おきに培地を交換します。 ラミニンコーティングされた6ウェルプレートを調製します。

DPBS中の1ミリリットルあたり1マイクログラムのラミニンを6つのウェルプレートに加え、感染後7日目にプレートを摂氏4度に保ち、テキストプロトコルに記載されているようにD-P-B-S-E-D-T-Aを使用して細胞を分割します。500マイクロリットルのD-M-E-M-F 12を追加し、懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。次に、サンプルをGの180倍で5分間遠心分離します。

上清を吸引し、ペレットを1.5ミリリットルの神経誘導培地プレートに再懸濁し、ラミネートコーティングされた6ウェルプレート上の細胞を、ROキナーゼ阻害剤を最終濃度10マイクロモル培養に添加します。細胞は摂氏39度、5%CO2で、14日目から隔日で培地を交換します。感染培養後、摂氏37度の5%CO2神経上皮コロニーの細胞は、位相差顕微鏡で視覚化されるように、感染後17日目頃に明らかになります。

それらは、感染後1 48を選ぶ1日前に感染後20日目頃に摘み取るのに十分な大きさである必要があります。1日後のテキストプロトコルに記載されているように、ラミニンを含むウェルプレート、プレートからラミネートを吸引し、200マイクロリットルの神経誘導培地をウェルに加えます。1回摘み取るコロニーを含む6つのウェルプレートをDPBSで洗浄してから、2ミリリットルの神経誘導を追加します。

6ウェルプレートのウェルあたりの培地は、細い針でコロニーの周りをこすり、周囲の細胞を取り除き、ピペットチップでコロニーをピッキングすることで、細胞を機械的にピッキングします。200マイクロリットルのピペットマンに50マイクロリットルをセットして取り付けます。各コロニーをラミネートコーティングされた48ウェルプレートの1つのウェルに移し、ピペッティングを10回上下させることで機械的にシングルセル懸濁液を生成します。

最終濃度10マイクロモルのRキナーゼ阻害剤を細胞に添加します。48ウェルプレート上の細胞を摂氏37度、5%CO2で2日間増殖させます。細胞が80〜90%coの流暢さに達するまで、2日ごとに培地を交換します。

ニューロン系統培養に向けたIPCの分化のためのIPCの拡張と凍結保存のためのテキストプロトコルを参照してください。ラミネートコーティングされたプレート上のセル。以前と同様に、細胞が約70%コンフルエントになったら培地をニューロディファレンス培地に変更し、3週間は隔日で培地を交換し続けます。

分化中に細胞を分割しないでください 3週間後、細胞はより成熟したニューロンとニューロンサブタイプを得るために、ニューロンマーカーTUJ1を発現する必要があります。IPCの分化、特にグリア系統への分化のために、最大3か月の分化を続けます。培地をグリア誘導培地に変更し、グリア前駆細胞への分化を誘導するために、上皮成長因子1ミリリットルあたり20ナノグラムを含みます。

培地の半分を取り出し、約2週間、隔日で新しい培地と交換します。この期間中、2週間後に100%coの流暢さに達したときに、10マイクロモルのRキナーゼ阻害剤の存在下で細胞を1〜3分割する必要があります。細胞がほぼコンフルエントになったら、培地を市販のアストロサイト培地に変更し、約7日後には2日おきに培地を交換し続けることで、細胞をアストロサイトマーカーとして発現し始めます。

分化プロトコル中に細胞が100%コンフルエントになった場合は、細胞を1対2の比率で分割します。10マイクロモルROキナーゼ阻害剤の存在下で、T 4K LF four、SOX two、およびcmix sendiウイルスによる線維芽細胞の感染および神経誘導性培地条件での培養は、線維芽細胞の形態の変化とその後のコロニーの出現をもたらしました。感染発生から17日後、モノクローナル細胞株は増殖し、SOX 2、SOX one neston、PAC sixなどの神経幹細胞マーカー、および増殖マーカーKI 67に対して陽性に染色することができますが、多能性関連マーカーT 4は発現しません。

また、細胞培養液に神経細胞成長因子を添加することにより、アストロサイトの分化を応用することで神経前駆細胞をニューロンに分化させることができる。プロトコル誘導神経前駆細胞株は、典型的な形態学的変化の分析およびGFAPに対する染色によって判断されるように、グリア系統に分化させることもできる。この直接変換により、患者の線維芽細胞から3〜4週間以内に多能性誘導神経前駆細胞を作製します。

これらの細胞は、多くの生物医学的応用に使用できます。この技術の意味するところは、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患、その他の神経疾患の治療、診断、モデリングにまで及びます。