16S rRNAのをターゲットジゴキシン標識DNAプローブを用いたパラフィン包埋組織内細菌のその場検出で
2015年5月21日
ここでは、DIG標識された16S rRNA標的DNAプローブを使用して、パラフィン包埋組織内の細菌を局在化する方法が説明されています。このプロトコルは、歯周炎、癌、炎症性免疫疾患などのさまざまな疾患における細菌の役割を研究するために適用できます。
この手順の全体的な目標は、DIG標識された16 sリボソーム、RNAを使用して、DNAプローブを標的とするパラフィン包埋組織内の細菌を局在化することです。これは、最初にPCR増幅とDIG標識でプローブを調製することによって達成されます。2番目のステップは、組織切片をよりアクセスしやすいターゲット部位にし、バックグラウンド結合を少なくするように準備することです。
次に、調製した組織切片をdig標識プローブとハイブリダイズします。最後に、ハイブリダイズプローブをアルカリホスファターゼで検出し、抗D dig抗体を標識します。最終的に、このC 2ハイブリダイゼーション法では、パラフィン包埋組織を有する細菌の存在を示すことができる。
この検出がINGのような既存の方法よりも優れている点は、この方法が一部の組織学的構造のコンテキスト内で細菌SHSを検出できることです。この方法は、病因についての洞察を提供することができますが、歯周炎やRプラネットなどのさまざまな炎症性になります。組織切片が損傷しやすいため、組織調製とハイブリッド消化ステップの実行が難しいため、この方法を視覚的にデモンストレーションすることが重要です。
U型細菌プローブを作製するには、70塩基対、DNA断片をテンプレートとして使用し、2つの15塩基対プライマーを使用してPCRでプローブを増幅します。アンプリコンを既知の濃度のバッファーに回収します。次に、dig DNA標識および検出キットでプローブを標識します。
まず、3マイクログラムのプローブを15マイクロリットルの水に混合します。ヒートブロック内のプローブを摂氏95度で10分間変性させます。次に、変性プローブを氷の上に置きます。
次に、2マイクロリットルの10XHヌクレオチド、2マイクロリットルのDN NTP、および1マイクロリットルの運河酵素を追加します。混合したら、プローブを摂氏37度で24〜48時間インキュベートします。混合物を摂氏65度に加熱して反応を停止します。
次に、標識プローブのDNA濃度を260ナノメートルで測定し、濃度を1マイクロリットルあたり100ナノグラムに調整します。キットを使用して、まずナイロンメンブレンにプローブの感度を1マイクロリットルの連続希釈ポジティブコントロールで負荷します。プローブとラベル付きプローブを掘ります。
メンブレンを5分間乾かします。乾燥したら、メンブレンを2つのXSSCに短時間浸し、摂氏80度のインキュベーターに1時間移します。インキュベーション後にDNAを固定化するには、メンブレンをマレイン酸緩衝液に短時間浸し、次にAP標識抗体で濃縮したブロッキング緩衝液に30分後に1〜5,000希釈で移します。
MABTでメンブレンを洗います。次に、40マイクロリットルのN-B-T-B-C-I-Pを2ミリリットルの検出バッファーに混合します。そして入浴後、この混合物を膜に1分間加えます。
パラフィンを除去し、テキストプロトコルに記載されているように組織切片を再水和した後、Cで2つのハイブリダイゼーションのためにそれらを調製し、まずスライドを0.1正常塩酸に20分間浸します。酸浴後、スライドをDEPC処理水で30秒間洗い流します。次に、ワックスペンを使用して、各スライドの標本の輪郭を描きます。
次に、サイズに応じて、50〜400マイクロリットルのプロテイナーゼK溶液を標本に加えます。酵素を摂氏37度で30分間働かせた後、DEPCで1つのXPBSを処理したスライドを1分間洗浄します。次に、スライドをDEPC処理PBS中の4%パラホルムアルデヒドに10分間移します。
以前と同様にPBSで固定液を洗い流します。次に、スライドをpH 8の0.1モルトリエタノールアミン塩酸塩に0.5%酢酸と水素化物で20分後に浸し、前と同じようにスライドをきれいな水で洗い流します。次に、最初にスライドを2つのXSSCに20分間浸すことにより、C 2で開始します。
その間、標識プローブをハイブリダイゼーションバッファーで1マイクロリットルあたり1ナノグラムに希釈して、ネガティブコントロールにします。非標識プローブの10倍の濃度を使用してください。次に、プローブを摂氏90度で10分間加熱して変性させ、続いて氷上ですばやく冷却します。
次に、以前に適用したプロテイナーゼKと同じ量のプローブ希釈液を各スライドに適用します。次に、マニキュアを使用してスリップとシール部分を慎重に覆います。次に、PCRマシンブロックでスライドを摂氏90度で10分間加熱し、翌日、摂氏45度の加湿インキュベーターに一晩移します。
スライドを摂氏4度で30分冷やしてから、カバースリップを慎重に取り外します。組織は壊れやすいです。最後に、スライドを室温で一連のSSCバッファーに通します。
まず、NC 2つのハイブリダイズスライドをMABTで5分間洗浄します。次に、50〜400マイクロリットルのブロッキング溶液を1%tween 20に20分間塗布します。ブロックインキュベーション後、1〜1000個の抗Dディグアルカリホスファターゼ抗体とブロッキング溶液を50〜400マイクロリットルに適用します。
プライマリーを塗布した後、摂氏37度で90分間結合させます。スライドをMABTで10分間洗います。次に、スライドを1%tween 20の検出バッファーに5分間入れます。
次に、検出緩衝液中の1ミリモルオール溶液を50〜400マイクロリットル各スライドに適用し、それらを5分間インキュベートして内因性アルカリホスファターゼを不活性化します。次に、検出で希釈した50〜400マイクロリットルのN-B-T-B-C-I-Pを追加します。各スライドに1〜100で緩衝し、経験に基づいて加湿チャンバー内でスライドを2〜3時間インキュベートします。
スライドをDI水ですすぎ、メチルグリーンを0.05重量重量で塗布し、カウンターステインをティッシュに10分間作用させます。摂氏37度で。スライドを再び脱イオン水で洗い、100%エタノールで脱水した後、キシレンに浸します。
最後に、80マイクロリットルの封入剤を塗布し、カバースリップを塗ります。プローブ後のスライドにはDIGラベルが付けられています。それらの感度は、ポジティブコントロールプローブの希釈と比較されました。
3 43塩基対のp歯肉特異的プローブは、人工70塩基対の細菌プローブよりも25倍感度が高かった。次に、2つのプローブを慢性歯周炎患者の歯肉組織に高倍率で適用しました。バクテリアの様々な形状は、バクテリアプローブを用いて識別することができた。
p歯肉特異的プローブは桿状細菌のみを検出しましたが、マウスの歯肉粘膜には、化学的DSSを破壊するタイトジャンクションが適用されました。これらのマウスの組織サンプルを使用して、異なる状況でプローブを比較しました。ここでは、U型細菌プローブは、他の細菌が検出できなかった細菌を検出することができました。
次に、U細菌プローブは、腫瘍を含む肺組織切片中の他の細菌を検出する能力について試験されました。細菌は腫瘍内だけでなく腫瘍外でも検出された。病因不明の疾患である口腔扁平苔癬患者の組織を調べる際に、細菌プローブは、炎症性浸潤が観察された上皮および固有層の細胞内の細菌シグナルを検出しました。
その開発以来、この技術は、感染症の分野の研究者が、この手順に従って、人間と動物の両方の組織への細菌の侵入を調査するのに役立っています。免疫化学的検出、細胞マーカーへの増殖などの他の方法は、組織内の細菌がどのような細胞を保有しているかなどの追加の質問に答えるためにEDにすることができます。
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概要
本記事では、DIG標識した16S rRNA標的DNAプローブを用いて、パラフィン包埋組織内の細菌を局在化させる方法について解説します。このプロトコルは、歯周病、癌、炎症性免疫疾患などの疾患における細菌の役割を研究する際に適用可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 微生物学
- 病理学
- 免疫学
背景
- 組織内における細菌の局在を明らかにすることは、疾患における細菌の役割を理解する上で極めて重要です。
- パラフィン包埋は、組織検体を保存するための一般的な手法です。
- 16S rRNAは、細菌同定の標的として広く利用されています。
- DIGラベル化により、特定のDNAプローブの検出感度が向上します。
研究の目的
- パラフィン包埋組織中の細菌を検出するための信頼性の高い手法を開発すること。
- さまざまな疾患への細菌の関与に関する研究を促進すること。
- 組織切片における標的部位へのアクセシビリティを向上させること。
使用した手法
- PCR増幅によるDIG標識DNAプローブの調製。
- ターゲットへのアクセス性を高めるための組織切片の調製。
- 組織切片とDIG標識プローブのハイブリダイゼーション。
- アルカリホスファターゼ標識抗体を用いたハイブリダイズしたプローブの検出。
主要な結果
- この手法により、パラフィン包埋組織内の細菌を正常に局在化させることができた。
- より良い結果を得るために、ハイブリダイゼーション効率の最適化を行った。
- 検出法により、細菌の存在が明確に可視化された。
- この手法は、さまざまな疾患のコンテキストに適用可能です。
結論
- この手法は、組織内における細菌の局在を研究するのに有効です。
- 疾患メカニズムの解明に活用できる可能性があります。
- 今後の研究により、臨床現場での利用拡大が期待されます。
よくある質問
業界における重要性
パラフィン包埋組織内における細菌の信頼性の高い検出は、トランスレーショナルリサーチにおける重要な課題を解決し、保存された臨床検体における微生物の局在を直接的に可視化することを可能にします。このDIG標識DNAプローブ法は、細菌の存在と疾患病理を関連付ける予測の信頼性を高め、創薬および前臨床段階におけるメカニズムのデリスク（リスク低減）を支援します。標準的な病理ワークフローとの互換性があるため、ポートフォリオ全体の感染症および腫瘍学研究における再利用可能な能力として位置付けられます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的活用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 疾患に関連する組織における細菌の関与を直接的に検証することが可能になります。
- 組織学的コンテキスト内で微生物の局在を可視化することで、機能的ターゲットのバリデーションをサポートします。
- 宿主と微生物の相互作用に関わる仮説のメカニズム的なリスク低減を促進します。
- 感染症関連ターゲットを前進させるための予測信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ダウンストリームの分子および細胞アッセイに向けて、検証済み組織系を調製します。
- 多様な組織タイプにおける細菌シグナルの検出を標準化します。
- アッセイのベンチマーキングに不可欠な、再現性のある定量的出力を提供します。
- in situにおけるプローブの特異性と感度の信頼性の高い評価を可能にします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- ヒトおよび動物組織の両方で細菌を検出することで、疾患関連モデルとの整合性を確保します。
- 感染および炎症研究において、探索段階から前臨床検証までの連続性をサポートします。
- 細菌の局在と病理学的特徴を相関させることで、トランスレーショナルバイオマーカーとしての可能性を提供します。
- 疾患表現型に対する微生物の寄与を明らかにすることで、開発進展における意思決定のリスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
このDIGラベルプローブ法は、パラフィン包埋組織アーカイブを利用して仮説検証およびターゲットバリデーションを行うことで、初期発見から前臨床研究までを統合的に繋ぐものです。
- 探索生物学： 保存された組織構造内における細菌の局在化について、仮説に基づいた解析を可能にします。
- スクリーニング： アッセイの開発およびバリデーションに向けた、標準化され再現性のある検出を提供します。
- 分析： 定量的および形態学的なリードアウトを生成し、異なる条件下での細菌の存在を比較します。
- トランスレーショナルリサーチ： 疾患モデルにおけるバイオマーカーの整合性をサポートすることで、探索研究と前臨床研究を橋渡しします。
- エンタープライズでの再利用： 感染症および腫瘍学のポートフォリオに向けた、拡張可能で再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：宿主・微生物研究における予測の信頼性を高め、メカニズム上の曖昧さを軽減する。
- 運用上の価値：汎用性の高いパラフィン包埋試料における細菌検出を標準化する。
- 戦略的価値：感染症関連プログラムにおけるGo/No-go決定に情報を提供し、後期の生物学的リスクを低減する。
- ポートフォリオへの影響：微生物成分を含むターゲットやモデルの、リスク調整後の優先順位付けを可能にする。
実施上の考慮事項
- 分子プローブ設計および組織学的手法の専門知識が必要です。
- PCR、DIGラベル化キット、および顕微鏡設備の利用環境が必要です。
- 組織型をまたいだ再現性を確保するため、チーム間での厳格な標準化が求められます。
- 異なる種や組織保存プロトコルに応じて、適正化が必要になる場合があります。
- 組織切片の脆弱性とハイブリダイゼーションの複雑さがあるため、慎重な取り扱いと最適化が必要です。
