Name: 16S rRNAのをターゲットジゴキシン標識DNAプローブを用いたパラフィン包埋組織内細菌のその場検出で (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 学ぶパラフィン包埋組織内細菌のその場検出法。DIG標識16S rRNA標的DNAプローブとアルカリホスファターゼ抗体を用い、歯周病やがんなどの細菌関与疾患の病態解明に応用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、韓国国立研究財団からの助成金（2013R1A1A3005669）と韓国の医療技術のR＆Dプロジェクト、保健福祉省の補助金（HI13C0016）によってサポートされていました。

1.プローブの準備<ol><li>プローブのPCR増幅<ol><li> Pのジンジバリス特異的プローブは、Pの343 bpのDNA断片を増幅しますPのゲノムDNAを用いたPCRによるジンジバリスの16SrRNA ジンジバリスと以下のプライマー：5&#39;-TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 &#39;および5&#39;-ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3&#39; 10。 72℃で10,11で5分間の延長が続く1分20秒、30秒、30秒、95℃で35サイクル、60℃、72℃以下のサイクル条件で増幅を行います。 </li><li> 70-bpのDNA断片（5&#39;-CAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGを使用して、真正細菌のプローブを増幅 TCCCGCAACGAGCGCAACCC-3 &#39;オリゴヌクレオチドおよび以下のプライマーとして合成さ）：5&#39;-CAG GTR CTG CMT GGY-3&#39; &#39;11および5&#39;-AGG GTT GCG CTC GTT-3。 40サイクル：次のサイクル条件で増幅を行います30秒30秒9、4℃、60℃、1分間72℃11,12で5分間の延長に続く20秒間の72℃で。 </li><li> 2時間-20℃でインキュベートし、3M酢酸ナトリウム（pH5.2）と（：1：2の比率10で）100％エタノールを添加することにより、PCR産物（≥500μl）を沈殿させます。 </li><li>遠心分離機15分間14,000×gで混合物を、100μlのTE緩衝液にペレットを再懸濁し、260 nmでの光学濃度によりDNA濃度を測定します。 </li></ol></li><li> DIG DNA標識および検出キットを用いてDIGは、標識<ol><li> 15μlの最終容量まで水でプローブの3μgのを混ぜます。 </li><li> 10分間95℃でDNAを変性し、すばやく氷上で冷やします。 </li><li>変性DNAの15μlに10倍のヘキサヌクレオチドミックス2μlの、のdNTP標識ミックス2μlの、およびクレノウ酵素の1μlを添加します。 </li><li>混合し、48時間に24時間、37℃でインキュベートし、65℃で加熱することによって反応を停止させます。 </li></ol></li><li> DIG DNA標識および検出キットを用いてDIG標識プローブの感度を確認し<ol><li>手動で室温で5分間、キットに提供ポジティブコントロールプローブの連続希釈液を1μl、ナイロン膜上のDIG標識プローブ1ngの、乾燥をロードします。 </li><li>簡潔には2×SSC緩衝液（0.3MのNaCl、30mMのクエン酸ナトリウム、pH7.0）中の膜を浸漬し、DNAを固定化するために1時間80℃で膜をインキュベートします。 </li><li>提供ブロッキング溶液6mlに：簡単に言うとマレイン酸バッファー（MAB、0.1 Mマレイン酸、0.15 MのNaCl、pH7.5）で、膜を浸して、抗DIGアルカリホスファターゼ（AP）でインキュベートする抗体希釈（5000 1）抱合30分間、室温でキット中。 </li><li> MABT（MABを1％Tween 20を含む）を有する膜を洗浄し、上に2ミリリットルの検出緩衝液（0.1 Mトリス塩酸、0.1 MのNaCl、0.05 MのMgCl 2、pHは9.5）と混合し、NBT / BCIP溶液40μlを適用1分間の膜。標識プローブの感度がある場合1.1.3から1.3.4へのステップを繰り返し、満足しません。 </li><li>標識プローブ（OD260）のDNA濃度を測定し、μlのngの100の濃度に調整-1。 </li></ol></li><li> DIG標識プローブの特異性を確認してください<ol><li> 10分間95℃で、特異的プローブによって標的細菌を含む様々な細菌種からのゲノムDNA試料（25ngの3μL-1各サンプルあたり）を変性させ、すぐに氷上で冷やします。 </li><li>手動で室温で20分間、変性ナイロン膜上のDNAと乾燥をロードします。 </li><li>簡単に言うと2×SSC緩衝液中で膜を浸して、DNAを固定化するために80℃で2時間、膜をインキュベートします。 </li><li> 1時間室温でブロッキング溶液で膜をブロックします。 </li><li> 、ハイブリダイゼーション緩衝液中で-1μlのngの1でプローブを希釈し希釈したプローブを変性させ、膜上に適用されます。 </li><li> 1時間45℃で膜をインキュベートします。 </li><li>メンブレンを洗浄32×SSC緩衝液で倍。 </li><li>簡単に言うとMABに膜を浸します。 </li><li>室温で1時間ブロッキング溶液6mlに：（2000 1）希釈した抗DIG APコンジュゲート抗体とインキュベートします。 </li><li> MABTでメンブレンを洗浄し、2ミリリットルの検出緩衝液を混合し、NBT / BCIP溶液40μlを適用します。 </li><li>プローブが予想特異性を達成していない場合の特異性が観察されるまで、ハイブリダイゼーション温度を上昇させます。 </li></ol></li></ol> in situハイブリダイゼーション 2 注：検体と試薬の乾燥を避けるために、湿ったペーパータオルを敷いた加湿チャンバー内で全てのインキュベーションを行います。 <ol><li>組織切片の脱パラフィン除去し、再水和<ol><li>パラフィン包埋ブロックから厚さ4μmの組織切片を準備します。ホルマリン、パラホルムアルデヒド、及び亜鉛系固定液は、このプロトコルに対応しています。 </li><li> DEPC処理水を用いて、全ての試薬を準備します。 </li><li> 30分間60℃で乾燥オーブン中で加熱し、スライドを室温で30分間スライドをインキュベートします。 </li><li> 5分間3回、100％キシレンでスライドを浸します。新鮮なキシレンを毎回使用しています。 注：化学ドラフト内でこの脱脂の手順を実行します。 </li><li>新鮮なエタノールを毎回使用して、二回5分間、100％エタノールでスライドを浸し、シリアル、90％、80％、5分間、それぞれ70％エタノール溶液中の試料を再水和。 </li><li> 1分間のDEPC処理水にスライドを浸し、6分間DEPC処理PBS（pH7.4）中でスライドを洗浄します。 </li></ol></li><li>組織切片の前処理<ol><li> 20分間0.1 N塩酸でスライドを浸し、30秒間DEPC処理水でスライドを洗浄します。 </li><li>ワックスペンを使用して、試験片の周囲の疎水性の障壁を描画します。 注：疎水性の障壁の大きさは、標本の大きさに依存します。したがって、次の手順で使用される試薬の体積は試料のサイズに応じて異なるが、HYを充填する必要がありますdrophobicバリア（小標本と大きな標本のために400μlの50μL）。 </li><li> 30分間37℃で乾燥オーブン中でプロテイナーゼKの50〜400μlの（1から10μgのml -1のDEPC処理したPBS中）を用いて検体を処理し、1分間、DEPC処理した1×PBSでスライドを洗浄します。 </li><li> 1分間のDEPC処理PBSでスライドを洗浄し、その後、10分間、DEPC処理したPBS中の4％パラホルムアルデヒド中にスライドを浸します。 </li><li> 20分間0.5％の無水酢酸を含む0.1Mトリエタノールアミン - 塩酸（pH8.0）でのスライドを浸し、30秒間DEPC処理水でスライドを洗浄します。 </li></ol></li><li>プローブと洗浄とのハイブリダイゼーション<ol><li> 20分間、2×SSC緩衝液でスライドを浸し。 </li><li> 1 ngのμL-1のハイブリダイゼーション緩衝液（4×SSC、50％[体積/体積]ホルムアミド、1×デンハルト溶液、10％[重量/容量]デキストラン硫酸、0.1％[重量/容量]ドデシル硫酸ナトリウムでプローブを希釈0.4ミリグラムml -1のサケ精子DNA）。陰性対照のために、で標識したプローブをミックス非標識プローブの10倍過剰量。 </li><li>希釈されたプローブを変性させ、組織切片上に50〜400μLを適用します。スライドにカバースリップを置き、マニキュアで密封します。 </li><li> 45℃または最適な温度での加湿チャンバーのO / Nで10分間、90℃でのPCR装置内の熱スライドとインキュベートスライドはステップ1.4.11で決定されました。 </li><li> 、4℃で30分間スライドを冷却カバースリップを削除し、以下のようなシリアルSSC緩衝液でスライドを浸す：10分間の4×SSC、10のために20分間予熱した（45℃）2×SSC、2×SSC分、および10分間の0.2X SSC。 </li></ol></li><li>抗DIG AP結合抗体で検出<ol><li> 5分間MABTでスライドを洗浄します。 </li><li> 20分間、1％Tween 20でブロッキング溶液の50〜400μlのブロック。 </li><li>溶液（1：1,000）をブロックに希釈した抗DIG-AP抗体の50〜400μl添加しanld 37℃で90分間インキュベートします。 </li><li> 10分間MABTでスライドを洗浄します。 </li> &lt;Liが&gt; 5分間、1％Tween 20を含む検出緩衝液中でスライドを浸し。 </li><li> μ1mMのレバミゾールの内因性アルカリホスファターゼを不活性化するために5分間（1％Tween 20を含む検出緩衝液中で）50〜400で処理します。 </li><li>各試料にと開発された信号が良好になるまで2〜3時間、室温で加湿チャンバー内でスライドをインキュベート：（100 1で検出緩衝液で希釈）予混合NBT / BCIP溶液を50〜400μLを配布します。 </li><li>可視化を停止し、10分間37℃で0.05％カウンター染色として[重量/容量]メチルグリーンの50〜400μLを適用し、脱イオン水でスライドをすすぎます。 </li><li> 、脱イオン水でスライドを洗浄し、100％エタノール中で脱水し、キシレン中に浸します。 </li><li>各スライド上に取り付け、溶液の80μLを適用し、カバースリップでカバーしています。 </li></ol></li></ol>

<ol><li>Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+studies+of+human+gingiva.+II.+The+lower+part+of+the+pocket+epithelium+in+chronic+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis.</a> J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).</li>
<li>Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+invasion+of+the+periodontium%3B+an+important+factor+in+the+pathogenesis+of+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis.</a> J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).</li>
<li>Saglie, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+bacteria+in+the+oral+epithelium+in+periodontal+disease.+II.+Immunohistochemical+identification+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria.</a> J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).</li>
<li>Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+localization+of+Actinobacillus+actinomycetemcomitans.+in+human+periodontitis.+I.+Light%2C+immunofluorescence+and+electron+microscopic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies.</a> J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).</li>
<li>Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ.+correlative+immuno-identification+of+mononuclear+infiltrates+and+invasive+bacteria+in+diseased+gingiva%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva.</a> J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).</li>
<li>Rautemaa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+localization+of+Porphyromonas+gingivalis.+thiol+proteinase+in+periodontal+tissues+of+chronic+periodontitis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients.</a> Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).</li>
<li>Marttila, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+localization+of+Treponema+denticola.+chymotrypsin-like+proteinase+in+chronic+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Oral+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis.</a> J. Oral Microbiol. 6, (2014).</li>
<li>Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+intracellular+oral+species+within+human+crevicular+epithelial+cells+from+subjects+with+chronic+periodontitis+by+fluorescence+in+situ.+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontal+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization.</a> J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).</li>
<li>Abrams, K., Caton, J., Polson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+comparisons+of+interproximal+gingival+tissues+related+to+the+presence+or+absence+of+bleeding%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding.</a> J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).</li>
<li>Kim, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presence+of+Porphyromonas+gingivalis.+and+plasma+cell+dominance+in+gingival+tissues+with+periodontitis%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Dis%22%5BJournal%5D)">Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis.</a> Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).</li>
<li>Choi, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porphyromonas+gingivalis.+and+dextran+sodium+sulfate+induce+periodontitis+through+the+disruption+of+physical+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Inflammation%22%5BJournal%5D)">Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers.</a> Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).</li>
<li>Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+bacterial+invasion+and+differential+expression+of+tight+junction+proteins%2C+growth+factors%2C+and+growth+factor+receptors+in+periodontal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Periodontol%22%5BJournal%5D)">Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions.</a> J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).</li>
<li>Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+and+re-analysis+of+domain-specific+16S+primers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Review and re-analysis of domain-specific 16S primers.</a> J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).</li>
<li>Hajishengallis, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Low-abundance+biofilm+species+orchestrates+inflammatory+periodontal+disease+through+the+commensal+microbiota+and+the+complement%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement.</a> Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).</li>
<li>Axon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+cancer+and+Helicobacter+pylori%5BTitle%5D)+AND+%22Aliment.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Gastric cancer and Helicobacter pylori.</a> Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).</li>
<li>Fenhalls, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ.+detection+of+Mycobacterium+tuberculosis+transcripts+in+human+lung+granulomas+reveals+differential+gene+expression+in+necrotic+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions.</a> Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

ここで、DIG標識DNAプローブを用いてパラフィン包埋組織内の細菌をローカライズするためのプロトコルが記載されています。プローブは、細菌の16S rRNA遺伝子のDNAまたはRNA分子を標的とし、16S rRNAの標的プローブは、いずれかの種特異的または普遍として設計することができます。 P.の特異的ハイブリダイゼーションP.ジンジバリスに対する特異的プローブジンジバリスではなく、他の口腔内細菌には、以前に10が示されています。ハイブリダイゼーション効率が12を変化させるが、これとは対照的に、真正細菌プローブは、試験したすべての細菌ゲノムDNA（17異なる種）にハイブリダイズしました。プローブ内のT-ヌクレオチドの数は、DIG標識の効率を決定します。高感度のDIG標識プローブの製造は、記載されたプロトコルの実装を成功させるための最も重要なステップです。塩酸での試料の処理は、タンパク質の抽出及び部分hydrolysi介して信号対雑音比を向上させます標的配列のS。プロテイナーゼKの濃度の増加は、プローブのターゲットアクセシビリティは向上しますが...

細菌は、歯周炎、歯髄炎、歯冠周囲炎、蜂巣炎、骨髄炎などの様々な口腔疾患の病因における役割を果たしています。疾患の病因における細菌の役割を理解し、治療の効果を監視するために、組織内の細菌の局在化は重要です。歯周炎患者からの歯肉組織内の細菌の存在は、蛍光-を用いたin situハイブリダイゼーション （FISH）8 の細菌に特異的な抗体3-7、および蛍光を用いて、電子顕微鏡1,2を含む様々な方法を用いて、免疫組織化学および免疫蛍光が示されています16S rRNAのをターゲットに標識されたオリゴヌクレオチドプローブ。それにもかかわらず、これらの方法は広く、技術的制限または困難に使用されていません。抗体と比較して、16SのrRNAを標的とするプローブを生成し、種特異性を達成することは容易です。 FISHはBACTの可視化のための優れたツールであることが証明されましたこのようなプラークバイオフィルムとしての自然環境でERIA。しかし、組織サンプルのFISHの適用は、様々な組織成分の自己蛍光に限定されます。彼らは9出血含むとき、例えば、赤血球の強い自己蛍光は、しばしば、炎症組織への蛍光技術の適用を妨げます。 炎症を起こした歯肉組織内の細菌を局在化するためには、従って、ジゴキシゲニン（DIG）を用いたin situハイブリダイゼーション法での DNAプローブの開発に成功10,11に適用された標識。 Pを使用してパラフィン包埋組織内の細菌の局在化のためここでは詳細なプロトコールジンジバリス特異的およびユニバーサル真正細菌プローブが記載されています。同様の結果は、他の研究室で再現することができるように、これは、特に方法の標準化に焦点を当てています。このプロトコルは、その組織学的コンテキストとRESU内細菌の局在化を可能にしますLTSは非常に再現性があります。説明されたプロトコルのいずれかの様々な組織における種特異的または普遍方法で細菌をローカライズするために使用することができます。ユニバーサルプローブは、多菌性疾患中の細菌を検出すると、特定の細菌の役割は知られていない疾患における細菌の潜在的な役割を研究するために特に有用です。

<table><tbody><tr><td>無水酢酸</td><td>シグマ</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>50%デキストラン硫酸塩溶液</td><td>ミリポア</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>50Xデンハルト'sの解決</td><td>Σ</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Σ</td><td>P159220</td><td></td></tr><tr><td>DIG DNAの分類および検出のキット</td><td>Roche</td><td>11 093 657 910</td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td></td><td>Σ F9037</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge&trade;ペン</td><td>ダコ</td><td>H-400</td><td></td></tr><tr><td>レバミゾール</td><td>ベクター</td><td>SP-5000</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>シグマ</td><td>246964</td><td></td></tr><tr><td>マレイン酸</td><td></td><td>Σ M0375</td><td></td></tr><tr><td>メチルグリーン</td><td>Σ</td><td>M6776</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Σ</td><td>P1648</td><td></td></tr><tr><td>パーマウント</td><td>フィッシャー</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>サケ精子DNA溶液</td><td>Invitrogen</td><td>#15632-011</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Σ</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>Duksan</td><td>D1420</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Amresco</td><td>227</td><td></td></tr><tr><td>トリエタノールアミン-HCl</td><td>Σ</td><td>90279</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Research organics</td><td>3098T</td><td></td></tr></tbody></table>

16s rrnaのをターゲットジゴキシン標識dnaプローブを用いたパラフィン包埋組織内細菌のその場検出で

In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA

歯周炎患者の歯肉生検におけるポケット上皮およびその下の結合組織内の細菌の存在は、電子顕微鏡法、細菌特異的抗体を用いた免疫組織化学または免疫蛍光法、蛍光標識オリゴヌクレオチドプローブを用いた蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）など、さまざまな方法を用いて報告されています。それにもかかわらず、これらの方法は技術的な制限や困難のために広く使用されていません。ここでは、DIG標識DNAプローブを用いてパラフィン包埋組織内に細菌を局在化する方法を紹介しました。パラフィン包埋組織は、病理学バンクから入手できる最も一般的な生検組織です。細菌は、種特異的または普遍的な方法で検出できます。細菌のシグナルは、細菌の離散型(球菌、桿体、紡錘状、毛状)または分散型として検出されます。この技術により、上皮、結合組織、炎症性浸潤物、血管など、他の組織学的情報を取得することができます。この方法は、歯周炎、癌、炎症性免疫疾患などのさまざまな疾患における細菌の役割を研究するために使用できます。

図1に示すように、それらの感受性を決定するためのキットで提供ポジティブコントロールプローブと比較してDIG標識プローブのドットブロッティング。 343 bpのP.ジンジバリス特異的プローブは、70塩基対真正細菌プローブよりも25倍より敏感である。Pの検出のための慢性歯周炎の患者から得られた歯肉組織のin situハイブリダイゼーション 図2図 ジンジバリスと真正細菌。紫色に示す細菌の信号は、組織の外側に位置する上皮、粘膜固有層、およびバイオフィルム内で検出されました。しかし、Pの分布歯肉組織内ジンジバリスと真正細菌は異なっていました。唯一の棒状の細菌はP.によって検出しながら、高倍率（1,000倍）で、細菌の様々な形状（コッカス、ロッド、紡錘状、毛状の形）は、真正細菌プローブを使用して見ることができましたジンジバリス特異的プローブ。細菌信号の分散形また、観察されました。 <p class="jove_...

ここでは、DIG標識された16S rRNA標的DNAプローブを使用して、パラフィン包埋組織内の細菌を局在化する方法が説明されています。このプロトコルは、歯周炎、癌、炎症性免疫疾患などのさまざまな疾患における細菌の役割を研究するために適用できます。

16S rRNAのをターゲットジゴキシン標識DNAプローブを用いたパラフィン包埋組織内細菌のその場検出で

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been ...

この手順の全体的な目的は、DIG標識された16sリボソームRNA標的DNAプローブを用いて、パラフィン包埋組織内の細菌を局在化させることです。これは、まずPCR増幅とDIG標識によってプローブを調製することで達成されます。次のステップでは、標的部位へのアクセス性を高め、バックグラウンドの結合を低減させるために組織切片の調製を行います。次に、調製した組織切片をdig標識プローブでハイブリダイズさせます。最後に、ハイブリダイズしたプローブを、アルカリフォスファターゼ標識抗dig抗体を用いて検出します。最終的に、このC2ハイブリダイゼーション法により、パラフィン包埋組織における細菌の存在を示すことができます。INGなどの既存の手法に対する本検出法の利点は、組織学的構造の中で細菌のSHSを検出できる点にある。本手法は、歯周病やR planetなどの様々な炎症性疾患における病態生理への知見を提供し得る。組織切片は損傷しやすいため、組織標本の作製およびハイブリダイゼーション後のダイジェスチョン（消化）ステップの操作が困難であり、本手法を視覚的に提示することは極めて重要である。U細菌プローブを作製するには、70 base pairのDNA断片をテンプレートとして使用し、2本の15 base pairプライマーを用いてPCRによりプローブを増幅させます。増幅産物を既知濃度のバッファー中で回収します。その後、dig DNA labeling and detection kitを用いてプローブを標識します。まず、3 µgのプローブを15 µLの水に混合します。ヒートブロックを用い、95 °Cで10分間プローブを変性させます。その後、変性させたプローブを氷上に置きます。次に、10 XHヌクレオチドを2 µL、DN NTPsを2 µL、およびcanal enzymeを1 µL加えます。混合後、プローブを37 °Cで24〜48時間インキュベートします。混合物を65 °Cに加熱して反応を停止させます。次に、標識プローブのDNA濃度を260ナノメートルで測定し、濃度を100ng/µLに調整します。キットを使用して、まずナイロンメンブレン上に連続希釈したポジティブコントロールを1µLロードし、プローブおよびDIG標識プローブの感度を確認します。メンブレンを5分間乾燥させます。乾燥後、メンブレンを2 XSSCに短時間浸し、その後80 °Cのインキュベーターで1時間処理します。インキュベーション後、DNAを固定するためにメンブレンをマレイン酸緩衝液に短時間浸し、30分後に1:5,000に希釈したAP結合抗体を含むブロッキング緩衝液に移します。メンブレンをMABTで洗浄します。次に、N-B-T-B-C-I-P 40 µLを2 mLの検出バッファーに混合します。洗浄後、この混合液をメンブレンに1分間加えます。本文のプロトコルに従ってパラフィンを除去し、組織切片を再水和させた後、in situ ハイブリダイゼーションの準備を行います。まず、スライドを0.1 N 塩酸に20分間浸します。酸浴の後、DEPC処理水でスライドを30秒間洗浄します。次に、ワックスペンを用いて、各スライド上の検体の周囲を囲みます。次に、検体の大きさに応じて 50 ～ 400 µL のプロテアーゼK溶液を検体に加えます。37 °C で 30 分間酵素を反応させた後、DEPC処理済み 1×PBS でスライドを 1 分間洗浄します。その後、スライドを DEPC処理済み PBS で調製した 4% パラホルムアルデヒド溶液に移し、10 分間置きます。前述と同様に、PBSで固定液を洗い流します。次に、pH 8の0.1 Mトリエタノールアミン塩酸塩および0.5%酢酸水溶液にスライドを20分間浸します。その後、前述と同様に清潔な水でスライドを洗浄します。続いて、まずスライドを2 X SSCに20分間浸し、in C 2を開始します。その間に、ネガティブコントロール用に、ラベル付きプローブをハイブリダイゼーションバッファーで1 ng/µLに希釈します。非ラベル化プローブは、その10倍の濃度で使用します。その後、プローブを90 °Cで10分間加熱して変性させ、直ちに氷上で急冷します。次に、あらかじめ塗布したproteinase Kと同量のプローブ希釈液を各スライドに滴下します。その後、慎重にカバーガラスを被せ、マニキュアを用いて切片を封入します。続いて、PCRマシンのヒートブロックを用いてスライドを90 °Cで10分間加熱し、その後45 °Cの加湿インキュベーターに移して翌日まで一晩静置します。スライドを4°Cで30分間冷却した後、カバーガラスを注意深く取り除きます。組織は脆弱です。最後に、室温で一連のSSCバッファーにスライドを浸します。まず、ハイブリダイズさせた2枚のNCスライドをMABTで5分間洗浄します。次に、1% tween 20を含むブロッキング溶液を50～400 µL滴下し、20分間静置します。ブロッキング後のインキュベーション後、1:1000に希釈したanti-D dig アルカリホスファターゼ抗体とブロッキング溶液の混合液を50～400 µL滴下します。一次抗体を適用した後、37°Cで90分間反応させます。スライドをMABTで10分間洗浄します。その後、1% Tween 20を含む検出バッファーにスライドを5分間浸します。次に、1 mMのole検出緩衝液を各スライドに50～400 µL滴下し、5分間インキュベートして内因性アルカリフォスファターゼを不活性化させます。続いて、検出緩衝液で1:100に希釈したN-B-T-B-C-I-Pを各スライドに50～400 µL添加し、経験に基づいた適切な時間（通常2～3時間）、加湿チャンバー内でインキュベートします。スライドをDI waterで洗浄し、0.05% (w/v) のメチルグリーンを滴下して、37°Cで10分間対比染色を行います。再度スライドをDI waterで洗浄し、100% ethanolで脱水した後、キシレンに浸します。最後に、封入剤を 80 µL 添加し、カバーガラスで覆います。プローブのジゴキシゲニン標識後、スライドを準備しました。その感度を、陽性コントロールプローブの希釈系列と比較して評価しました。43塩基対の p. gingivalis 特異的プローブは、設計された70塩基対の細菌プローブよりも25倍感度が高かった。次に、これら2種類のプローブを用い、慢性歯周炎患者の歯肉組織を高倍率で観察した。細菌プローブを使用することで、細菌の様々な形態を識別することができた。p. gingivalis 特異的プローブでは桿菌のみが検出されましたが、タイトジャンクションを破壊する化学物質である DSS をマウスの歯肉粘膜に投与しました。これらのマウスから採取した組織サンプルを用いて、異なる条件下でプローブの比較を行いました。その結果、U 細菌プローブは、もう一方のプローブでは検出できなかった細菌を検出することができました。次に、腫瘍を含む肺組織切片における他の細菌の検出能について、U細菌プローブの検証を行った。その結果、腫瘍内部および腫瘍外部の両方で細菌が検出された。また、病因不明の疾患である口腔扁平苔癬患者の組織を調べたところ、炎症性浸潤が認められた上皮および固有層の細胞内に細菌プローブによる細菌シグナルが検出された。本手法の開発以来、感染症分野の研究者は、この手順に従うことで、ヒトおよび動物の両方における細菌の組織内侵入を探索することが可能となりました。また、どのような種類の細胞が組織内で細菌を保持しているかといった追加の疑問に答えるために、細胞マーカーに対する免疫化学的検出などの他の手法を併用することができます。

in-situ-detection-bacteria-within-paraffin-embedded-tissues-using

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は最近、単純な細菌検出用蛍光アッセイを "ミックス·アンド·読む"を設定するために適用できる蛍光DNAザイムプローブを生成するための斬新なアプローチが報告されています。これらの特殊なDNAプローブは、それによって蛍光シグナルの生成に細菌検出を翻訳する特定の細菌によって産原油の細胞外液（CEM）の存在下で発色団修飾DNA-RNAキメラ基質の切断を触媒する。本報告では、特定のDNAザイムプローブは、...

蛍光性DNAzymesを使用した細菌の検出

出典: Choi, Y. S. ほか16S rRNAを標的としたジゴキシン標識DNAプローブを用いたパラフィン埋め込み組織内の細菌の現場検出。 J. Vis.

マウスの歯肉組織切片における細菌の現場検出

このビデオは、尿路感染患者の脱パラフィン化された膀胱組織中の細菌の視覚化を示しています。細菌の16sリボソームRNAとハイブリダイズした蛍光標識プローブは、組織関連細菌とその分布を明らかにし、サンプル内のそれらの密度に関する貴重な空間的洞察を提供します。...

蛍光In Situハイブリダイゼーションによる膀胱生検切片の細菌の可視化

ここでは、ホールマウント蛍光を記述...

ホールマウントRNAを蛍光<em&gt;その場で</emの&gt;ハイブリダイゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;胚

このビデオの目的は、臨床の場で珍しい変異を検出するために、ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）参照標準細胞株およびデジタル滴PCR（ddPCR）分析から、自動化されたDNAの抽出を実行する方法を実証することです。 FFPEサンプルにおける変異を検出することはFFPEサンプルでddPCRの臨床的有用​​性を示します。...

ホルマリン固定パラフィン包埋参照標準細胞株にBRAF V600E変異を検出するデジタルドロップレットPCRを採用

ここでは、空間的そして一時的変更されたホール マウント in situ...

ホール マウントIn Situハイブリダイゼーションによる目盛りの腸内微生物叢の可視化

このプロトコルの目標はパラフィンに埋め込まれているされていると、スライド ガラス上に断面採取したサンゴ大人上の in situハイブリダイゼーションを行うことです。これはパラフィン包埋組織の RNA アンチセンス...

その場でパラフィン埋め込まれた大人サンゴの標本の交配の技術

このプロトコルは、その中のハイブリダイゼーションおよび共焦点顕微鏡における16S...

膀胱生検における組織常駐細菌の検出 16S rRNA 蛍光におけるインシッツハイブリダイゼーション

この合理化されたプロトコルは、組織の固定から、その場で蛍光を伴う微生物の染色まで、複雑な組織サンプル 中の 細菌を検出し、画像化するワークフローを詳述しています。...

蛍光を介した蛍光による腸内微生物叢-宿主相互作用の可視化( Situ ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージング)

細胞外細菌やオルセーウイルスや微胞子虫(真菌)などの細胞内病原体を含む腸内微生物は、野生の カエノラブディティス 線虫と関連していることがよくあります。この記事では、 C.エレガンス...

RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)による カエノラブディティスエレガンス 腸における微生物のコロニー形成と感染を可視化

このプロトコールは、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織標本の遺伝子増幅を視覚化するための再現性のある方法を提供します。...

蛍光In Situハイブリダイゼーションによるホルマリン固定パラフィン包埋サンプルにおける遺伝子増幅のロバスト検出

学ぶパラフィン包埋組織内細菌のその場検出法。DIG標識16S rRNA標的DNAプローブとアルカリホスファターゼ抗体を用い、歯周病やがんなどの細菌関与疾患の病態解明に応用できます。

16S rRNAのをターゲットジゴキシン標識DNAプローブを用いたパラフィン包埋組織内細菌のその場検出で

さらに動画を探す