人工細胞外マトリックス（AECM）タンパク質からの設計と構築エシェリヒア·コリ皮膚組織工学のための

この手順の全体的な目標は、人工ECMタンパク質またはエラスチン様リピートを含むECMの構築と製造に関与するステップを実証することです。これは、まずA ECMタンパク質をコードする組換え遺伝子を構築することによって達成されます。次に、組換え遺伝子を細菌宿主に挿入します。

この時点で、組換えタンパク質は細菌宿主で発現し、細胞溶解によるタンパク質抽出後に回収されます。最後のステップは、エラスチンのユニークな相転移挙動を利用する逆遷移サイクルまたはITCを使用してタンパク質を精製することです。ポリペプチドのように。

遠心分離サイクルは、摂氏4度と摂氏37度で行われます。最終的には、ゲル電気泳動とウェスタンブロット技術を使用して、組換えタンパク質を同定し、その純度を決定します。この手法は、アフィニティーカラムなどの既存の方法と比較した場合の主な利点は、比較的安価に大量のタンパク質を抽出できることです。

この手順は、テキストプロトコルで説明されているように、すべての靭帯設計から開始します。オリゴマーが得られたら、DNAオリゴマーをアニルして目的の遺伝子配列を取得します。まず、DNAオリゴヌクレオチドをDNAオリゴバッファーに溶解し、最終濃度が1マイクロリットルあたり1マイクログラムになります。

すべての靭帯の各マイクロリットルを32マイクロリットルのDNAとニーリングバッファーに加えて、合計40マイクロリットルの混合物を実現します。次に、ホットプレートを使用してビーカーの水を沸騰させ、混合物を5分間浸します。摂氏95度でビーカーを取り外し、発泡スチロールの箱でセットアップ全体を一晩で徐々に冷却すると、オリゴマーはひざまずき、消化の準備ができています。

対応する制限酵素を添加して、al oligomers と host ベクターを別々に消化します。これは、Protocol Digest のテキストに記載されているように、摂氏 37 度で 3 〜 4 時間です。アガロースゲル上で消化産物を泳動し、DNAを精製した後、消化したDNAインサートをプラスミドベクターにT-4リガーゼでライゲーションすることにより、目的の遺伝子を順次結合します。テキストプロトコールに記載されているレシピを使用して、ライゲーション混合物を室温で2時間インキュベートします。

次に、Aliによるヒートショックを使用して細胞を形質転換します。50マイクロリットルのコンピテントセルを、事前に冷却した清潔なマイクロ遠心チューブに注入します。ライゲーション混合物の5マイクロリットルを細胞にピペットで入れ、ピペッティングで穏やかに上下させて混合します。

混合物を氷の上に20分間放置します。次に、細胞混合物を含むマイクロ遠心チューブを摂氏42度の水浴に2分間浸し、2分間氷に戻します。500マイクロリットルのSOC培地をマイクロ遠心チューブに加え、摂氏37度で1時間振とうしながらインキュベートします。

インキュベーション後、50〜500マイクロリットルの細胞ライゲーション混合物を、室温に予温したアンピシリンを含む2倍のYTオーガープレートに広げます。プレートを逆さまにして摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、清潔なピペットチップを使用してオーガープレートからDNAコロニーをピックアップします。

コロニーを5ミリリットルで2回成長させます。アンピシリンを含むYT培地を摂氏37度で一晩中、翌日振とうします。メーカーのプロトコールに従ってプラスミド単離キットを使用して、各コロニーのDNAプラスミドを抽出します。

摘出した溶出物は、テキストプロトコルに記載されているように、組換えプラスミドを細菌発現宿主に形質転換した後、DNAを50マイクロリットルの水で溶出させる。変換されたオーガープレートからコロニーを選び、ピペットチップで接種します。試験管にアンピシリンとクロラムフェニコールの両方の抗生物質を含む10ミリリットルの無菌で素晴らしいブロスまたは結核培地。

このスターター培養物を摂氏37度で一晩インキュベートし、225 RPMで振とうします。次に、10ミリリットルのスターター培養物を1リットルの新鮮で無菌の結核培地に移します。3リットルのアーリンマイヤーフラスコに同じ抗生物質を補給しました。

培養物を摂氏37度でインキュベートし、225RRP Mで2〜3時間振とうします。600ナノメートルまたはOD600で培養物の光学密度を観察し、1ミリリットルの培養物を空のQ獣医にピペットで移して読み取り、0.6〜0.8に達したことを確認します。次に、IPTGで培養物を最終濃度1ミリモルまで誘導し、摂氏37度でインキュベートし、225 RPMでさらに4時間振とうします。

培養物を1リットルの遠心分離機、ボトルに移し、摂氏4度で30分間12、000Gで遠心分離することにより、細胞を収穫します。上清を捨てた後、細胞ペレットを秤量し、0.5グラム/ミリリットルで10バッファーに再懸濁します。再懸濁した細胞培養物をマイナス80°Cで一晩凍結します。

翌日、凍結した細胞培養物を室温または氷上で水浴中で解凍します。Lに、細胞はデオキシリボヌクレアーゼ、1つのリボヌクレアーゼaおよびフェニルメチルスエンフッ化物を添加する。溶液を解凍しながら、ゆっくりと攪拌しながら溶液を均質化します。

すべての再懸濁細胞を解凍した後、溶液をpH 9.0に調整して、タンパク質の水への溶解度を非常に慎重に高めます。6つのN水酸化ナトリウムを氷上で攪拌しながら滴下し、均一な一貫性を達成します。次に、直径2ミリメートルの平らな先端と5秒のパルスを使用して、氷上で20分間超音波破壊により細胞をシラミにします。

細胞溶液を12, 000Gで摂氏4度で30分間遠心分離します。スーパーナットを清潔な空のボトルに移し、後で精製するために摂氏4度で保存します。その間、細胞ペレットを10バッファーで再度懸濁し、細胞溶解物を20マイクロリットル保存します。

SDSページの特性評価では、再懸濁した細胞ペレットをマイナス80°Cで再凍結し、細胞溶解を完了させます。凍結融解と超音波処理のプロセスを最大3回繰り返します。先ほどの細胞ライセートをコレートし、ITCを用いてA ECMタンパク質の精製を進め、高塩条件で異なる温度で遠心分離サイクルを行います。

細胞溶解物を50ミリリットルの遠心分離機、ボトル、および摂氏4度で2時間40,000Gで遠心分離機に分割します。ピペッティングで上清を取り除き、ペレットからきれいに分離します。上清を清潔な遠心分離ボトルに集め、塩化ナトリウムを最終濃度1モルまで加えます。

225RPMで振とうしながら、溶液を摂氏37度に2時間温めます。次の遠心分離機。上清は摂氏37度で2時間、40, 000Gです。

デカンテーション後、上清は金属ヘラを使用してペレットを粉砕し、ペレットビットを氷に再懸濁します。冷たいオートクレーブ蒸留水を、ペレットが完全に溶解するまで磁気攪拌棒とプレートを使用して摂氏4度で一晩激しく攪拌しながら蒸留します。摂氏37度のペレットが白くなるまでこれらのサイクルを繰り返し、その時点で一晩水に溶解して遠心分離することができます。

タンパク質溶液を得るためには、タンパク質溶液を4°Cの蒸留水に対して透析することによりタンパク質溶液を脱塩し、4時間ごとまたは8時間ごとに水を交換して2〜3日間一晩、SDSページ用の精製タンパク質の残りをここに示すように凍結乾燥する。強力なタンパク質バンドは、誘導サンプル中の予測分子量にあります。また、ラミニン5A ECMに対応する分子量22キロダルトンの精製タンパク質サンプルを含むSDSページゲルも示されています。

A ECMタンパク質の推定純度は約90〜95%であり、この値は、標的タンパク質とSDSゲル上に存在する他のタンパク質バンドのバンド強度の比を比較することによって導き出されました。最後に、精製されたタンパク質が本当にA ECMタンパク質であるかどうかを判断するために、ここでウェスタンブロッティングを行いました。3つのA ECMタンパク質のタンパク質純度をSDSページゲルで示し、ウェスタンブロッティング用のニトロセルロースメンブレンの画像と比較します。

この分析により、標的タンパク質であるコラーゲン4 A ECMと、西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した抗ヘキサヒスチジンタグ抗体を使用してタグ付けされたラミネート5 A ECMの存在が明らかになりました。A ECMタンパク質の最終収量は、1リットルあたり60ミリグラムから120ミリグラム/リットルの範囲でした。このビデオを見れば、特定のアプリケーションに適したエラスチンライトドメインを含むタンパク質を収縮および精製する方法を十分に理解できるはずです。