Name: 人工細胞外マトリックス（AECM）タンパク質からの設計と構築エシェリヒア·コリ皮膚組織工学のための (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 学ぶエラスチン様繰り返しを含む人工細胞外マトリックス（aECM）タンパク質の構築と精製法。大腸菌を用いた遺伝子組み換え技術と逆相転移サイクリング（ITC）による精製プロセスを解説し、組織工学への応用可能性を示します。

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著者らは、文部省のACRFティア1（RG41）からの資金を確認し、南洋理工大学から助成金を起動したいと思います。低く、Tjinは南洋工科大学、シンガポールから研究生奨学金（RSS）によって賄われています。

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</ol>

著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。

組換えタンパク質工学は、ボトムアップアプローチを用いた新規タンパク質材料を作成するための汎用的な技術です。タンパク質ベースの材料は、目的の用途に応じて調整、複数の機能を有するように設計することができます。によるクローニングおよびタンパク質発現技術の増加発展には、再現性があり、スケーラブルな方法で人工タンパク質の様々なを作成するために、比較的簡単な（かつ費用対効果の高い）となっています。エラスチン様ドメインが精製タグとして機能するだけでなく、機械的特性を付与するために、人工タンパク質の数に組み込まれています。エラスチン様配列を含む人工タンパク質が容易に高価な精製カラムおよび抗体の必要性を排除するITCを用いて精製することができます。 このプロトコルは、AECMタンパク質をコードする組換えプラスミドを構築する手順について説明します。エラスチン様反復をコードする遺伝子は、購入しました。のためにポリペプチドのようなエラスチンのような反復性の高いペプチド配列は、再帰的な方向性ライゲーション（RDL）戦略は22を使用することができるようなクローニング戦略を設計することをお...

数十年にわたり、合成材料と天然材料の両方が組織工学の足場として利用されてきました1,2。ポリマーなどの合成材料は、優れた構造的完全性と調整可能な機械的特性を提供しますが、組織の成長と浸潤を促進するには不十分な生理活性を持つことがよくあります。一方、細胞外マトリックス(ECM)タンパク質などの天然素材は、優れた生物活性を持っていますが、バッチ間のばらつき、急速な分解、免疫原性の問題などの制限があります。そのため、組換えタンパク質は、天然タンパク質3,4の望ましい特性のみを模倣するように設計できるため、望まれている。
組換えタンパク質工学は、新規人工タンパク質バイオポリマーの設計と製造のための多用途のプラットフォームとして、幅広い関心を集めています。遺伝子配列を制御することにより、人工タンパク質の機能をさまざまな用途に合わせて調整することができます5,6。特に、人工細胞外マトリックス(aECM)タンパク質は、組織工学、再生、創傷修復のアプリケーション向けに複数の機能を持つように調整することができます2,7。さらに重要なことは、クローニングおよび精製技術の進歩により、スケーラビリティが向上し、組換えタンパク質の製造コストが大幅に削減されたことです。低コストで大量の組換えタンパク質を生産することが可能であり、これは臨床での使用にとって経済的である5。
人工細胞外マトリックスタンパク質は、組織工学の応用8-11のために開発されました。例えば、Tirrellらは、フィブロネクチンCS5配列とエラスチン様リピート(ELP-CS5)を含む人工タンパク質を用いて、小径の血管移植片を設計しました。彼らは、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)がこれらの材料に付着して成長できることを示しました12。また、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、フィブリノーゲン、ビトロネクチンから採取した短い生理活性配列や、エラスチン、クモの糸、コラーゲンを模倣した構造ドメインを組み込んで、さまざまな融合タンパク質を作製しているものもあります10。エラスチンベースのaECMタンパク質から作られたバルク架橋フィルムも、天然エラスチンと同様の機械的特性を示しました(弾性率は0.3〜0.6 MPaの範囲)13。その後、より長いフィブロネクチン断片を含むaECMタンパク質も、インテグリン結合親和性の増加によりin vitroで創傷治癒を促進すると報告されました8。
最近、インテグリン特異的な人工ECMタンパク質がTjinと共同研究者によって開発されました14。各aECMタンパク質には、ラミニン-5、コラーゲン-IV、フィブロネクチンなど、ヒトの天然皮膚2,7,15のECM成分から採取された生理活性細胞結合ドメインが含まれています。例えば、インテグリンα3β1は、ラミニン-5α-3鎖球状ドメイン3(LG3)16,17に見出されるPPFLMLLKGSTR配列に結合することが示されている。彼らの報告では、初代ヒト皮膚表皮ケラチノサイトは、存在する細胞結合ドメインの種類に応じて、各aECMタンパク質への結合に異なるインテグリンを優先的に関与させることを示しました。
Tjinらの研究で議論されているaECMタンパク質は、人間の皮膚の機械的特性を模倣する弾性を付与するエラスチン様ドメイン{(VPGIG)2VPGKG(VPGIG)2}8を隣接して含んでいます。さらに、エラスチン様リピート内にリジン残基が取り込まれると、水性溶媒への全体的なタンパク質溶解度も増加します。さらに、リジン残基は、架橋されたaECM膜の形成を促進するための架橋部位としても機能する12。aECMタンパク質配列内にエラスチン様リピートを含めることで、逆遷移サイクリング(ITC)14によりタンパク質を容易に精製することができます。エラスチンは、下臨界溶液温度(LCST)または逆転移温度(Tt)18-20として知られる特定の温度で急激で可逆的な相転移を受けます。エラスチンとエラスチン様リピートは、LCSTより下では親水性のランダムコイル構造を採用して水溶性になりますが、LCSTより上では、エラスチンは急速に凝集してミクロンサイズの粒子になります。このような相転移は可逆的であり、したがって、エラスチンベースのaECMタンパク質をITC技術21を介して容易に精製できるようにするために利用することができる。
この研究では、エラスチン様リピートに融合した生理活性細胞結合ドメインを含む人工ECMタンパク質を設計、構築、精製するための一般的な手順を報告します。aECMタンパク質のアミノ酸配列をコードするプラスミドを設計し、クローニングするプロセスについて説明します。ITCを使用してaECMタンパク質を精製するための手順を概説します。最後に、SDS-PAGE電気泳動とウェスタンブロッティングを使用して得られたaECMタンパク質の純度を決定する方法について説明します。

<table><tbody><tr><td>pET22b (+)</td><td>Novagen</td><td>69744</td><td>T7 発現ベクターとアンピシリン耐性&nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysS&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C6060-03</td><td>追加の抗生物質 - クロラムフェニコール</td></tr><tr><td>イソプロピル-β-D-チオガラクトシド (IPTG)</td><td>ゴールド バイオテクノロジー</td><td>I2481C</td><td>1 M ストック溶液とオートクレーブ水、導入前に新鮮にしてください。</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>プラスミド分離キット</td></tr><tr><td>T4 リガーゼ</td><td>ニューイングランド Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>Affymetrix</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Affymetrix</td><td>23660</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean&trade; ゲル DNA 回収キット</td><td>Zymo Research</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>XL10-金株</td><td>アジレントテクノロジー</td><td>ズ200315</td><td></td></tr></tbody></table>

人工細胞外マトリックス（aecm）タンパク質からの設計と構築<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;皮膚組織工学のための

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

組換え技術は、調整可能な特性を持つ新しい人工タンパク質を作成するための多用途のプラットフォームです。過去10年間で、自然界に由来する機能ドメインを組み込んだ(またはde novoに作成された)多くの人工タンパク質が報告されています。特に、人工細胞外マトリックス(aECM)タンパク質が開発されています。これらのaECMタンパク質は、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンから採取された生物学的ドメインで構成され、エラスチン様リピート、シルク、コラーゲンリピートなどの構造ドメインと組み合わされています。今日まで、aECMタンパク質は、組織工学や創傷修復への応用について広く研究されてきました。最近、Tjin氏らは、ヒトの皮膚ケラチノサイトの接着と増殖を促進するために設計されたインテグリン特異的なaECMタンパク質を開発しました。彼らの研究では、aECMタンパク質は、フィブロネクチン、ラミニン-5、コラーゲンIVから採取した細胞結合ドメインと、隣接するエラスチン様リピートを組み込んでいます。彼らは、彼らの研究で開発されたaECMタンパク質が人工皮膚の基質として使用するための有望な候補であることを示しました。ここでは、このようなaECMタンパク質の設計と構築、およびエラスチンの熱応答性を利用した精製プロセスについて概説します。

エラスチン様反復を含む融合タンパク質を設計するには、全体のエラスチン含有量は、融合タンパク質18の十分大きな部分を維持することが重要です。これは、融合タンパク質構築物は、精製のためにITCを使用するために、そのエラスチン様特性を保持することを保証することです。このセクションで説明AECMタンパク質の設計および配列は、特にTjin らによって研究から採取した。14。この研究では、三AECMタンパク質が正常たpET22b（+）発現ベクターにクローニングしました。シーケンシャル連結は、最初の細胞結合ドメインを挿入することにより、その後、エラスチン反復はpETベクターに挿入結紮から始まりました。最後に、エラスチン反復の最後のセットは、同じ方法を用いて、細胞結合ドメインの末端に挿入しました。組換え遺伝子が正常に構築されているかどうかを確認するには、それぞれの組換えプラスミドは、試験37℃で3時間、XhoIおよびSalIで消化し、C. 図1は、テスト消化後にDNAインサートとベクターのバンドを示しています。 AECMタンパク質のそれぞれ...

組換え技術により、材料設計者は組織工学アプリケーション向けにカスタマイズされた機能を持つ新しい人工タンパク質を作成することができました。例えば、人工細胞外マトリックスタンパク質は、天然ECMに由来する構造的および生物学的ドメインを組み込むように設計することができます。ここでは、エラスチン様リピートを含むaECMタンパク質の構築と精製について説明します。

人工細胞外マトリックス（AECM）タンパク質からの設計と構築<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;皮膚組織工学のための

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

この手順の全体的な目的は、人工ECMタンパク質、またはエラスチン様リピートを含むA ECMの構築および製造に関わるステップを示すことです。これは、まずA ECMタンパク質をコードする組換え遺伝子を構築することで達成されます。次に、その組換え遺伝子を細菌宿主に導入します。この段階で、組換えタンパク質が細菌宿主で発現され、細胞溶解によるタンパク質抽出に続いて回収されます。最終ステップは、エラスチン様ポリペプチドの特有の相転移挙動を利用した、逆転移サイクリング（ITC）を用いてタンパク質を精製することです。遠心分離サイクルは4°Cおよび37°Cで行います。最終的に、ゲル電気泳動とウェスタンブロット法を用いて、組換えタンパク質の同定および純度の決定を行います。アフィニティーカラムなどの既存の手法と比較した本手法の主な利点は、大量のタンパク質を比較的安価に抽出できることです。本手順を開始する前に、テキストプロトコルに記載されている通り、すべてのリガンド設計を完了させてください。オリゴマーが得られたら、DNAオリゴマーをアニールさせ、目的の遺伝子配列を得ます。まず、DNAオリゴヌクレオチドをDNAオリゴバッファーに溶解し、最終濃度を1 µg/µLに調整します。各オリゴヌクレオチド 4 µLを、32 µLのDNAおよびアニーリングバッファーに加えて、合計40 µLの混合液にします。次に、ホットプレートでビーカーの水を沸騰させ、そこに混合液を5分間浸漬させます。95 °Cに達したらビーカーを取り出し、 styrofoam ボックス内で一晩かけて徐々に冷却します。これでオリゴマーのアニーリングが完了し、消化の準備が整いました。テキストのプロトコルに従い、alオリゴマーとホストベクターをそれぞれ消化するために、対応する制限酵素を添加し、37 °Cで3〜4時間消化させます。消化産物をアガロースゲルで電気泳動し、DNAを精製した後、T4リガーゼを用いて消化したDNAインサートをプラスミドベクターにライゲーションさせ、目的遺伝子を順次結合させます。テキストプロトコルに記載された組成に従い、ライゲーション混合液を室温で2時間インキュベートしてください。次に、ヒートショック法を用いて細胞を形質転換します。あらかじめ冷却した清潔なマイクロ遠心チューブに、コンピテントセルを50 µL分注します。ライゲーション混合液5 µLを細胞にピペッティングし、緩やかに吸い上げと吐き出しを繰り返して混合します。混合物を氷上で20分間静置します。次に、細胞混合物を含むマイクロ遠心チューブを42 °Cのウォーターバスに2分間浸漬させ、再び氷上で2分間静置します。マイクロ遠心チューブに500 µLのSOC培地を加え、37 °Cで1時間振盪培養します。インキュベーション後、細胞ライゲーション混合液を50から500 µL、室温に予熱したアンピシリン含有2×YTアガープレートに塗布します。プレートを逆さまにした状態で37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、清潔なピペットチップを用いて、アガープレートからDNAコロニーをピックアップします。アンピシリンを含む2倍濃度のYT培地5 mLで、37°Cにて一晩振盪培養します。翌日、各コロニーからDNAプラスミドを抽出するため、製造元のプロトコルに従ってプラスミド単離キットを使用します。テキストプロトコルに記載されている通り、組換えプラスミドを細菌発現宿主に形質転換した後、50 µLの水でDNAを溶出させ、回収します。形質転換後のアガープレートからピペットチップでコロニーをピックアップし、試験管に入れた10 mLの滅菌済みのTerrific Brothまたはアンピシリンとクロラムフェニコール両方の抗生物質を含むTB培地に接種します。このスターター培養物を37 °Cで、225 RPMで振盪しながら一晩インキュベートします。その後、スターター培養物10 mLを、同一の抗生物質を添加した1 Lの新鮮で滅菌済みのTB培地（3 Lエルレンマイヤーフラスコ）に継代します。培養液を37 °Cで225 RPMで振盪しながら2〜3時間インキュベートします。培養液1 mLを空のキュベットに分注し、600 nmでの光学密度（OD 600）を測定して、0.6〜0.8に達していることを確認します。次に、最終濃度が1 mMとなるようにIPTGを添加して誘導し、37 °Cで225 RPMで振盪しながらさらに4時間インキュベートします。培養液を1リットルの遠心分離チューブに移し、4°Cで12,000 Gsにて30分間遠心分離して細胞を回収します。上清を捨てた後、細胞ペレットの重量を測定し、10 bufferを用いて0.5 g/mLとなるように再懸濁します。再懸濁した細胞培養液を-80°Cで一晩凍結させます。翌日、凍結した細胞培養物を室温の水浴または氷上で解凍します。細胞にdeoxy ribonuclease one、ribonuclease a、およびphenyl methyl suen fluorideを添加します。溶液を解凍しながら、ゆっくりとかき混ぜて溶液を均質化します。再懸濁したすべての細胞を解凍した後、水に対するタンパク質の溶解度を高めるため、非常に慎重に溶液のpHを9.0に調整します。氷上で撹拌しながら、6 N水酸化ナトリウムを滴下し、均一な状態にします。次に、直径2 mmのフラットチップを用い、5秒間のパルスで、氷上で20分間超音波破砕して細胞を溶解させます。細胞溶液を12,000 Gsで30分間、4°Cで遠心分離します。上清を清潔な空のボトルに移し、後の精製のために4°Cで保存します。その間に、細胞ペレットをさらに10 bufferで再懸濁し、細胞溶解液を20 µL分保存します。SDS-PAGEによる特性解析のため、再懸濁した細胞ペレットを-80°Cで再凍結し、細胞溶解を完結させます。凍結融解と超音波処理の工程を最大3回繰り返します。先に調製した細胞溶解液をまとめ、高塩濃度条件下で異なる温度での遠心分離サイクルを行うITCを用いて、A ECMタンパク質の精製を行います。細胞溶解液を50 mLの遠心ボトルに分注し、4°Cで40,000 Gで2時間遠心分離します。ピペッティングにより上清を除去し、ペレットと完全に分離させます。上清を清潔な遠心ボトルに回収し、最終濃度が1 Mとなるように塩化ナトリウムを添加します。溶液を37 °Cで2時間、225 RPMで振盪しながら保温します。次に、上清を37 °Cで2時間、40,000 Gsで遠心分離します。デカンテーション後、上清を除き、金属製スパチュラを用いてペレットを砕き、氷冷したオートクレーブ滅菌水中でペレットの断片を再懸濁させます。マグネティックスターラーとプレートを用い、4°Cで一晩激しく攪拌し、ペレットを完全に溶解させます。ペレットが37°Cで白色になるまでこれらのサイクルを繰り返し、その後、水中で一晩溶解させ、遠心分離を行います。タンパク質溶液を得るために、精製タンパク質の20 µLをSDS-PAGE用に保存した後、残りの精製タンパク質をここに示すように凍結乾燥させます。タンパク質溶液の脱塩は、4 °Cで蒸留水を用いて透析し、4時間ごと、または一晩（8時間ごと）に水を交換して2〜3日間行います。誘導サンプルでは、予測される分子量に強いタンパク質バンドが認められます。また、laminin five A ECMに相当する分子量22 kDaの精製タンパク質サンプルを含むSDS-PAGEゲルも示されています。A ECMタンパク質の推定純度は約90～95%である。この値は、SDSゲル上に現れた標的タンパク質とその他のタンパク質バンドのバンド強度の比を比較して導出された。最終的に、精製されたタンパク質が確かにA ECMタンパク質であるかを確認するため、ウェスタンブロッティングを実施した。3つのA ECMタンパク質のタンパク質純度をSDS-PAGEゲルで示し、ウェスタンブロッティング用のニトロセルロース膜の画像と比較した。この解析により、西洋ワサビペルオキシダーゼを標識した抗ヘキサヒスチジンタグ抗体を用いてタグ付けされた標的タンパク質、collagen four A ECMおよびlaminate five A ECMの存在が明らかになりました。A ECMタンパク質の最終収量は、1リットルあたり60 mgから120 mgの範囲でした。このビデオを視聴することで、特定のアプリケーションに向けて、エラスチン様ドメインを含むタンパク質を構築し、精製する方法について深く理解できるはずです。

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人工細胞外マトリックス（AECM）タンパク質からの設計と構築

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