のサイレンシング BRCA2ヒト培養細胞における新規BRCA2-調節される生物学的機能を同定するために、

遺伝子サイレンシングは、BRCA2依存性の生物学的機能を解析するための便利な実験戦略であり、がんの生物学をより深く理解するための即効性があります。BRCA2を効率的にサイレンシングする方法と、ヒト細胞株のイムノブロッティングによりBRCA2タンパク質の発現変化を検出・定量する実験手順について紹介します。

この手順の全体的な目標は、SIR AのトランスフェクションによってB RCA 2つの発現を沈黙させることです。これは、最初にSIRをトランスフェクション試薬複合体を調製することによって達成されます。次に、トランスフェクションの最初のラウンドは、80%coの流暢さを持つ細胞の単層に複合体を滴下することによって行われます。次に、2回目のSIR Aトランスフェクションを、より高いSIR、Aとトランスフェクション試薬の比率を使用して実施します。

最後に、細胞単層を氷冷PBSで洗浄し、界面活性剤ベースの溶解緩衝液を用いて細胞を摂氏4度で溶解します。最終的に、ウェスタンブロッティング分析を使用して、B RCA A 2つのサイレンシングがタンパク質レベルで行われることを示します。既存の方法に対するこの技術の主な利点は、効率的な遺伝子サイレンシングだけでなく、腫瘍抑制剤B RCA 2のような高分子量タンパク質の最適な検出を可能にすることです 加湿されたチャンバー内で摂氏37度と二酸化炭素でヒト上皮細胞単層を成長させた後、成長培地を除去し、室温PBSを使用して細胞を洗浄します。

プレートから細胞を剥離するには、0.25%トリプシン0.53ミリモルEDTA溶液を2ミリリットル加え、細胞の種類に応じて3〜5分間インキュベートします。15ミリリットルのチューブに細胞を移す前に、10%FBSを含む完全な増殖培地を2ミリリットル加えてトリプシンを中和します。チューブをスイングバケットローターに入れ、320〜330G、摂氏4度で3分間遠心分離します。

5ミリリットルの抗生物質を含まない培地を使用してペレットを再懸濁してから、バーカーチャンバーまたは自動計数システムを使用して細胞をカウントします。次に、抗生物質を含まない培地2ミリリットルの6つの細胞に約0.5〜1×10を6つのウェルプレートの各ウェルに座らせ、24時間インキュベートして80%の流暢さを実現します。インキュベーション後、6マイクロリットルの脂質ベースのirna特異的トランスフェクション試薬を130マイクロリットルの還元血清培地で希釈することにより、トランスフェクションの最初のラウンドを進めます。

3マイクロリットルの10マイクロモルS irnaを130マイクロリットルの還元血清培地で希釈します。.希釈したirnaを希釈したトランスフェクション試薬と組み合わせ、室温で5〜10分間インキュベートします。インキュベーション中に、培地を細胞から取り出し、抗生物質を含まない2ミリリットルの新鮮な培地を追加します。

摂氏37度で予温します。次に、250マイクロリットルのsiRNAトランスフェクション試薬複合体を6ウェルプレート内の細胞の各ウェルに注入します。次に、5%の二酸化炭素を含む摂氏37度の加湿インキュベーターで細胞をインキュベートします。

24時間後、5マイクロリットルの10マイクロモルirnaを130マイクロリットルの還元血清培地で希釈し、トランスフェクションの2回目のラウンドを進めることがちょうど実証されています。第2ラウンドでの高濃度のサルナは、B rcaの高効率を得るために不可欠です。2つのサイレンシング。

分析前に細胞を摂氏37度で1〜2日間インキュベートし、免疫ブロッティング分析用の細胞溶解物を調製します。ここに示されているレシピに従って、新鮮な溶解バッファーを調製します。細胞から培地を取り出し、氷冷PBSのウェルあたり2ミリリットルを加えて細胞を洗浄します。

その後、PBSをプレートから完全に取り外し、それぞれに200マイクロリットルの氷冷溶解バッファーを追加します。プレートを静かに回転させて溶解バッファーを均一に分配し、ローテーター上で摂氏4度で15分間インキュベートします。次に、セルスクレーパーを使用します。

17、900 G、4°Cの氷遠心分離機で25分間、マイクロ遠心チューブに細胞溶解物を回収し、スーパーナットを回収してイムノブロッティング分析を行います。50ミリリットルの20 x トリスアセテートSDSランニングバッファーを950ミリリットルの蒸留水で希釈して、ランニングバッファーを調製します。サンプルは以下のように準備します。

15 μgの総細胞ライセートを添加します。5マイクロリットルの4 x サンプル緩衝液、硫酸リチウムESAL、pH 8.42マイクロリットルの0.5モルDTT、および溶解緩衝液を含むサンプル緩衝液(総容量20マイクロリットル)。サンプルを摂氏55度で10分間変性させます。

b RCA 2タンパク質は熱感受性であるため、この温度を使用することが重要です。次に、製造元の指示に従って電気泳動チャンバーをセットアップします。次に、サンプルを10マイクロリットルの高分子量Restain Proteinスタンダードにプレキャストゲルにロードし、120ボルトで約2時間泳動します。

その間に、50ミリリットルの20 xトランスファーバッファー、100ミリリットルの100%メタノール、および850ミリリットルの水でトランスファーバッファーを準備します。100%メタノールに5分間浸漬して、PVDFメンブレンを活性化します。蒸留水ですすぎ、トランスファーバッファーで少なくとも5分間平衡化します。

転写装置のスポンジを摂氏4度の転写緩衝液に使用まで浸します。55キロダルトンの青いマーカーがプレキャストゲルを離れる前に実行を停止し、転写バッファーに浸した3つのスポンジから始めてサンドイッチを組み立てます。次に、転写バッファーで飽和させた3mmの用紙1枚。

次に、ゲル、次に活性化PVDFメンブレン、続いてバッファーを浸した3Mグレードの紙を1枚、最後に浸したスポンジを3枚加えます。スタックを装置に入れ、タンパク質を350ミリアンペアで摂氏4時間、または摂氏180ミリアンペアで摂氏4度で一晩移します。移し替え後、TBSを使用してメンブレンを洗浄し、TBSTと5%脱脂粉乳で1時間ブロックします。

次に、バッファーを30マイクロリットルの抗BCA2ウサギポリクローナル抗体を含む9ミリリットルのTBSTミルクバッファーと交換し、摂氏4度で一晩インキュベートします。TBSTを使用してメンブレンを3回、10分間洗浄した後、10ミリリットルのTBSTミルクバッファーで希釈した1マイクロリットルの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギ二次抗体とフィルターを1時間インキュベートします。メンブレンを3回洗浄した後、製造元の指示に従ってKEMMA発光免疫検出を行います。

高分解能ECLフィルム上のバンドを可視化し、B rcaの特異性を確認します。2つのサイレンシング。スクランブルされたirnaをB RCA two irnaと並べて使用しました 前述のように、ここに示すように、B RCA A twoサイレンシングの高効率を得るためには、高いirna対トランスフェクション比で2回目のirnaトランスフェクションを実行することが重要です。

ここでの結果は、細胞の種類によって、低siRNAと高siRNAのトランスフェクション比を使用した場合のノックダウン効率の違いを示しています。最高レベルの遺伝子サイレンシングを得るための最適な最小時間は、siRNAトランスフェクションの2回目のラウンド後に異なることがあり、例えば、この図に示すように、NTHY甲状腺細胞には24時間で十分ですが、効率的なB RCA AのPNTでの2ノックダウン1つのA前立腺細胞b RCA 2回のサイレンシングは、トランスフェクションの2回目のラウンド後7日目まで非常に安定しています。前述のように、細胞ライセートを摂氏55度を超える温度で変性すると、B RCA A 2タンパク質が最大50%失われます。

この実験では、PARP阻害剤ルカパリブに対するB RCA A 2つのサイレンシングPNT One A細胞の感受性を、薬物による24時間治療後に調べました。B、RCA、2つの枯渇PNT、1つのA細胞で、対照と比較して、細胞増殖の時間依存的な減少が観察されました。このビデオを見た後、CRNAによって長いタンパク質をコードする遺伝子をサイレンシングする方法と、BRC 2以外の最適化された免疫ブロッキング手順を通じてそれらのタンパク質産物を効率的に検出する方法を十分に理解しているはずです。

この問題は、他の多くの困難な大きなタンパク質、特にそれらが細胞内で非常に低いレベルで発現している場合に適用できる可能性があります。