のサイレンシング

この手順の全体的な目的は、siRNA AをトランスフェクションすることによりBRCA2の発現をサイレンシングすることです。まず、siRNA Aとトランスフェクション試薬の複合体を調製します。次に、コンフルエンシーが80%に達した細胞単層に複合体を滴下し、1回目のトランスフェクションを行います。その後、siRNA Aとトランスフェクション試薬の比率を高めて、2回目のsiRNA Aトランスフェクションを実施します。

最後に、細胞単層を氷冷したPBSで洗浄し、界面活性剤ベースの溶解バッファーを用いて4 °Cで細胞を溶解します。最終的に、ウェスタンブロッティング解析を用いて、タンパク質レベルでのB RCA A twoのサイレンシングを実証します。既存の手法に対するこの技術の主な利点は、効率的な遺伝子サイレンシングが可能であること、および腫瘍抑制因子B RCA twoのような高分子量タンパク質を最適に検出できることです。まず、加湿チャンバー内、37 °C、5% carbon dioxideの条件下でヒト上皮細胞単層を培養した後、培地を除去し、室温のPBSを用いて細胞を洗浄します。

プレートから細胞を剥離させるため、0.25% trypsin 0.53 millimolar EDTA溶液を2 mL加え、細胞種に応じて3〜5分間インキュベートします。10% FBSを含む完全培地を2 mL加えてtrypsinを中和した後、細胞を15 mLチューブに移します。チューブをスイングバケットローターにセットし、320〜330 G、4 °Cで3分間遠心分離します。

抗生物質を含まない培地5 mLを用いてペレットを再懸濁し、バーカーチャンバーまたは自動細胞計数装置で細胞数を計測します。次に、抗生物質を含まない培地2 mLに調整した約0.5〜1 × 10⁶個の細胞を6ウェルプレートの各ウェルに播種し、コンフルエンシーが80%になるまで24時間インキュベートします。インキュベーション後、脂質ベースのsiRNA特異的トランスフェクション試薬6 µLを低血清培地130 µLで希釈し、1回目のトランスフェクションを行います。

10 µMのS irna 3 µLを、低血清培地130 µLで希釈します。希釈したirnaと希釈したトランスフェクション試薬を混合し、室温で5〜10分間インキュベートします。インキュベートしている間に、細胞から培地を除去し、抗生物質を含まない新鮮な培地2 mLを加えます。

37 °Cで予熱します。次に、6ウェルプレートの各細胞ウェルに、siRNAトランスフェクション試薬複合体を250 µLずつ加えます。その後、5% CO2を含む37 °Cの加湿インキュベーター内で細胞をインキュベートします。

24時間後、10 µM の irna 5 µL を 130 µL の低血清培地で希釈し、実演される通りに2回目のトランスフェクションを行います。2回目において sarna を高濃度で用いることは、B rca の高いサイレンシング効率を得るために不可欠です。

イムノブロッティング解析用の細胞溶解液を調製するため、解析前に細胞を37 °Cで1～2日間インキュベートします。ここに示したレシピに従って、新鮮な溶解バッファーを調製します。細胞から培地を除去し、細胞を洗浄するために、1ウェルあたり2 mLの氷冷PBSを加えます。

その後、プレートからPBSを完全に除去し、各ウェルに氷冷したライシスバッファーを200 µLずつ加えます。プレートを緩やかに回転させてライシスバッファーを均一に分散させ、ローテーターを用いて4 °Cで15分間インキュベートします。次に、セルスクレーパーを用いて回収します。

細胞溶解液をマイクロ遠心チューブに回収し、氷上で 17,900 Gs、4 °C で 25 分間遠心分離し、イムノブロッティング解析に使用する上清を回収します。20 x tris acetate SDS 走行バッファー 50 mL を蒸留水 950 mL で希釈し、走行バッファーを調製します。サンプルを次のように調製します。

15 µgの全細胞溶解液を加えます。pH 8.4のリチウムSDS硫酸塩を含む4xサンプルバッファー5 µL、0.5 M DTT 2 µL、および溶解バッファーを加え、総量を20 µLにします。サンプルを55 °Cで10分間変性させます。

b RCA two proteinは熱に弱いため、この温度を使用することが極めて重要です。次に、製造元の指示に従って電気泳動槽をセットアップします。その後、プリキャストゲルに10 µLの高分子量再染色タンパク質標準と共にサンプルをロードし、120 Vで約2時間泳動させます。

その間に、20倍転写バッファー 50 mL、100% メタノール 100 mL、および水 850 mLを用いて転写バッファーを調製します。PVDF膜を100% メタノールに5分間浸して活性化させます。蒸留水で洗浄し、転写バッファー中で少なくとも5分間平衡化させます。

転写装置のスポンジを使用するまで4 °Cの転写バッファーに浸しておきます。55 kDaのブルーマーカーがプレキャストゲルから出る前に電気泳動を停止し、転写バッファーに浸した3枚のスポンジから順にサンドイッチを組み立てます。次に、転写バッファーで飽和させた3 mmのフィルターペーパーを1枚重ねます。

次に、ゲルを加え、続いて活性化したPVDF膜、バッファーに浸した3Mグレードの濾紙1枚、最後に浸したスポンジ3枚を順に重ねます。この積層体を装置にセットし、350 mAで4時間、4 °Cで転写するか、あるいは180 mAで4 °Cで一晩転写します。転写後、TBSで膜を洗浄し、TBSTと5%脱脂乾乳を用いて1時間ブロッキングを行います。

次に、バッファーを 30 µL の anti BCA two ウサギポリクローナル抗体を含む 9 mL の TBST ミルクバッファーに交換し、4 °C で一晩インキュベートします。TBST でメンブレンを 10 分間ずつ 3 回洗浄した後、10 mL の TBST ミルクバッファーで希釈した 1 µL の HRP 標識抗ウサギ二次抗体を用いて、フィルターを 1 時間インキュベートします。メンブレンを 3 回洗浄した後、製造元の指示に従って KEMMA ルミネッセンス免疫検出を行います。

高解像度のECLフィルムでバンドを可視化し、Brca2サイレンシングの特異性を確認します。前述の通り、Brca2 siRNAと並行してスクランブルsiRNAを使用しました。Brca2サイレンシングの高効率を達成するためには、高いsiRNA対トランスフェクション比で2回目のsiRNAトランスフェクションを行うことが重要です。

ここでの結果は、siRNAとトランスフェクション試薬の比率を低く設定した場合と高く設定した場合におけるノックダウン効率の差が、細胞株によって異なることを示しています。最高レベルの遺伝子サイレンシングを得るための最適な最短時間は、2回目の一連のsiRNAトランスフェクション後に変動する可能性があります。例えば、この図に示されているように、NTHY甲状腺細胞では24時間で十分ですが、PNT1A前立腺細胞におけるB RCA A twoの効率的なノックダウンには最大48時間が必要です。b RCA twoのサイレンシングは、2回目のトランスフェクション後7日目まで非常に安定しています。前述したように、55 °C以上の温度で細胞溶解物を変性させると、B RCA A twoタンパク質の最大50%が消失します。

本実験では、BRCA2をサイレンシングしたPNT1A細胞のPARP阻害剤ルカパリブに対する感受性を、薬剤投与24時間後に検討しました。対照群と比較して、BRCA2を枯渇させたPNT1A細胞では、時間依存的な細胞増殖の低下が観察されました。このビデオを視聴することで、BRCA2以外においても、crRNAを用いて長いタンパク質符号化遺伝子をサイレンシングする方法と、最適化された免疫ブロッキング手順を通じてそのタンパク質産物を効率的に検出する方法について、十分に理解できるはずです。

この手法は、特に細胞内での発現レベルが非常に低い場合など、他の多くの困難な巨大タンパク質にも適用できる可能性があります。