発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング Q熱リケッチアトランスポゾン変異体

この手順の全体的な目標は、大規模に識別することです。COE因子は、宿主細胞への侵入、細菌の複製ニッチの生成、持続性など、感染サイクルの主要なステップに関与しています。これは、最初に突然変異導入の転置によってGF PT co変異体ライブラリを生成することによって達成されます。

次に、宿主細胞は単離されたすべての変異体に感染します。次に、マイクロプレートリーダーを使用して、すべての変異体の細胞内複製をリアルタイムで追跡し、コキシエラ感染に最も有害な変異を特定します。最後に、コキシエラに感染した細胞を自動顕微鏡で分析します。

最終的に、自動画像解析により、得られたすべての表現型の形態学的特性評価が可能になり、各変異遺伝子をコキシエラ感染サイクルの推定機能と関連付けることができます。この方法は、細胞全体と相互作用し、その分子機構を乗っ取って利益を得るために必要な特定の病原体の必須遺伝子の大規模な同定など、宿主病原体の相互作用の分野における重要な問題に対処するのに役立ちます。COEコロニーのプレーティングと単離が難しいため、この方法を視覚的に実証することは非常に重要です。

実際、COEは非常に小さなコロニーを形成し、ソフトなACCM two aroから慎重に抽出する必要があります。この方法が球菌ラボ感染に関する洞察をどのように提供できるか。また、サルモネラ菌、ブレル菌、マイコバクテリウム菌などの他の細胞内病原菌にも適用できます。

テキストプロトコルに従ってトランスポゾンおよびトランスポゼースコーティングプラスミドでコンピテントコキシエラを形質転換した後、個々の変異体を単離するために、10ミリリットルの溶融0.5%アロスと10ミリリットルの2つのX accm、2つを微生物安全キャビネットまたはMSCに混合してボトムアロスを調製し、適切な抗生物質を直ちにペトリ皿に注ぎ、蓋なしで30分間冷却し、次いで20分間風乾させる。トップバッグのアロスを調製するには、15ミリリットルのポリスチレンチューブに1.25ミリリットルの2 x accm 2と0.75ミリリットルの水を混合します。適切な抗生物質を添加し、摂氏37度でインキュベートします。

次に、1〜100マイクロリットルの細菌培養物を加え、5秒間ボルテックスします。次に、0.5ミリリットルの溶かしたアロスミックスを加え、すぐに底のアロスに注ぎます。プレートを20分間冷まします。

蓋を上に置き、摂氏4度で20分間インキュベートして固めます。次に、蓋を取り外し、プレートを20分間風乾してから、5%の二酸化炭素と2.5%の酸素を入れた摂氏37度の加湿インキュベーターに6〜7日間移します。コロニーが検出されたら、1ミリリットルのピペットチップの端を切り取り、それを使用して単一のコロニーを含むプラグを分離してコロニー

次に、それらを1.5ミリリットルのaccm twoを含む24ウェルプレートのウェルに移します。標準曲線を調製した後、テキストプロトコルに従って、ウェルあたり10%Triton X 100の5マイクロリットルを分注することにより、各細菌懸濁液を定量します。壁と底が黒い96ウェルマイクロプレートに、各ウェルに50マイクロリットルの細菌懸濁液を加え、プレートシェーカーで10分間インキュベー

室温で、1つのXTEバッファーを使用して二本鎖DNA定量試薬を1〜200に希釈し、希釈した試薬を55マイクロリットル各サンプルに加えます。プレートシェーカーをよく混合した96ウェルマイクロプレートで、室温で2〜5分間暗所でインキュベートする前に、蛍光マイクロプレートリーダーと標準フルオレセイン波長のフィルターを使用してサンプルの蛍光を測定します。細菌DNA濃度プロットを取得するには、事前に準備した標準曲線の蛍光測定値から、DNA濃度をコキシエラゲノムの質量で割って細菌濃度を求めます。

テキストプロトコルに従ってシングルプライマーコロニーPCRおよびDNAシーケンシングを実施した後、結果をミリリットル当たりのゲノム当量で表現します。配列解析ソフトウェアを使用して、Coxiella Burnett I 4 93 NMの全アノテーションゲノムをAlign to Reference機能でロードし、blast Nを使用してシーケンス結果をロードしてアライメントし、転位部位を決定します。RPMI培地中の1ミリリットルあたり10〜5細胞のVero細胞懸濁液を調製した後、テキストプロトコルに従って、平らで透明な底を有する黒い96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルの懸濁液を分注し、プレートをGの400倍で遠心分離し、5分間部屋に入れ、摂氏37度および5%二酸化炭素で一晩インキュベートする。

翌日、コキシエラ変異体を含有する96ウェルプレートを室温で落下させ、フェノールレッドおよびFBSを含まないRPMIの300マイクロリットルに細菌懸濁液150マイクロリットルを希釈し、次に、ベロ細胞から培地を取り出し、希釈したコキシエラ変異体のウェル当たり100マイクロリットルを分注する。Aウェルをネガティブコントロールとして、ウェルA2と3をポジティブコントロールとして使用し、エアロゾルタイト遠心分離機プレートホルダーを使用してプレートをGの400倍と室温で10分間遠心分離します。次に、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素の加湿雰囲気で2時間インキュベートした後、蛍光マイクロプレートリーダーとフルオレセイン用フィルターを使用して、細菌含有培地を新鮮な完全RPMI培地のウェルあたり100マイクロリットルに交換します。

GFP蛍光を7日間毎日測定する 感染後7日目に、培地をプレートから取り出し、1〜1000希釈の細胞透過性蛍光色素を含む新鮮な完全培地のウェルあたり50マイクロリットルと交換します。インキュベーション後30〜60分間細胞をインキュベートし、培地をPBS中の4%PFAのウェルあたり50マイクロリットルに交換し、室温で30分間インキュベートします。次に、PBSを使用してウェルを3回洗浄する前にPFA含有緩衝液を除去します 最終洗浄を除去した後、50マイクロリットルのブロッキング溶液を各ウェルに分注し、室温で30分間インキュベートします。

次に、ブロッキング溶液をウェルあたり40マイクロリットル、新鮮なブロッキング溶液、および1〜500希釈のアンチランプ1抗体に交換します。室温で30分間インキュベートした後、溶液を取り出し、プレートワッシャーを使用して、PBSのウェルあたり100マイクロリットルを適用してウェルを5回洗浄します。次いで、適切な蛍光二次抗体を含有するブロッキング溶液をウェル当たり40マイクロリットル加え、1ミリリットル当たり5マイクログラムで3、3、3、2、5、8を引っ掛ける。

室温で30分間インキュベートします。サンプルを5回洗浄し、最終的なPBS洗浄液をウェルに残して、サンプルが乾燥しないようにします。画像取得を行うには、20 x 対物レンズと 3 4 88 55 および 6 つの 15 ナノメートルチャンネルを備えた落射蛍光自動顕微鏡を使用します。

サンプルあたり最低5, 000細胞をイメージングするために、ウェルごとに21の独立したフィールドを取得します。宿主細胞の核チャネルを基準としてオートフォーカスを適用します。最後に、自動画像解析を使用して、取得した画像からいくつかの関連特徴を推定します。

この図は、16ポイントICM Coxe Lの変異体に対する38の転置を示しています。これは、変異体の生存率を評価するGenes aen成長曲線で示されています。ここは。上皮細胞とインキュベートしたcoxiella変異体の細胞内増殖曲線は、coxiellaゲノムの挿入物の転位に関連する表現型の定量的解析を提供します。この図では、宿主細胞の核、細胞輪郭、リソソーム、およびコキシエラコロニーを同定し、特徴付けるために、自動画像取得が行われました。

コキシエラのコロニーを細胞やリソソームと相関させることで、コキシエラを含む液胞の形態学的解析が可能になります。coxiellaコロニーを宿主細胞の輪郭と相関させることで、感染細胞の形態学的解析が可能になります。最後に、4つのチャンネルがマージされます。

コキシエラコロニーの平均面積は、コキシエラの細胞内複製や宿主細胞に侵入する細菌の能力に影響を与える突然変異を特定するために、細胞あたりのコロニー数に対してプロットされます。変異体は、コキシエラの細胞内増殖に影響を与える突然変異、細胞内のコキシエラの内在化、および有意でない表現型の3つのクラスターで観察されました。ここでは、コキシエラコロニーの平均面積を、感染を生き延びる宿主細胞の数に対してプロットされ、コキシエラに細胞毒性を付与する突然変異を同定する

この技術は、細菌感染症の研究者が宿主病原体の相互作用を大規模に探求する道を開き、感染症に対抗するための新しい治療法を開発するための宿主と細菌の標的を特定しました。