Name: 発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング Q熱リケッチアトランスポゾン変異体 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 学ぼう、Coxiella burnetiiのトランスポゾン変異体を用いたハイコンテンツスクリーニング法。蛍光標識変異体の作製、宿主細胞への侵入・増殖・細胞毒性の自動解析により、病原体の感染サイクルに関与する必須遺伝子を同定する。

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この作業は、Matteo BonazziへのAvenir/ATIP助成金とEric MartinezへのMarie Curie CIG（N° 293731）によって支援されました。著者らは、C. burnetii株、抗体、ツールを共有してくださったRobert Heinzen博士、技術支援とデータ解析を提供してくださったVirginie Georget氏とSylvain DeRossi氏(Montpellier Rio Imaging-MRI, 1919 route de Mende, 34293 Montpellier)に感謝します。

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<li>Beare, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dot%2FIcm+type+IVB+secretion+system+requirements+for+Coxiella+burnetii+growth+in+human+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Dot/Icm type IVB secretion system requirements for Coxiella burnetii growth in human macrophages.</a> mBio. 2, (2011).</li>
<li>Omsland, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+from+animal+tissue+and+genetic+transformation+of+Coxiella+burnetii.+are+facilitated+by+an+improved+axenic+growth+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+environmental+microbiology%22%5BJournal%5D)">Isolation from animal tissue and genetic transformation of Coxiella burnetii. are facilitated by an improved axenic growth medium.</a> Applied and environmental microbiology. 77 (11), 3720-3725 (2011).</li>
<li>Beare, P. a, Sandoz, K. M., Omsland, A., Rockey, D. D., Heinzen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Advances+in+genetic+manipulation+of+obligate+intracellular+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+microbiology%22%5BJournal%5D)">a Advances in genetic manipulation of obligate intracellular bacterial pathogens.</a> Frontiers in microbiology. 2 (May), 97(2011).</li>
<li>Brodin, P., Christophe, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-content+screening+in+infectious+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+chemical+biology%22%5BJournal%5D)">High-content screening in infectious diseases.</a> Current opinion in chemical biology. 15 (4), 534-539 (2011).</li>
</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

宿主/病原体相互作用の研究は、細菌感染症を理解し、感染症に対抗するための代替戦略を開発するために注目すべき方法であることが証明されています。しかし、別の細菌性病原体によって精緻化戦略の多様性のために、細菌の毒性因子および感染中に標的にされているホストのシグナル伝達経路の同定および特徴は、本当の挑戦を表します。これは重要な宿主/病原体相互作用のハブの大規模同定のための新たなアプローチの開発を求めています。革新的な、ハイスループットおよびハイコンテントスクリーニング技術の最近の開発は、細胞内細菌病原体15の研究に適合させることができる貴重なリソースを表します。ここでは、トランスポゾン突然変異誘発および蛍光ベースのアッセイを組み合わせたスクリーニング手法を開発するためのモデルとして、人獣共通細菌性病原体のQ熱リケッチアを使用しています。 ImportanTLY、このスクリーニング方法は、侵入複製し、感染した細胞内で永続化するために、この細菌によって開発された戦略のグローバルな概要を提供し、 コクシエラ細胞内サイクルの複数のステップを同時に監視することができます。 ここで説明するアプローチは、2つのよく確立された技術、トランスポゾン突然変異誘発し、正常細菌性病原体の研究に適用された蛍光に基づいたアッセイに基づいています。高スループット/高含量スクリーンのコンテキストでこれらの技術を組み合わせることで、私たちはイベントの非常に高い数（典型的には、細菌の変異15,000感染した細胞は、画像化され、分析される）を分析することによって、細菌の変異の数が多いの効果を評価することができます。これは、このような、自然に、高い変動の対象である宿主細胞と細胞内複製、細菌の侵入などのイベントの重要な統計的分析を提供します。これは、EP以外のその細胞株に注目することが重要ですithelialスクリーニングのこのタイプのために使用することができます。宿主細胞の細胞小器官を検出することが容易であるしかし、平らで大きな上皮細胞画像解析のために最適です。自動化された顕微鏡の大部分が自動的にプレートを大量に処理することができるので、同時にスクリーニングすることができる変異体の数に事実上制限はありません。病原体に応じて、ユーザー缶特権落射蛍光または共焦点顕微鏡を使用します。画像取得の時間は、主にウェルあたりと視野当たりの取得チャネル数、取得フィールドの数に、顕微鏡カメラの感度に依存することになります。ユーザーは、スクリーニングプロトコルを最適化するために、これらの要因を調整する方法を決めることができます。例として、点5.1で示される条件を使用して1つの96ウェルプレート/時間をイメージ。画像分析は、主に使用されるマシン（またはマシンのクラスタ）に依存します。我々は、12コア（2×3.06 GHzの6コア）、48ギガバイトのRAMのワークステーションを使用しています。このマシンはapproxiが必要です一枚の板から取得した画像を解析するmately 40分。 これらのアッセイを開発する際に考慮すべき重要な側面は、多数のサンプルの操作および処理を可能にする新規のセットアップ（または既存の最適化）のプロトコルです。典型的な例は、私たちは急速に非常に少量のサンプルから、各トランスポゾンの挿入部位を含むコクシエラ DNA断片を増幅し、配列することができ、単一のプライマーコロニーPCR法の開発です。我々の経験に基づいて、高忠実度ポリメラーゼを注意深く選択し、再現性のある結果を得るために試験されなければなりません。このアプローチの唯一の制限は、ほとんどの場合、処理されたサンプルの約30％が悪用可能でない、観察にPCRまたは配列決定の段階に起因するいずれかを非表示にすることができます。しかし、新しいコクシエラトランスポゾン突然変異体の単離が律速段階ではないことを考えると、これはrepreしません大きな問題を送りました。同様に、変異型株式の細菌濃度を定量化するための信頼性の高いアッセイの開発は、このアプローチのための鍵となっています。懸濁液中の凝集するコクシエラの傾向に起因して、光学密度の測定値を使用することはあったコクシエラの文化や、既存の代替の濃度定量PCR（定量PCR）を計算するためには適用されません。ここで、蛍光タグ化DNAの挿入剤の使用は、細菌の定量化を高速化。 このアプローチは、使用される病原体に応じて、いくつかの細胞内区画のための蛍光マーカーを発現する安定な細胞株の使用を利用することができます。もう一つの重要な側面は、フェノールレッドを欠く細胞培養培地の使用です。我々は、このpH指示薬は、自動化された蛍光リーダーに記録された信号を飽和赤と緑のスペクトルにまたがる自然蛍光を有していることを観察しました。 Tここで紹介する彼の戦略は、ランダムトランスポゾン突然変異誘発に依存しています。興味のある変異体のために、私たちは、サザンブロットおよびトランスポゾン挿入部位のPCR増幅を使用してユニークな入れ換えを検証（およびクローン）をお勧めします。 プロトコルセクションに記載された装置に加えて、ここに提示スクリーニングアプローチを使用して興味のチームは、データ収集、データ格納用のサーバと迅速な画像解析のためのワークステーションのためにリレーショナルデータベースのセットアップに非常に有利になります。 重要なことは、ここで説明する方法は、ランダム突然変異誘発法は、病原体のために存在する提供他の細胞内細菌性病原体の研究に適している、細胞株は、病原体に感染することができ、これは、感染の間に、特定の表現型を表示します。

新興、流行細菌コクシエラバーネッティは、Q熱、重度の健康と経済的影響1と衰弱インフルエンザ様人獣共通感染症の大規模な集団発生の原因です。 コクシエラの主な貯水池は、国内および農場の動物であり、それは米国の乳牛の90％以上がCを運ぶと推定されています2 バーネッティ 。人間は汚染されたエアロゾルの吸入によって感染している偶然の宿主です。ヒトQ熱は65％ に達し、1,3-死亡率、致命的な合併症を有していてもよい、いずれかの急性または慢性疾患として現れます。 1の感染量で- 10生物、 コクシエラが知られている最も感染性病原体であり、これは潜在的なバイオ兵器4として研究されてきました。オランダ（2007 - 2010）におけるQ熱の最近の爆発的な流行は、年間2,000人以上に182からエスカレートケースで、この病原体の深刻な毒性の例として立っ5。 コクシエラ感染の顕著な効率は、おそらく細胞をホストする独自の適応と合わせ、環境ストレスに対する抵抗性と関連しています。実際、 コクシエラは、いくつかの厳しい条件（乾燥、温度など ）に対して非常に抵抗性である代謝的に不活性小細胞変異体（SCV）の形で環境中に存在します。非食細胞の浸潤がコクシエラ接着 /浸潤のOmpA 7および未同定の受容体によって媒介されている間のSCVは、最大3インテグリン6βαのVを介して食細胞によって取り込まれます。取り込み後、 コクシエラは Rab5のとEEA1 8早期エンドソームマーカーに陽性、タイトフィットの液胞に存在します。細菌は代謝的に活性な大細胞変異体（小型商用車）に変換し、ドット/ ICMの4型分泌系（T4SS）9を活性化することにより、エンドソーム酸性化への対応します、 レジオネラ·ニューモフィラ 10のそれに非常に相同です。ドット/ ICMのエフェクターの分泌がコクシエラは細菌が繁栄し、積極的にアポトーシス11から感染細胞を保護することができるアクティブなリソソーム酵素を含む大きな、LAMP1陽性酸性コンパートメントを生成することができます。したがって、 コクシエラの細胞内周期は細菌エフェクター12のドット/ ICM-媒介転座によって制御されているが、宿主細胞の浸潤、細菌の複製および感染の普及に関与する微生物の要因はほとんどわかっていません。 宿主細胞内の1）内在化、2）細胞内複製、3）細胞から細胞への広がり：トランスポゾン突然変異誘発および蛍光ベースのアッセイを組み合わせることで、我々は、 コクシエラ感染の主なステップに関与する細菌の要因の同時同定のための公平なアプローチを開発しています、および4）持続。これまでに、我々は千メートルにわたってスクリーニングしコクシエラの病因7を調節する宿主-病原体相互作用への前例のない洞察力を提供してくれ500 コクシエラコード配列、でutations。注目すべきことに、このアプローチは、 コクシエラと細胞生物学の特徴を共有する他の細胞内病原体の研究に適用することができます。

<table><tbody><tr><td>クエン酸</td><td>シグマ</td><td>C0759-500G</td><td>ACCM-2 中型成分</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S4641-500G</td><td>ACCM-2 中型成分</td></tr><tr><td>リン酸カリウム</td><td>シグマ</td><td>60218-100G</td><td>ACCM-2 中型成分</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>シグマ</td><td>M2670-100G</td><td>ACCM-2 中型</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td> シ<td>グマ</td><td>C5080-500G</td><td>ACCM-2 中型成分</td></tr><tr><td>硫酸鉄</td><td>Σ</td><td>F8633-250G</td><td>ACCM-2 中型</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Σ</td><td>S9625-500G</td><td>ACCM-2 中型</td></tr><tr><td>L-システイン</td><td>Sigma</td><td>C6852-25G</td><td>ACCM-2 中型</td></tr> バ<tr><td>クトネオペプトン</td><td>BD (ベクトン・ディキンソン社)</td><td>211681</td><td>ACCM-2 中型</td></tr><tr><td>カサミノ酸</td><td>BD (Beckton-Dickinson)</td><td>223050</td><td>ACCM-2 中型成分</td></tr><tr><td>メチル-B-シクロデキストリン</td><td>Σ</td><td>C4555-10G</td><td>ACCM-2 中型成分</td></tr><tr><td>RPMI グルタマックス付き</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td>ACCM-2 中型成分</td></tr><tr><td>RPMI グルタマックス付き、フェノールレッドなし</td><td>Gibco</td><td>32404-014</td><td>細胞培養および感染用</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>GEヘルスケア</td><td>SH30071</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>トリプシンEDTA(0.25%)</td> <td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>25200-056</td><td>細胞培養用</td></tr><tr><td>サポニン</td><td>シグマ</td><td>47036</td><td>免疫蛍光染色用</td></tr><tr><td>塩化アンモニウム</td><td>シグマ</td><td>A9434</td><td>免疫蛍光染色用</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>シグマ</td><td>A2153</td><td>免疫蛍光染色用</td></tr><tr><td>エレクトロポレーションキュベット 0.1 cm</td><td>Eurogentec</td><td>ce0001-50</td><td>Coxiella 形質転換用</td></tr><tr><td>Trackmates スクリュートップチューブ(キャップ付き</td>) <td>Thermo Scientific</td><td>3741</td><td>2D バーコード付きスクリューキャップ</td></tr><tr><td>96ウェルマイクロプレート(黒壁と底部付き</td><td>) Greiner</td><td>655076</td><td>フラットダークボトム、dsDNA定量用</td></tr><tr><td>96ウェルPCRマイクロプレート</td><td>Biorad</td><td>2239441</td><td>DNAse/RNAse</td></tr><tr><td>フリー96ウェルプレート、ディープウェル</td><td>Labcon</td><td>949481</td><td>Coxiella変異体感染症用</td></tr><tr><td>PicoGreen</td><td>Life Technologies</td><td>P7581</td><td>dsDNA定量</td></tr>用 <tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>dsDNA定量用</td></tr><tr><td>Phusion ハイフィデリティDNAポリメラーゼ</td><td>ニューイングランド Biolabs</td><td>M0530L</td><td>シングル用プライマーコロニー PCR</td></tr><tr><td>セルトラッカー レッド CMTPX</td><td>ライフテクノロジー</td>ズ <td>C34552</td><td>イメージング用</td></tr><tr><td>抗LAMP1抗体</td><td>シグマ</td><td>94403-1ML</td><td>免疫蛍光染色用</td></tr><tr><td>ヘキスト 33258</td><td>シグマ</td><td>L1418</td><td>イメージング用</td></tr><tr><td>蛍光マイクロプレートリーダー インフィニット200プロ</td><td>テカン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光自動顕微鏡 セロミクス</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング<em&gt; q熱リケッチア</em&gt;トランスポゾン変異体

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

細菌性病原体による宿主細胞の浸潤およびコロニー形成が重要なホスト機能を破壊して操作することができる病原因子として定義された原核生物の多数のタンパク質、の活性に依存します。ホスト/病原体相互作用の研究は、細菌感染症を理解し、感染症に対抗する代替戦略を開発することが極めて重要です。このアプローチは、しかし、細菌の病原性決定因子の公正な、自動化された同定および特徴付けのための新たなハイスループットアッセイの開発を必要とします。ここでは、トランスポゾン突然変異誘発によりGFPタグ付き変異体ライブラリーを生成するための方法を説明し、ハイコンテントスクリーニングの開発には、複数のトランスポゾンに関連する表現型の同時同定のために接近します。私たちの作業モデルは、SEと関連している細胞内細菌性病原体のQ熱リケッチア 、人獣共通感染症のQ熱の病原体であり、その結果としての健康と経済的負担との発生をヴィア。この病原体の偏性細胞内性質は、最近まで、厳しくコクシエラのハイスループット/高含量のアプローチを実現するための理想的なモデルを作り、ホスト病原体の相互作用に関与する細菌因子の同定を妨げています。

トランスポゾン突然変異体を単離すると、単一プライマーコロニーPCRは、各変異体のためのトランスポゾン挿入部位を同定するための強固な、ハイスループット法です。このアプローチは、典型的なネストされたPCRプロトコルから派生が、ここでは単一のプライマーは、アニーリング温度（ 図1A）のストリンジェンシーに依存して鋳型DNAに特異的および/ ​​または非特異的にハイブリダイズします。典型的なPCR産物は、特異的であり、そのほとんどが、複数のDNA断片（ 図1B）から成ります。右トランスポゾンITRの上流、および増幅プライマーにより認識される配列の下流にアニールする異なる配列決定プライマーの使用は、配列決定工程（ 図1C）に対する特異性を提供します。配列解析のための自動化ソフトウェアは、トランスポゾン挿入（ 図1C）の正確な部位を提供するコクシエラゲノムに得られた配列を整列させます。すべてのトランスポゾン挿入は、その後、アンすることができますコクシエラゲノム （ 図1D）にotated。 各コクシエラ変異体が単離され、貯蔵またはスクリーニングのいずれかの前にACCM-2培地に無菌的に増幅される。2、16 ドット/ ICMコクシエラ遺伝子 （ 図2A）38のトランスポゾン変異体の例を示す図 。 コクシエラ突然変異体の生存率を評価するために、純粋な成長曲線を1.5（Figurie 2B）に記載の細菌濃度アッセイを、接種後7日間の細菌培養物をサンプリングして適用することによって得られます。増幅された変異体は、その後7日間三重96ウェルプレート中で、上皮細胞とインキュベートします。 GFPタグ化されて生成されたすべてのコクシエラ変異体は、細胞内の増殖曲線は各24時間、すべてのウェルのGFPの蛍光強度を測定した、時間の関数（ 図2C）として測定値をプロットしています。 INTR無細胞成長曲線は、 コクシエラゲノム内のすべてのトランスポゾン挿入に関連する表現型の定量的な分析を提供します。同じトランスポゾン突然変異体についての定性的な情報を追加するために、我々は、自動画像収集と分析のために選びました。七日感染後、プレートは、固定された4に記載のように免疫蛍光のために処理され、そのようなCellProfiler（ブロード研究所5.自動画像解析ソフトウェアに記載されるように自動化され、落射蛍光顕微鏡を用いて分析<a href="http://www.cellprofiler.com/" target="_blank">www.cellprofiler.com</a> ）、取得したチャネルを処理します独立セグメント（ 図3）の比較分析のためのオブジェクトを特定しました。これは、宿主細胞核、細胞輪郭、リソソームおよびコクシエラコロニー （ 図3上パネル）の同定および形態学的特徴付けを可能にします。細胞およびリソソームとコクシエラコロニーの相関identificatiを可能にします上と（正LAMP1、 図3左下のパネルである） コクシエラ含有液胞の具体的な形態学的分析。宿主細胞の輪郭とコクシエラコロニーを相関させること、感染細胞（ 図3下部の中央パネル）の同定および特定の形態学的分析を可能にします。最後に、4チャネルは、例示および品質管理の目的（ 図3右下のパネル）のためにマージされます。 自動画像解析から得られたデータは、「マルチ表現型の散布図」を得るために、互いに対してプロットすることができます。一例として、 図4Aにコクシエラコロニー （μM2）平均面積は、コクシエラ（複製表現型）の細胞内複製に影響を与える突然変異を同定するために、細胞当たりのコロニー数（ 図4A）に対してプロットされ、および/ ​​または宿主細胞に侵入する細菌の能力（INTERNAlization表現型）。統計解析は、軽度（-4 &lt;Zスコア≤-2）、重度（Zスコア≤-4）の表現型に対応し、得られた散布図内の領域を定義するために使用されました。変異体は、主に3つのクラスターで観察された：コクシエラの不良細胞内増殖をもたらした突然変異は、プロット（ 図4A、ピンクと赤のドット）の最も左の部分に分類しました。細胞内のコクシエラ内在に影響を与え突然変異がプロットの底部にグループ分けした（ 図4（a）は 、光とダークブルードット）、そして最後に、プロットの一番右の領域では、緑のドットは（非有意な表現型をもたらす変異に対応しますZスコア&gt; -2）。重要なのは、複製に失敗するが、それでも、宿主細胞に侵入することができる変異体は、細胞核（ 図4C、第二パネル）をホストするために、隣接する単一の細菌、または小さなコロニーとして、感染の7日後に検出されています。したがって、 コクシエラのサイズ」コロコロ国立環境研究所は「大幅に影響を受けることになりますが、感染した細胞の数は、WT コクシエラに感染した細胞と比較して変化しません。逆に、宿主細胞に侵入するコクシエラの能力に影響を与える変異は、コロニー/細胞の数の減少をもたらします。この数が大幅に1未満である場合には、平均して、感染した細胞の全体数の減少があることを示します。あるいは、 コクシエラコロニーの （ミクロン2）平均面積は、 コクシエラ （細胞傷害性表現型）の細胞傷害性を付与する突然変異を同定するために、感染（ 図4B）が生存した宿主細胞の数に対してプロットすることができます。上記のように、統計的分析は、軽度（-4 &lt;Zスコア≤-2）および重度（Zスコア≤-4）の表現型に対応する結果の散布図内の領域を定義するために使用されました。ほとんどの変異が大きく、宿主内細菌の複製に関係なく、細胞の生存に影響を及ぼさなかったスクリーニング細胞（ 図3B緑の点）。 37変異軽度影響を受けた宿主細胞の生存（ 図3B、光赤ドット）、および7の変異は、細胞の生存（ 図3B、暗赤色のドット）をホストするために特に有害でした。実験的なニーズに応じて、自動化された画像解析処理により得られた追加のパラメータは、他のチャートを導出するために使用することができることに注意してください。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" width="700" /> 図1：配列決定及びコクシエラトランスポゾン変異体の注釈（A）単一コロニーPCRプライマーは、トランスポゾン挿入の部位を含むDNA断片を増幅するために使用されます。増幅プライマー（アンプ）はアニール温度のストリンジェンシーに依存して特異的および非特異的プライマーの両方として使用されます。 （B）単一のプライマーコロニーPCRの典型的な結果。各をReacti上のトランスポゾン挿入部位を含むいくつかの可変サイズのフラグメントの数を生成します。他のいくつかは、ランダムに副産物低ストPCRサイクルのように増幅されます。 （C）トランスポゾン配列にハイブリダイズする配列決定プライマー（配列）の使用は、目的の断片の配列決定を可能にします。 （D）配列分析ソフトウェアは、細菌ゲノムのトランスポゾン挿入の自動アノテーションを可能にする。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" width="700" /> 図2：無菌とコクシエラトランスポゾン変異体の細胞内増殖（A）のパイロットの画面では、我々は、単離し、配列決定し、16コアグラムで38トランスポゾン突然変異体をスクリーニングしていますコクシエラドット/ ICMの分泌系のエンは（赤で示しました）。 （B）各トランスポゾン突然変異体の生存率を評価するために、それぞれの成長は無菌培地中で単離は、蛍光タグ化DNAの挿入剤を使用して、8日間にわたってモニタリングされます。 （C）それぞれの変異体は、その後、上皮細胞に感染するために使用されます。トランスポゾンは、GFPカセットを有しているように、細胞内の細菌の増殖を、マイクロプレートリーダーを使用して、 コクシエラ·レプリケーションに関連するGFP蛍光の変化を追跡することによって、感染の7日にわたって監視されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" width="700" /> 図3： コクシエラ感染の自動画像解析オート。落射蛍光顕微鏡をトリプリケート96ウェルプレートのウェルあたり画像21の位置に使用されて嵌合さ。画像解析ソフトセグメントは、定量および分析のために取得された各チャネル内のオブジェクト。すべての場合において、画像の境界に触れるのオブジェクトが除外されます。 （A）ヘキストチャネル（緑の円内）は、宿主細胞の核を識別するために使用されます。 （B）これらは（核の位置は青丸で囲まれている、細胞の輪郭が緑色である）をCy3チャネルでの宿主細胞の輪郭を識別するためのシードとして使用されます。 （C）のCy5チャネル（緑の円内）LAMP1陽性区画を識別するために使用されます。以前に同定された細胞の輪郭（赤）に含まれるオブジェクトのみが画像解析のために保持されています。 （D）GFPチャネルが（緑の円内） コクシエラコロニーを同定するために使用されます。 （E）LAMP1陽性コンパートメントとコクシエラコロニーの相関コクシエラの同定を可能にします</em&gt;含有液胞（CCVS）。以前に同定された細胞の輪郭（緑色）に含まれるオブジェクトのみが画像解析のために保持されています。 （F）は、細胞の輪郭とコクシエラコロニーの相関は、感染細胞（疑似カラー）の同定を可能にします。 4蛍光チャネルで取得した（G）画像（ コクシエラコロニー （緑）、宿主細胞の核（青）、宿主細胞原形質膜（灰色）、LAMP1陽性区画（赤）に対応する）はマージされ、例示および質のために使用されコントロール。スケールは10μmのバー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" width="700" /> 図4：ホスト/病原体相互作用に関与コクシエラ因子の大規模同定イオン（A）は、 コクシエラコロニーの （ミクロン2）平均面積は、関心の複製および内在化の表現型を同定するために、細胞当たりのコロニーの相対数に対してプロットされています。緑の点は、Zスコア&gt; -2（有意ではない）により、WT コクシエラから逸脱した表現型を表します。ピンクと水色のドットが-2、-4（軽度の表現型）との間のZスコアで、それぞれ複製および内在化表現型を表します。赤とダークブルードットは、Zスコア≤-4（強い表現型）との表現型を表します。 コクシエラコロニーの （ミクロン2）（B）の平均面積は、トランスポゾン挿入に起因する細胞毒性効果を推定するために、感染の7日を生き延びた細胞（感染し、感染していない）の合計数に対してプロットしました。緑の点は、Zスコア&gt; -2（有意ではない）により、WT コクシエラから逸脱した表現型を表します。ピンクのドットは、細胞傷害性のpHを表します-2、-4（軽度の表現型）との間のZスコアとenotypes。レッドドットは、Zスコア≤-4（強い表現型）を用いて細胞傷害性表現型を表します。矢印はC.（C）に対応する小文字によって示される変異体複製、内在化および細胞傷害性表現型の代表的な画像を示します。全ての場合において、宿主細胞の核は赤色であり、 コクシエラコロニーは緑色です。スケールは50μmでバー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52851/52851fig4highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

Q熱リケッチアは人獣共通感染症のQ熱の責任偏性細胞内グラム陰性細菌です。ここでは、 コクシエラ蛍光トランスポゾン変異体の生成と同様に、得られた内部移行、複製、および細胞傷害性表現型の自動識別と分析のための方法を説明します。

発生とのマルチ表現型ハイコンテンツスクリーニング<em&gt; Q熱リケッチア</em&gt;トランスポゾン変異体

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

本手順の全体的な目的は、宿主細胞への進入、細菌複製ニッチの形成、および持続感染を含む、感染サイクルの主要な段階に関与するCOE因子を大規模に同定することです。これは、まずトランスポゾン変異導入によりGF PT共変異ライブラリを構築することで達成されます。次に、各単離変異体を用いてホスト細胞に感染させます。その後、Coxiella感染に最も悪影響を及ぼす変異を特定するため、マイクロプレートリーダーを用いて各変異体の細胞内複製をリアルタイムで追跡します。最後に、Coxiella感染細胞を自動顕微鏡で解析します。最終的に、自動画像解析によって得られたすべての表現型の形態学的特徴付けを行うことで、各変異遺伝子をCoxiellaの感染サイクルの想定される機能に関連付けることが可能になります。この手法は、宿主と病原体の相互作用という分野における重要な課題、例えば、細胞全体と相互作用し、その分子機構を自らの利益に利用するために必要な、特定の病原体の必須遺伝子を大規模に同定することなどの解決に役立ちます。COEコロニーの平板播種および単離は困難であるため、この手法を視覚的に提示することが極めて重要です。実際、COEは非常に小さなコロニーを形成するため、軟らかいACCM two aroから慎重に抽出する必要があります。この手法は、球菌の実験室感染に関する知見を提供することが可能です。また、サルモネラ属菌（salmonella）、ブルケラ属菌（burel）、マイコバクテリウム属菌（mycobacterium）などの他の細胞内寄生性病原細菌にも適用できます。テキストプロトコルに従って、トランスポゾンおよびトランスポゼースコーティングプラスミドをコンピテントなcoxiellaに形質導入した後、個々の変異体を単離するために、微生物安全キャビネット（MSC）内で、溶融した0.5%アガロース 10 mLと2X ACCM-2 10 mLを混合して下層アガロースを調製し、適切な抗生物質を加えます。直ちにペトリ皿に注ぎ、蓋をせずに30分間冷却し、その後20分間風乾させます。上層アガロースを調製するには、15 mLポリスチレンチューブに2X ACCM-2 1.25 mLと水 0.75 mLを混合します。適切な抗生物質を加え、37 °Cでインキュベートします。次に、1〜100 µLの細菌培養液を加え、5秒間ボルテックスします。続いて、0.5 mLの融解したアガロースミックスを加え、直ちに下層のアガロースの上に注ぎます。プレートを20分間冷却させます。蓋を閉め、4 °Cで20分間インキュベートして凝固を促進させます。その後、蓋を取り除き、プレートを20分間風乾させた後、5% carbon dioxideおよび2.5% oxygenを含む37 °Cの加湿インキュベーターに移動させ、6〜7日間培養します。コロニーが確認できたら、1 mLピペットチップの先端をカットし、それを用いて単一コロニーを含むプラグを分離して回収します。その後、1.5 millilitersのaccm twoを含む24ウェルプレートの各ウェルに転送します。テキストのプロトコルに従って標準曲線を作成した後、各ウェルに10% Triton X 100を5 microlitersずつ分注し、各細菌懸濁液を定量します。壁面と底面が黒色の96ウェルマイクロプレートの各ウェルに、細菌懸濁液を50 microlitersずつ加え、プレートシェーカーで10分間インキュベートします。室温にて、XTEバッファーを用いて二本鎖DNA定量試薬を1:200に希釈し、希釈した試薬を各サンプルに55 µLずつ加えます。96ウェルマイクロプレートをプレートシェーカーで十分に混合した後、室温の暗所で2〜5分間インキュベートし、フルオレセイン標準波長用のフィルターを備えた蛍光マイクロプレートリーダーを用いてサンプルの蛍光を測定します。細菌DNA濃度のプロットを得るため、あらかじめ作成した標準曲線の蛍光読み取り値に基づき、DNA濃度をCoxiellaゲノムの質量で除して細菌濃度を算出します。テキストプロトコルに従ってシングルプライマーコロニーPCRおよびDNAシーケンシングを実施し、結果を1ミリリットルあたりのゲノム等量で表現します。配列解析ソフトウェアを用い、「align to reference」機能でCoxiella Burnett I 4 93 NMの完全なアノテーション済みゲノムをロードし、blast Nを使用してシーケンス結果をロードしてアライメントを行い、転位部位を特定します。テキストプロトコルに従って、RPMI培地中で10⁵ cells/mLのVero細胞懸濁液を調製し、底面が平坦で透明な黒色96ウェルプレートの各ウェルに懸濁液を100 µLずつ分注します。プレートを400 ×g、室温で5分間遠心分離し、37 °C、5% CO2条件下で一晩インキュベートします。翌日、室温で保管したCoxiella変異株を含む96ウェルプレートを用い、細菌懸濁液150 µLを、フェノールレッドおよびFBSを含まないRPMI 300 µLでディープウェル96ウェルプレート内で希釈します。次に、Vero細胞から培地を除去し、希釈したCoxiella変異株を1ウェルあたり100 µLずつ分注します。A1ウェルを陰性対照とし、A2およびA3ウェルを陽性対照として使用します。エアロゾル密閉型の遠心プレートホルダーを用い、室温で400 ×gで10分間、プレートを遠心分離します。その後、5% CO2の加湿条件下、37 °Cで2時間インキュベートした後、細菌を含む培地を、新鮮な完全RPMI培地100 µL/ウェルに置換します。フルオレセイン用フィルターを備えた蛍光マイクロプレートリーダーを用いて測定します。7日間にわたり、毎日GFP蛍光を測定します。感染後7日目に、プレートから培地を除去し、細胞透過性蛍光色素を1:1000に希釈して含ませた新鮮な完全培地を1ウェルあたり50 µLずつ添加します。細胞を30～60分間インキュベートした後、培地をPBSで希釈した4% PFA（1ウェルあたり50 µL）に交換し、室温で30分間インキュベートします。その後、PFA含有バッファーを除去し、PBSでウェル内を3回洗浄します。最後の洗浄液を除去した後、ブロッキング液を各ウェルに50 µLずつ分注し、室温で30分間インキュベートします。次に、ブロッキング液を、新鮮なブロッキング液と1:500に希釈したanti lamp one抗体を混合した溶液（1ウェルあたり40 µL）に交換します。室温で30分間インキュベートした後、溶液を除去し、プレートウォッシャーを用いて1ウェルあたり100 µLのPBSで5回洗浄します。その後、適切な蛍光二次抗体と5 mg/mLのhooked 3 3 2 5 8を含むブロッキング液を、1ウェルあたり40 µLずつ加えます。室温で30分間インキュベートします。サンプルを5回洗浄し、ウェルが乾燥しないよう、最後のPBS洗浄液をそのまま残しておきます。画像取得を行うには、20 x 対物レンズおよび3 4 88 5 55 と 6 15 nanometer チャンネルを備えたエピ蛍光自動顕微鏡を使用してください。1サンプルあたり最低5,000個の細胞をイメージングするため、1ウェルにつき21箇所の独立した視野を撮影します。ホスト細胞の核チャンネルをリファレンスとしてオートフォーカスを適用します。最後に、自動画像解析を用いて、取得した画像から関連する特徴量を抽出します。この図は、16箇所の点ICM Coxe Lにある38個のトランスポゾン変異体を示しており、ここでは変異体の生存能を評価するGenes aen増殖曲線が示されています。上皮細胞とともに培養したCoxiella変異体の細胞内増殖曲線により、Coxiellaゲノムにおけるトランスポゾン挿入に関連する表現型の定量的な分析が提供されます。この図では、宿主細胞の核、細胞輪郭、リソソーム、およびCoxiellaコロニーを特定し特性評価するために、自動画像取得が行われました。Coxiellaコロニーを細胞およびリソソームと相関させることで、Coxiella含有空胞の形態解析が可能になります。さらに、Coxiellaコロニーを宿主細胞の輪郭と相関させることで、感染細胞の形態解析が可能になります。最後に、これら4つのチャンネルをマージします。coxiellaコロニーの平均面積を細胞あたりのコロニー数に対してプロットし、coxiellaの細胞内複製または細菌の宿主細胞への侵入能に影響を与える変異を特定します。変異体は、coxiellaの細胞内増殖に影響を与える変異、細胞へのcoxiellaの内部移行に影響を与える変異、および有意な表現型を示さない変異の3つのクラスターで観察されました。ここでは、coxiellaの発生後に細胞毒性を付与する変異を特定するため、coxiellaコロニーの平均面積を感染後に生存した宿主細胞数に対してプロットしています。この手法により、細菌感染症分野の研究者がホストと病原体の相互作用を大規模に探索することが可能となり、感染症に対抗する新しい治療法の開発に向けたホスト側および細菌側の標的が特定されました。

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