同時 ex vivoで機能テスト in vivoで電図システム
2015年5月6日
生体内ERGは、動物や人間の孤立した無傷の網膜から直接、網膜細胞の電気的活動を記録するために使用することができます。ここでは、網膜細胞の電気的活動を解剖するために、一般的なin vivo ERGシステムをex vivo ERG記録に適合させることができることを示します。
この手順の全体的な目標は、市販のin vivo、網膜電図、またはERGシステムとex vivoアダプターを使用して、単離されたマウス網膜からの細胞の機能を評価することです。これは、最初にマウスの両目から網膜を解剖することによって達成されます。2番目のステップは、網膜の視細胞側を上にして標本ホルダーに取り付けることです。
次に、試料ホルダーをin vivo ERGシステムの加熱プレートに置き、重力制御灌流に接続します。最後のステップは、検体ホルダーの電極を増幅器に接続し、光で網膜を刺激してERG応答を得ることです。最終的に、ex vivo ERGを使用して、薬理学および特殊な光刺激プロトコルを使用して、桿体および錐体を介したシグナル伝達経路をどのように解剖できるかを示します。
この手法がin vivo、ERG、シングルセル記録などの他の既存の方法と比較した場合の主な利点は、S/N比が高く、より長く安定した記録が得られること、および簡単で定量的な薬理学的操作の可能性が得られることです。さらに、この方法は、霊長類およびヒトのドナー網膜における網膜疾患を治療するために設計された薬物の有効性および安全性をスクリーニングするために使用することができます少なくとも1日前に、ドームの上部にいくつかの黒い灰色の濾紙を接着することにより、標本ホルダーの底部を変更します。ドームの端に沿って2成分5分間のエポキシを使用し、必要に応じて、解剖顕微鏡を使用します接着剤が乾いたら、濾紙をドームに平らに押し付けます。
約1ヶ月のレコーディングで良いでしょう。次に、紙を取り除き、70%エタノールでドームを清掃します。次に、最初に電極を準備するために、電極チャネルを電極溶液で満たします。
気泡が入らないようにしてください。次に、ペレット電極を電極チャネルにねじ込みます。試料ホルダーの上部と下部を4本のネジで接続し、灌流ラインに電極溶液を充填します。
次に、電極ペアのリード線間の抵抗と電圧を測定します。抵抗は100キロオーム未満、電圧は10ミリボルト未満である必要があります。チャネルに気泡がなく、電極の状態が良好な場合は、サンプル灌流のためにガラス瓶に400〜700ミリリットルの灌流媒体を注ぎます。
また、解剖用に300ミリリットルを注ぎ、冷蔵庫で保存します。次に、灌流チューブを熱交換器ブロックに通し、予熱したブロックを加熱プレートに置きます。次に、ガス入口と灌流チューブ入口を備えたキャップでボトルを囲みます。
ガス入口はエアストーンに取り付ける必要があります。予熱したボトルを、灌流媒体が摂氏37度に維持される場所に置きます。次に、灌流ラインに灌流媒体を充填してプライミングし、OCUS科学システムで重力駆動の流れを開始します。
ボトルをファラデーケージ内に配置してノイズを最小限に抑え、試料ホルダーからの長い灌流出力ラインを使用します。試料ホルダーと灌流ボトルのレベルよりかなり下に配置され、これらの出力ラインをシールドし、ファラデーケージを介してシールドをアンプのグランドに接続します。電磁ノイズがERG信号に結合するのを防ぐために、温度プローブを加熱ステージに取り付けます。
レギュレーターを使用して、溶液の流れを毎分3〜5ミリリットルに調整します。最後に、必要に応じて、車とガスを溶液に導入し、エアストーンからの気泡の安定した流れのためにレギュレーターを調整します。まず、大きなペトリ皿に約200ミリリットルの冷灌流溶液を注ぎ、試料ホルダーの底部全体を完全に浸すことができます。
12、12時間の暗い光のサイクルの下で育てられた動物を安楽死させ、その後、録音の前に6〜12時間暗く適応させます。以下の手順はすべて、薄暗い赤色または赤外線の下で実行する必要があります。各眼球を分離した後、眼球培地に入れます。
次に、片方の目を紙の上の小さな濾紙に移します。ピンセットでつかみ、スリットからオーラセラータとほぼ同じ高さにスリットを切り込みます。オーラセラータに沿って、または赤道に近い場所で切断して、角膜とレンズを取り外します。
次に、角膜とレンズの端を取り外し、アイカップを冷たい媒体に戻します。もう一方の目でこれと同じ手順を繰り返します。次に、アイカップを使用して、上から視神経に向かって小さな切開を行います。
網膜と強膜の間にはさみを挟み、網膜ができるだけ無傷のままになるようにします。次に、2本のピンセットを使用して切開部の両側の強膜をつかみ、組織を引き離して網膜を剥離します。網膜を分離するには、視神経を切断し、その遠位面への接触を最小限に抑えて網膜を切除します。
次に、分離された網膜を標本ホルダーのドームに取り付けます。まず、標本ホルダーの底部を解剖した網膜のあるペトリ皿に浸します。次のスライド。
網膜の視細胞または凸面がドームの上を上向きになります。次に、標本ホルダーをそっと持ち上げて、網膜が濾紙にくっつくようにします。次に、もう一方の網膜についても手順を繰り返します。
次に、ホルダープレートを慎重に乾かして、クロストークノイズと信号のシャントを防ぎます。ホルダーを乾燥させた後、上部をねじ込み、針を使用してシリンジからの灌流液を灌流チャネルに充填します。試験片ホルダーを熱交換ブロックの隣に置きます。
次に、入力灌流ラインと出力灌流ラインを接続します。電極をERGアンプに接続し、刺激装置制御ユニットを試料ホルダーに取り付けて、セットアップを完了します。アダプターの使用 大規模で再利用可能な応答を得るためには、網膜の慎重な解剖と取り付けを行うとともに、網膜の上で安定した気泡のない灌流を維持することが重要である。
網膜の温度と機能が安定するように10〜20分待って、フラッシュ応答を暗く適応した野生型C57ブラック6網膜から、異なる標準増殖溶液を使用して記録しました。応答波形と動力学は、エイムズ媒体とロック媒体で類似しているように見えました。ロッド光受容体の感度も同様でした。
一方、重炭酸塩またはカルボゲン応答のないヒープ緩衝リンゲル溶液では、振幅は有意に小さかった。BWAの安定性は、ヒープのリンガーでもしばしば損なわれました。40マイクロモルのA PBを追加すると、正のB波が効率的に除去されました。
これにより、ミューラー細胞の活性に起因するとされる大きくてゆっくりとした負の波が明らかになり、100マイクロモルのバリウムが廃止されました。この成分は、ex vivo ERGシグナルの光受容体応答を明らかにしています。この手法は、薬理学や遺伝学などの他のツールと組み合わせることで、ヒトの網膜を含む哺乳類における網膜シグナル伝達や失明性疾患の分子メカニズムに関する疑問に答えることができます。
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概要
本記事では、摘出したマウス網膜から電気活動を記録するための ex vivo 網膜電図（ERG）の使用法を実演します。この手法により、薬理学的処置および光刺激技術を用いて、桿体および錐体のシグナル伝達経路を解析することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 電気生理学
- 網膜生物学
背景
- 網膜電図（ERG）は、網膜内のさまざまな細胞種の電気的反応を測定するために用いられる手法です。
- ex vivo ERGにより、生体外で網膜細胞機能の詳細な解析が可能になります。
- この手法は、視覚のメカニズムや網膜疾患に関する知見を提供することができます。
- in vivo ERGシステムをex vivo用に適応させることで、実験の柔軟性が向上します。
研究目的
- 単離したマウス網膜の網膜細胞の機能を評価すること。
- in vivo ERGシステムのex vivo記録への適応を実証すること。
- 桿体および錐体によって媒介されるシグナル伝達経路を解析すること。
使用方法
- マウスの眼からの網膜の分離。
- 刺激用標本ホルダーへの網膜の装着。
- 加熱プレートおよび重力制御灌流システムへの接続。
- 光刺激および応答記録のための、アンプへの電極接続。
主な結果
- 分離網膜からのERG応答の記録に成功すること。
- シグナル伝達経路の薬理学的解析を実証すること。
- 網膜細胞機能を研究するためのex vivo ERG法の妥当性を検証すること。
- 桿体および錐体介在性のシグナル伝達メカニズムに関する知見を得ること。
結論
- Ex vivo ERGは、網膜生理学を研究するための有用なツールです。
- この手法により、刺激に対する細胞応答の詳細な解析が可能になります。
- in vivoシステムをex vivo用に適応させることで、研究能力を広げることができます。
よくある質問
産業界における重要性
in vivo ERGシステムを用いて2つの網膜のex vivo機能試験を同時に行うことで、網膜細胞の機能および薬理学的反応の高スループットかつ定量的な評価が可能になります。このアプローチは、完全な網膜組織において化合物の有効性と安全性を直接評価できるため、初期段階の眼科薬開発における予測の信頼性を向上させます。本手法は、網膜疾患を標的とする治療法のメカニズム的なリスク低減およびポートフォリオの選別を支援します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 無傷の網膜組織における桿体および錐体のシグナル伝達経路を直接的に解析することが可能です。
- ERG（網膜電図）構成要素の薬理学的解剖を通じて、機能的なターゲットバリデーションを促進します。
- 候補化合物に対する特定の細胞型の反応を分離することで、メカニズム的なリスク低減を支援します。
- ターゲットへの結合（target engagement）における予測精度の向上のための定量的なデータを提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 化合物スクリーニングワークフロー向けに、検証済みのex vivo網膜システムを調製します。
- アッセイの標準化に向け、S/N比が高く再現性のあるERG出力を提供します。
- 2つの網膜の並行テストを可能にし、スループットとデータの堅牢性を向上させます。
- 疾患関連組織における薬効および安全性の信頼性の高い評価をサポートします。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- ドナー網膜の使用を可能にすることで、前臨床試験をヒト疾患の関連性と一致させます。
- 定量的な機能的読み取りにより、創薬から前臨床検証までの連続性を維持します。
- 組織の直接的な反応に基づいた、リスク調整後の進展判断を容易にします。
- ERG波形解析を通じて、トランスレーショナル・バイオマーカーの開発を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、網膜組織の機能的試験のためのスケーラブルで定量的なプラットフォームを提供することにより、初期の発見と前臨床検証を橋渡しします。これは、ターゲット検証からリード化合物の同定、および前臨床での有効性評価に至るワークフローに統合されます。
- 探索生物学：薬理学的操作および光刺激プロトコルを通じて、仮説検証とパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング：化合物評価およびアッセイ開発に適した、再現性のある定量的なERG出力を提供します。
- 分析：測定可能なERG波形と成分の分離を実現し、異なる条件下での比較分析を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：ドナー網膜が利用可能な場合、ヒト疾患モデルとの整合性を確保できます。
- エンタープライズ再利用：商用のin vivo ERGシステムをex vivoアプリケーションに活用し、インフラの有用性を最大化します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：網膜薬剤探索における予測信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用の価値：スケーラブルで再現性のあるプロトコルとデュアルサンプル処理能力により、機能試験を標準化する。
- 戦略的価値：早期の機能的リスク低減を可能にすることで、go/no-go判断と資本効率を向上させる。
- ポートフォリオへの影響：眼科領域の候補物質のリスク調整済み優先順位付けおよび推進を支援する。
実施上の留意点
- 網膜の剥離、電気生理学、および薬理学的操作に関する専門知識が必要です。
- カスタム検体ホルダーおよび灌流装置を備えた市販のin vivo ERGシステムが必要です。
- 再現性とデータの比較可能性を確保するため、チーム間での厳格な標準化が求められます。
- プロトコルの最適化により、さまざまな動物モデルやヒトドナー組織への適応が可能です。
- 信号品質は、灌流の安定性、ノイズ遮蔽、および組織の取り扱いに依存します。
