学習の離散段階中げっ歯類におけるリモートサイレン神経活動のための方法

この手順の目標は、動物が学習と記憶の課題に従事している間に、個別の脳領域のニューロン活動を一時的および遠隔的に沈黙させることです。これは、最初にデザイナー受容体とレポーターを含むa a Vを注入用の注射器に装填することによって達成されます。2番目のステップは、ラットの脳の関心領域にa a Vを注入することです。

次に、生物学的に不活性なデザイナードラッグであるクロザピンとオキシドを調製し、ラットに全身注射します。最後のステップは、感覚的なプレコンディショニングパラダイムを使用して行動テストを実施することです。最終的には、ラットの脳組織に対する免疫蛍光顕微鏡法を使用して、デザイナー受容体の配置を確認します。

この方法は、動機付け、注意、学習、記憶の調節など、行動神経科学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます アデノ随伴ウイルスを扱うためのすべての制度的予防措置が全体を通して守られていることを確認してください このビデオで使用されているウイルスは、バイオセーフティレベル1の化合物として分類されています。10%漂白剤溶液を準備します。av廃棄物の場所、漂白剤溶液と滅菌10マイクロリットルの注射器を含むベガの除染。

ワークスペースで、a a Vのアリコートを含むマイクロ遠心分離管を標準のベンチバイスロード、A Vの少なくとも4マイクロリットルの10マイクロリットルのシリンジに配置します。シリンジで、空のウイルスチューブを10%漂白剤を含むビーカーに捨てます。

廃棄物容器に10%漂白剤を追加し、施設のガイドラインで指定されているように、除染された液体廃棄物を廃棄する前に、廃棄物を30分間放置します。脳定位固定装置の下と、ウイルス専用エリアとして指定された隣接するスペースに吸収性ベンチペーパーを配置して、手術エリアを準備します。麻酔を誘発した後、1分間に1リットルの割合で3%のアイソフ、フッ素、および酸素を投与しました。

目の間から耳の少し後ろまで毛皮を剃りました。剃毛後、ラットを定位固定装置に固定した状態で、ラットを誘導室に3分間戻します。眼科軟膏で目を覆い、ベタジンで洗浄して切開部位を準備します。

皮膚の正中線を2.4センチメートル切開した後、頭蓋骨を覆い、目に対して約2ミリメートルのコード状を開始し、皮膚を引っ込めて頭蓋骨を露出させ、次に頭蓋骨から膜組織を取り除きます BGMAとラムダがはっきりと見えるまで。頭蓋骨が平らであることを確認した後、ドリルをbgmaに配置し、座標をゼロにしてから、ドリルを目的の内側、外側、および前方の後部座標に移動します。0.9、0.7、または0.5ミリメートルのドリルビットを使用して穴を開けます。

輸液ポンプを、毎分0.2マイクロリットルの速度でウイルスを送達するように設定します。シリンジを定位固定装置の輸液アームに差し込み、シリンジを所望の座標まで下げる。ウイルスの送達が完了した後、ポンプを使用して必要な量のウイルスを送達します。

追跡された針への逆流を防ぐために、シリンジを10分間そのままにし、シリンジを毎分約5ミリメートルの速度でゆっくりと上げます。次に、次の座標に移動し、すべての座標にa a vが注入されるまで手順を繰り返します。傷口を閉じ、承認されたプロトコルに従って術後鎮痛を行った後、ラットを清潔なケージに入れ、寝具、蓋、適切な標識を設置します。

ラットが麻酔から完全に回復したら、ハウジングルームに戻します。デザイナー受容体の適切な発現を確認するために、行動試験を開始する前に3週間以上かかります。この図は、感覚前調整パラダイムの3つの段階、前調整段階、条件付け段階、およびテスト段階を示しています。

デザイナードラッグ、クロザピンと酸化物またはCNOは、神経活動を沈黙させるために使用されます デザイン受容体を活性化することにより、CNOはテストの任意のフェーズの前に注射することができます。ここでは、各プレコンディショニング セッションの 30 分前に CNO が注入されます。クロザピンと酸化物の新鮮な1ミリグラム/ミリリットル溶液を調製した後、プロトコルの書面による部分の指示に従って、行動試験の30分前に1キログラムあたり1ミリグラムの用量でCNO腹腔内注射します。

適切な動作セッションのコンピュータ コードを開始します。30分が経過したら、ラットを試験室に置き、聴覚刺激と視覚刺激の送達からなる12の混合試験をラットに提示することにより、4つの64分間のプレコンディショニングセッションの最初のセッションを開始します。6つの試行では、前提条件の刺激を10秒間トーンで提示し、その後すぐに他の6つの試行で点滅する光の刺激を5秒間提示します。

ホワイトノイズ、未放送の刺激を10秒間だけ提示します。プレコンディショニングフェーズが完了したら、5日間連続して実施されるコンディショニングセッションを開始します。視覚刺激の送達、5秒間の点滅光、および直後に2つの45ミリグラムの食品ペレットの送達からなる8つの試行をラットに提示します。

この時間には、コンディショニング セッションが完了したときに 7 分を短縮する試行間インターバルが含まれます。聴覚刺激のみの送達からなる 12 の混合試験をラットに提示することにより、78 分間の 1 回のテスト セッションを実行します。6つの試験で。

トーン刺激、前提条件刺激を単独で10秒間提示します。他の6つの試行では、ホワイトノイズ、ペアになっていない刺激を10秒間だけ提示します。行動課題が完了したら、すぐにラットをチャンバーから取り出し、動物のコロニーに戻します。

コンディショニングとテストフェーズのデータを、プロトコルの書かれた部分の詳細な指示に従って分析します。タグ付きレポーターまたはレポータータンパク質に対して指示された免疫組織化学を行った後、顕微鏡で染色切片を調べてデザイナー受容体およびまたはレポーターの位置と発現を確認し、予想通り対照および実験ラットは同様に、点滅光刺激と食物との間のパブロフ関連を学習した。コンディショニングセッション中。

セッションでは、両グループともコンディショニングセッション中に食事報酬を得るように動機付けられました。対照的に、重要なテストセッション中、実験ラットは前処理された聴覚刺激と放映されていない聴覚刺激を区別できませんでしたが、対照ラットは、前提条件刺激の提示に反応してより大きなフードカップ行動を示しました。したがって、実験ラットではなく対照ラットは、感覚プレコンディショニング効果を示しました。

この画像は、げっ歯類の脳の関心領域へのa a v注入の位置の組織学的検証を示しています その発生後。この技術は、神経科学の分野の研究者が、特定の脳領域や細胞タイプがin vivoで複雑な行動に寄与する可能性を探求する道を開きました。