Name: 学習の離散段階中げっ歯類におけるリモートサイレン神経活動のための方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: 学ぶ 薬理遺伝学的手法を用いてラットの特定脳領域の神経活動を一時的にサイレンスし、感覚前条件付けパラダイムによる学習・記憶課題への影響を解析する方法です。

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我々は、このプロトコルが部分的に誘導される原稿への貢献のためにロビンソンら 12の作者に感謝します。

動物の使用は、オベリン大学施設内動物管理使用委員会によって承認され、ケアと実験動物の使用のためのガイド21に従っているされています。 ウイルス注入のための1.準備注：このプロトコルは、BSL-1の予防策を使用しています。 BSL-2の予防措置を採用する場合、使い捨て白衣、手袋、靴カバー、目の保護と、微粒子レスピレーター（タイプN95）が必要です。 BSL-2の化合物を取り扱うすべての個人は、地元の公衆衛生当局により粒子状レスピレーターについて試験フィットする必要があります。ウイルスベクターの取り扱いおよび保存の詳細についてはローリー＆Majewska（2010）22を参照してください。 <ol><li>最初の使用時には、一定量と凍結融解の繰り返しを避けるために、20μlのマイクロ遠心チューブに使用されていないウイルスを保存します。 </li><li>不要なオブジェクトを削除し、70％エタノールで表面を殺菌することにより、作業面を準備します。 1を準備AAVの廃棄物を除染するための0％漂白剤溶液。漂白剤溶液とワーク表面に滅菌10μlの注射器の完全なビーカーを置きます。セットアップ中に砕いた氷の入った容器内のAAVでマイクロチューブを置きます。 </li><li>標準ベンチバイスにウイルスをマイクロ遠心チューブを置きます。 AAVの少なくとも4μlの10μlの注射器をロードします。ローディング中にマイクロチューブの底に対する注射器の先端を曲げないように注意してください。シリンジ内のAAV液4μlの中に気泡がないことを確認してください。 </li><li> 10％の漂白剤の入ったビーカーに、空のウイルス管廃棄してください。供給者によって指定されるように、ウイルスの未使用部分を格納します。 </li><li>廃棄物容器にさらに10％の漂白剤を追加し、廃棄物の除染廃液を処分する前に30分間座ってすることができます。 </li><li>施設の指針の指示に従ってバイオハザードコンテナ内のすべての保護具とプラスチック廃棄物を処分します。アールデコ10％の漂白剤を使用して、ウイルスに接触してきた任意の機器や表面をntaminate。 </li></ol> 2.手術<ol><li>定位固定装置の下に、専用のウイルス取扱い場所として指定され、隣接する空間に吸収性のベンチ紙を置くことによって、手術領域を準備します。 <ol><li>外科手術装置の近くに専用のウイルス処理領域に10％漂白剤廃棄用容器を置きます。 </li></ol></li><li>麻酔の安定したレベルを誘導し、手術のためにラットを準備します。 <ol><li>意識と総意図的運動の欠如の損失があるまで、イソフルランガス（1〜3％の範囲）と酸素（100％で約1リットル/分）の混合物を含有する誘導室にラットを置きます。外科的処置を通してイソフルラン麻酔を維持します。 </li><li> 6深い麻酔が達成された後、少し耳の後ろに目の間から、ラットを剃ります。 </li><li>用の誘導室に戻したラットを置きます追加の1-3分。 </li><li>イソフルラン麻酔システムは、定位手術のノーズコーンに接続されていることを確認してください。 stereotaxにイソフルランの流れを開始するためにイソフルランチューブのコックを開きます。上記で指定したレベルでのイソフルランと酸素を維持します。 </li><li>一口バーの上に口を確保し、耳のバーを固定することによって定位固定装置にラットを置きます。 </li><li>前切開手術部位への目とベタジンに目の潤滑剤を塗布します。 </li></ol></li><li>目に尾約2mmを開始頭蓋骨の背側表面にスキン2.4センチ正中切開を行います。頭蓋骨を露出させるために皮膚を撤回。定期的に乾燥から組織を防止するために、手術部位の縁に滅菌0.9％滅菌生理食塩水を植え付けます。 </li><li>ブレグマとラムダまで頭蓋骨から明らかな膜状の組織がはっきりと見えます。 </li><li>頭蓋骨に背腹座標を測定することにより、レベルであることを確認してくださいブレグマとラムダで。ブレグマとラムダで背腹座標がない以上0.04ミリメートルによって異なりまで応じて定位装置を調整します。 </li><li>このとき、2〜2.5％のイソフルランガスを削減します。 </li><li>座標リゼロ、ブレグマにドリルを返しますし、目的の内側 - 外側にドリルを移動し、前後座標。 </li><li>それは28のG注入シリンジに適したサイズの穴を生成するように0.9ミリメートルのドリルビットを使用して座標で穴を開けます。 </li><li> 0.2μL/分の速度でウイルスを配信するために注入ポンプを設定します。定位装置の注入腕に注射器を置き、目的の座標にシリンジを下げます。ウイルスの所望量（0.8μLの範囲0.1）を提供します。例えば、4分かけてAAVの0.8μLを提供します。 注：理想的な注入量と関心の各領域におけるウイルスの典型的な広がりを決定するために、パイロット研究を行っています。 <ol><li>ウイルスの送達は共同したら針管内に逆流を防止するために、10分間の場所に注射器を残しmplete。ゆっくりと約5mm /分の速度で注射器を上げます。すべての座標は、AAVを注入されるまで繰り返します。 </li></ol></li><li>外科用ステープルとコート局所抗生物質軟膏で傷を使用して傷を閉じます。 </li><li>術後疼痛管理のための機関のガイドラインに従ってください。 </li><li>寝具、蓋と適切なsignageのあるケージにラットを置き、動物施設にラットを返します。 <ol><li> BSL-2の予防措置の下で働いた場合は、施設のガイドラインで指定された時間（通常は48〜72時間）のためにベッドを収集します。バイオハザード廃棄物容器の中にベッドを配置します。 </li><li>彼らの安全に処分するためのガイドラインで指定されたすべてのAAV-汚染物質廃棄してください。 </li></ol></li></ol> 3.行動装置注：感覚前処理装置は、標準的なオペラント条件付けチャムで構成されていBERステンレス鋼格子床を有する（12 &quot;の長さx 9.5&quot;幅x 11.5 &quot;H）、2プレキシガラス側壁と2金属壁。 <ol><li> 2 Hzで点滅するとき、家の光のように視覚刺激として機能するアルミ壁の1つに2.8 Wの光をマウントします。聴覚刺激（10秒、1500 Hzで、78デシベル純音と10秒78デシベルホワイトノイズ）を提供するために、チャンバにスピーカーをマウントします。 <ol><li>食品カップに45mgの食物ペレットを提供するために食品のホッパーを使用してください。食品カップ内では、赤外光電セルは、刺激のプレゼンテーションや食品の報酬の間と後に、前の食品カップに費やされた合計時間を検出します。 </li><li>音響減衰キャビネットの家は、チャンバ排気ファン（〜68デシベル）を装備（22 &quot;W×22&quot; H×16 &quot;D）。 </li><li>オペラントチャンバーを制御し、データを取得するメッドアソシエイツのソフトウェアを搭載したPCのコンピュータを使用してください。コンディショニングセッション中、presenta中の食物カップにヘッドと過ごした合計時間に関するデータを収集光刺激（5秒エポック）の化と食品の報酬（5秒エポック）のプレゼンテーション中。テストセッション中に、聴覚刺激（聴覚刺激が終了した時点から10秒エポック）の発表に応じて、食品カップに費やされた合計時間のデータを収集。 </li></ol></li></ol>感覚前処理パラダイムの4概要<ol><li>手術から回復した後、徐々に食品は自由摂食体重の85％のラットを制限します。適切な食事制限パラダイムのための獣医のスタッフにご相談ください。 注：3相の感覚前処理パラダイムは、 図2に示されています。 </li><li>前処理セッション（フェーズ1、4日連続渡って行っ毎日64分間のトレーニングセッション）： <ol><li>聴覚と視覚刺激の送達から成り12混在試験で存在ラット。平均4.5分（範囲4.0から5.0分）、各Aの後のことを試行間間隔を含みますuditoryプレゼンテーション。 </li><li>試験の6で、10秒間のトーン（前の刺激）を提示、点滅光刺激の5秒プレゼンテーションの直後。 </li><li>他の6件の試験では、10秒間だけでは白色雑音（不対刺激）を提示。 </li></ol></li><li>コンディショニングセッション（フェーズ2、5日連続渡って行っ毎日64分間のトレーニングセッション）： <ol><li> 5秒間視覚刺激（点滅光刺激）の配信で構成さ8件の試験で、本ラットは2 45mgの食品ペレットの送達によって、その直後。各試験の後に7分（範囲6.0から8.0分）を平均試行間の間隔が含まれます。時折ラットは、光食品関連を学ぶために5つ以上のコンディショニングセッションを必要とします。 </li></ol></li><li>テストセッション（フェーズ3;単一の78分セッション）： <ol><li>単独で聴覚刺激の送達から成り12混在試験でラットを提示します。 aveの試行間間隔を含みます各聴覚発表後の怒り4.5分（範囲4.0から5.0分）。 </li><li>試験の6で、10秒間だけで音刺激（前刺激）を提示。 </li><li>他の6件の試験では、10秒間だけでは白色雑音（不対刺激）を提示。 </li></ol></li><li>不対刺激としてプレコンディショニング刺激とトーンとしてホワイトノイズを受けたラットの第二のセットでの研究を完了することによって刺激を相殺します。 </li></ol> 5.薬理学的および行動手順<ol><li>行動装置の電源をオンにして、適切な行動のセッションのためにMED-PCコードをロードします。ワイヤとプログラム行動装置音響減衰キャビネットに搭載されているファンは、電源がオンになっているときにオンするように。 </li><li>クロザピンN-オキシド（CNO）の1 mg / mlの溶液を調製し、15ミリリットルコニカルチューブにCNO 5.0mgの重量を量るし、滅菌0.9％のSalIの5滅菌水のmlまたは5ミリリットルを追加しますNE。ソリューションまで渦は明らかです。 <ol><li> CNOは、溶液中に溶解しない場合、またはCNOのより濃縮された溶液は、DMSO 23として、可溶化剤を加える必要な場合。具体的には、CNOの5.0 mgの秤量し、15ミリリットルコニカルチューブにDMSOの25μlを添加、0.5％DMSOでCNOの1 mg / mlの溶液を調製しました。内容は、チューブの底に残っていることを確実に静かにフリック。溶液が透明になった場合には、滅菌水5 mlまたは0.9％滅菌生理食塩水を5ml追加します。 CNOの溶液を調製するための詳細な手順は、DREADDウィキリソースページ25で利用可能です。 </li><li>それが投与され、毎日新しいCNO溶液を調製します。 </li></ol></li><li> 1ミリグラムの用量で腹腔内にCNOを注入は、/約30分前行動試験にキロ。例えば、1mg / mlのCNOの溶液0.2mlで200gのラットに注入します。 CNO投与の用量および時間経過は、以前に公表された報告2,12に基づいて選択しました。<ol><li> （フェーズ1;注射の4日間の合計）は、各事前調整のセッションの前にCNO 30分を注入するが、後続のすべての行動のセッションの前に車を管理します。 </li></ol></li><li> 30分後、行動試験室にラットを配置し、適切な行動のセッションのためのコンピュータコードを開始します。 </li><li>行動タスクが完了すると、すぐに部屋からラットを削除し、動物コロニーにラットを返します。 </li></ol>行動データの分析6. 注：すべての行動のセッションの従属変数は、食品カップにおける赤外光電セルの中断によって検出されるように、ラットの頭が食物カップの内側にある時間です。 （秒での）データを収集し、コンピュータソフトウェアによって記録されます。 <ol><li>前処理段階の間に生成されたデータに解析行っていません。 </li><li>コンディショニングセッションの場合：各ラットのAを分析5行動セッションで視覚刺激の提示中の食物カップの挙動を比較することにより、光の食品関連を学ぶための性。具体的には、/セッション8件の試験（ すなわち、持続時間/ラットの各5秒である8回の平均値）のそれぞれについて、5秒の光エポック中の食物カップに費やされた平均時間を計算。平均対照と5毎日の各セッションのための実験値を（ 図3Aを参照）と比較します。 <ol><li>上記の5秒の光エポックのために指定されているのと同じ計算を使用して5行動セッション間で食品の報酬（5秒エポック）の配信中の食物カップの挙動を比較することにより、食品の報酬を得るために、ラットの動機を分析します。これらの値は、視覚刺激の提示の間に取得されたものよりも一貫して高くなります（ 図3B参照 ）。 </li></ol></li><li>テストセッションの場合：PRESに応じて、ラットの食物カップの動作を示し判別率を算出各聴覚刺激のentations。 <ol><li>具体的には、各ラットについて、の6プレゼンテーションの各次の食品カップにかかった平均時間の合計によって感覚プレコンディショニング刺激（ すなわち、トーン）の6プレゼンテーションの各次の食品カップにかかった平均時間を分割感覚プレコンディショニング刺激（ すなわち、音刺激）と対になっていない刺激（ すなわち、白色雑音刺激）の6プレゼンテーションの各次の食品カップに費やされた合計時間の平均。各エポックは、持続時間が10秒です。 注：0.5またはそれ以上の識別スコアは、ラットは、感覚プレコンディショニングのパラダイムに固有の関連付けを学んだことを示しています。 </li></ol></li></ol> AAVの配置や表現の7検証<ol><li> 4％パラホルムアルデヒドを使用して経ラットを麻酔し、灌流。これにより、蛍光標識の使用を、分の2時間の後の固定時間を越えません抗原性の損失をマイズし、蛍光シグナルを維持するために。 </li><li> 2日以上、または脳の脳のジャーの底に沈むまで、リン酸緩衝生理食塩水（1×）中の20％ショ糖溶液30mlを含む脳の瓶にそれらを転送することにより、脳灌流を脱水。 </li><li>関心領域の全体rostrocaudal程度を通して冠状脳切片（20〜40μm）を作るために凍結滑走式ミクロトームを使用してください。 </li><li>デザイナー受容体および/ ​​またはレポーター12の位置および発現を確認するためにタグ付けされた受容体またはレポータータンパク質に対して向けられた免疫組織化学を行っています。免疫組織化学染色プロトコルはDREADDウィキリソースページ25上に設けられています。 </li><li>水性マウンティング培地の100〜200μLを使用してスーパーフロストプラススラ​​イドとカバーガラスの上にセクションをマウントします。 </li><li> AAVの配置およびタンパク質発現12,24を確認するために、脳組織の蛍光顕微鏡を実行します。</li>
</ol>

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

このプロトコルは、特定の脳領域は、多相複雑な学習課題にどのように寄与するかを調べるために、薬理遺伝学的アプローチ（DREADD）を適用する方法について説明します。一時的と遠隔学習のフェーズに個別の脳領域における神経活動を沈黙させる能力により、アプローチのこの組み合わせは、学習のより微妙またはマスクされた形態を含む行動の広い範囲を調査するためのプラットフォームを提供します。この手順で説明した例では、retrosplenial皮質（RSC）でデザイナー受容体を発現する対照ラット及びラットを3相の行動タスク12で試験しました。タスクの第一段階は、刺激の2間の刺激 - 刺激の関連付けを買収するラットを制御仮定して、複数の中性刺激の提示を含んでいました。作業仮説は、RSCが30分前行動試験の開始まで4コンディショニング日、のそれぞれに、このように、刺激 - 刺激学習のために必要であるということですING、対照および実験ラットは、デザイナーの薬（CNO）またはビヒクルのいずれかの全身投与を与えられました。デザイナーの受容体に結合すると、CNO、その受容体が発現しているニューロンの活性を低下させます。 RSCが学習に影響を与える...

行動神経科学の分野内の刺激的な課題は、複雑な行動の神経基盤を決定することです。このような永久的な病変、カニューレインプラントを介して、一時的な脳の不活性化および光遺伝学などの多くの技術は、複雑な動作のサブコンポーネントに個別の脳領域の寄与を識別するために使用されてきました。これらのアプローチは、学習中に地域特異性の我々の理解を通知するが、各手法には限界がないわけではありません。具体的には、永久的な病変は、典型的には、ので、それらの影響は、パラダイムの期間全体に存在している、行動試験の前に実施されます。短期神経不活性化（ 例えば、テトロドトキシン）の提示を伴う挿管の研究は、脳組織に重大な障害を生成することができますし、直前の行動試験に被験者にストレスを誘導することができます。また、挿管を介して不活性化は、周囲の組織の領域に限定されていますカニューレの先端。光遺伝学は、特定の脳領域における活動の時間的制御のための柔軟性の範囲を提供しています最後に、それはコスト法外と技術的に厳しいです。 これらの制限は、薬理遺伝学的ア ​​プローチ（デザイナ-受容体-排他的活性化·バイ·デザイナードラッグ、DREADDs）1,2を使用して克服することができます。薬理遺伝学の概念は洗練されながら重要なこと、技術の実行は簡単です。個別の脳領域への毒素の注入（ 例えば、NMDA、イボテン酸）を含む従来の定位外科的方法と同様に、この手法は、修正阻害Gタンパク質共役受容体のためのDNA断片を含有するアデノ随伴ウイルス（AAV）を注入することを含みます（hM4Di;デザイナー受容体）の標準的な実験用げっ歯類の関心領域には（ 図1参照します）。ウイルスベクターはまた、蛍光レポーター（mcitrine）が含まれています。に組み込まれたら細胞に、デザイナーの受容体（およびレポータータンパク質）は、最大で2〜3週間後に注入を発現し、選択的に他の方法で生物学的に不活性なデザイナーの薬剤の全身投与、クロザピン-N-オキシドにより2-5時間のために活性化することができます（CNO）1 、3。実験者は、特定の脳領域における神経活動を正確に、しかも遠隔時間的制御に恵まれているので、薬理遺伝学は、複数のフェーズで実施されている行動パラダイムで特によく兼ね備えています。この例では、retrosplenial皮質（RSC）の寄与がする刺激 - 刺激学習がパブロフ学習におけるその役割と比較され、アプローチのしかし、この組み合わせはに貢献どのように特定の脳の領域を識別しようとするのいずれかの質問の数に適しています複雑な挙動。 本プロトコールに記載されていないがまた、ウイルスおよびトランスジェニックアプローチは、細胞型特異的DREADD式2を達成することができます。私のようにDREADDアプローチを採用した場合、薬理学的および/または実験操作の他のタイプを伴う行動パラダイムに内在するのは、実験計画とその後の定量分析を慎重に検討が必要です。 DREADDアプローチの新しい実験者は、現在のDREADD技術2の包括的見直しと呼ばれています。 毎日、生物は新たな刺激やイベントと相互にそれらの関係について学びます。でも使い慣れた環境では、そのような家庭のように、1は、これらの変更は、意味のあるイベントを予測することができるので、刺激間の関係の変化を検出するために迅速です。このような刺激-刺激（ すなわち、関係）学習は、複数の刺激の対等接続を必要とし、伝統的な内側頭葉4内の中央に置かれ、海馬、と関連しています。しかし、海馬が存在したり、単独では動作しません。内と外の両方の皮質領域内側側頭葉の側は海馬5-7に重要な感覚情報を提供しています。伝統的な永久的な損傷の研究は、海馬依存性学習における皮質領域（ 例えば、retrosplenial、postrhinalおよび嗅内皮質）の数の関与のための説得力のある証拠を提供するが、離散段階で特定の領域の役割を認識する能力が制限されています8-10を学びます。 本プロトコルは、RSCは、3相の感覚プレコンディショニングのパラダイム11,12の単相中にRSCをサイレンシングすることによって刺激刺激学習のために必要であるという仮説をテストします。簡単に言うと、ラットは、デザイナーの受容体を含有し、2〜3週間後に行動試験の開始前にデザイナーの薬（CNO）30分を投与されたAAVの注入を受けます。本プロトコルでは、実験的なラットは、テストの第一段階（刺激 - 刺激リア中CNOを受け取りますNingが発生する）、彼らはテストの次の2段階の間に車両を受けます。行動上のCNOの不注意の影響を制御するには、デザイナーの受容体（hM4Di）のラットを注入し、代わりにCNOの車両に注入します。ウイルス注入および受容体の発現の全体的な影響を考慮するために、デザイナーの受容体を含有し、CNOを投与しない対照ウイルスを注入。 AAVの種々の血清型の数は、遺伝物質を送達するために使用されます。組換えまたは合成分子が関与する研究のための現在のNIHガイドラインは、導入遺伝子が潜在的に腫瘍形成遺伝子産物または毒素分子のいずれかをコードしないとの非存在下で産生される、AAV（すべての血清型）および組換えまたは合成AAV構築物と主張しますヘルパーウイルスは、BSL-1注意事項（付録B-1。リスクグループ1（RG1）エージェント）13が必要です。 AAV構造、ユーティリティおよび安全性に関連するレビューの数は14,15利用できます。注目すべきは、しかしAAVで作業する場合、げっ歯類では可能な生殖16,17および潜在的な発がん性のメカニズム18-20に関連する問題のために、いくつかの機関は、BSL-2の予防策を使用する必要があります。米国では遺伝子操作のためのウイルスベクターを使用する場合に研究のための疾病管理センターおよびNIHガイドラインは組換えDNA分子13を伴う、研究を実施する個々の機関の監督委員会との協議により、使用前に適切なBSLを確認してください。個人用保護具、研究者の訓練、ベクトル封じ込め、除染、除染材料の廃棄、および注射後の動物収容要件は、これらのガイドラインで指定されています。また、相談して、適切な動物実験に続き、安全な取り扱い、管理、およびAAVの処分を確保するために、委員会のガイドラインまたは同等の機関監督委員会のガイドラインを使用してください。

<table><tbody><tr><td>オス、ロングエバンスラット、55-60日齢</td><td>Hilltop Lab Animals Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rAAV8 / hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mシトリン</td><td>ウイルスベクターコア</td><td></td><td>注意:これはBSL-1化合物</td></tr><tr><td>rAAV8 / hSyn-GFP</td><td>ウイルスベクターコア</td><td></td>です <td>注意:これはBSL-1化合物</td></tr><tr><td>クロザピン-N-オキシド</td><td>R&D Systems</td><td>4936-10</td><td>デザイナードラッグ</td></tr><tr><td>ラットケージ蓋(ポリカーボネート)</td><td>代替デザイン&nbsp;</td><td>FT 8XL-PC</td><td>動物のケージを覆うために使用されます 注入後</td></tr><tr><td>濾紙 (交換)</td> <td>代替デザイン</td><td>FP-R-1018XAD</td><td>ケージの蓋と一緒に行く濾紙</td></tr><tr><td>テーブルトップバイス</td><td>JETS</td><td>2201-265</td><td>フードにAAVを含むマイクロ遠心チューブを保持するため</td></tr><tr><td>バイオハザードゴミ袋</td><td>ステープル</td>ズ <td>113444</td><td>メドラインバイオハザードライナー</td></tr><tr><td>バイオハザードゴミ箱</td><td></td><td></td> Amazon.com <td>United Solutions 34ガロン長方形車輪付きゴミ箱、フックとロックハンドル付き</td></tr>イ<tr><td>ソフルラン、100 ml</td><td>Patterson Veterinary Supply Inc.</td><td>07-890-8540</td><td>麻酔</td></tr><tr><td>デジタル表示読み出しコンソール付きデュアル小動物定位固定装置</td><td>デビッド・コップフ</td><td>モデル942</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>非破裂耳バー、2本セット(ラット)</td><td>デビッド・コップフ</td><td>モデル955</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>麻酔マスク(ラット)</td><td>デビッド・コップ</td>フ<td>・モデル906</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>高速定位固定装置用ドリルには、テーブルトップモーターコントローラー、フットペダル、ハンドピース、定位固定装置用ハンドピースホルダーが含まれます</td><td>デビッド・コップフ</td><td>モデル1474</td><td>手術機器</td></tr><tr><td>マイクロドリルバリ、0.9mm</td><td>ファインサイエンスツールズ</td><td>19007-09</td><td>外科用供給</td></tr><tr><td>マイクロ4コントローラー付き自動シリンジポンプ</td><td>デビッド・コップ</td>フ <td>モデルUMP3-1</td><td>手術機器</td></tr><tr><td>プロアニマル取り外し可能なセラミックブレードクリッパーキット</td><td>Ahdis</td><td>21420</td><td>外科用サプライ</td></tr><tr><td>ベタジンスキンクレンザー</td><td>パーデュープロダクツ L.P</td><td>67618-149-04</td><td>サージカルサプライ</td></tr><tr><td>トリプル アンチバイオティクス軟膏</td><td>Medline サプライ</td><td>53329-087-01</td><td>サージカルサプライ</td></tr><tr><td>Puralube 獣医用軟膏</td><td>のみ 獣医サプライ</td><td>17033-211-38</td><td>サージカルサプライ</td></tr><tr><td>Dino-lite</td><td>顕微鏡</td><td>AD7013MTL</td><td>従来の分切スコープの代替品</td></tr><tr><td>Dino-lite 硬質卓上ブームスタンド</td><td>顕微鏡</td><td>MS36B</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>28 G 10 &mu;l シリンジ</td><td>ハミルトン</td><td>80308-701SN</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>超背の高い MDF 音響減衰キュービクル</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-018MD</td><td>22' W x 22" H x 16" D</td></tr><tr><td>Extra tall modular test chamber</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-007</td><td>行動機器</td></tr><tr><td>ステンレス鋼グリッドフロア</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-005</td><td>行動機器</td></tr><tr><td>ハウスライト</td><td>メッド・アソシエイツ社</td><td>ENV-215M</td><td>ハウスライト・刺激ライトとして使用</td></tr><tr><td>モジュール式ペレットディスペンサー</td><td>メッド・アソシエイツ社</td><td>ENV-203M-45</td><td>行動機器</td></tr><tr><td>ペレット容器・カップ型</td><td>メッド・アソシエイツ社</td><td>ENV-200R1M</td><td>行動機器</td></tr><tr><td>ラット用ヘッドエントリー検出器</td><td>メッド・アソシエイツ社</td><td>ENV-254-CB</td><td>行動機器</td></tr><tr><td>ダストレス精密食品ペレット、45mg</td><td>Bio-Serv</td><td>F0165</td><td>ラット</td></tr><tr><td>チャンバー用行動供給ケージスピーカー</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-224AM</td><td>行動機器</td></tr><tr><td>プログラマブルオーディオジェネレーター</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ANL-926</td><td>行動機器</td></tr><tr><td>スマートctrl 8入力/16出力パッケージ</td><td>Med Associates, Inc</td><td>DIG-716P2</td><td>行動機器</td></tr><tr><td>大型卓上キャビネットと電源</td><td>Med Associates, Inc</td><td>SG-6510D</td><td>行動機器</td></tr><tr><td>PCIインターフェースパッケージ</td><td>Med Associates, Inc</td><td>DIG-700P2-R2</td><td>行動機器</td></tr><tr><td>MED Intel Core computer pkg with X Pro 19インチモニター</td><td>Med Associates, Inc</td><td>COM-103V</td><td>行動機器</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド (grannular), 1 kg</td><td>Electron Microsopy科学</td><td>19210</td><td>ハザード:発がん性物質、フード内の重量を量</td></tr>る <tr><td>ウサギモノクローナル抗体(HA-Tag)</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>3724S</td><td>組織学試薬</td></tr><tr><td>XP ウサギモノクローナル抗体(GFP)</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>2956S</td><td>組織学試薬</td></tr><tr><td>抗ウサギIgG</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>4412S</td><td>組織学用品</td></tr><tr><td>スーパーフロストプラススライド</td><td>VWRインターナショナル</td><td>483111-703</td><td>組織学用品</td></tr></tbody></table>

学習の離散段階中げっ歯類におけるリモートサイレン神経活動のための方法

A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning

このプロトコルは、動物は、学習および記憶の作業に従事している間、一時的にリモート離散の脳領域での神経活動を沈黙させる方法について説明します。アプローチは、学習の異なる形態を区別するように設計されている行動パラダイム（感覚プリコンディショニング）と（デザイナー·受容体 - 排他的活性化·バイ·デザイナードラッグ）薬理遺伝学を組み合わせたものです。具体的には、ウイルス媒介送達は、齧歯類において脳の離散領域内に遺伝的に改変された抑制性Gタンパク質共役受容体（デザイナレセプター）を発現するために使用されます。デザイナーの受容体の発現レベルが高い場合3週間後、薬剤（デザイナー薬物）は、特定の行動の前のセッションに全身30分に投与されます。薬剤は、設計受容体に対する親和性を有し、したがって、設計者受容体を発現するニューロンの阻害をもたらすが、それ以外の生物学的に不活性です。脳の領域はdepen（2-5時間に沈黙のまま鼎）用量および投与経路に。行動パラダイムが完了すると、脳組織が正しい配置と受容体の発現のために評価されます。このアプローチは、動作の特定のコンポーネントに個々の脳領域の寄与を決定するために特に有用であり、行動パラダイムの任意の数の間で使用することができます。

行動結果実験終了時には、地域固有の一時不活性化の有効性を定量的および定性的に評価されるべきです。本実施例では、3相の行動パラダイム（感覚プレコンディショニング）を含み、ここでは、CNO RSC中性刺激12間の結合の形成に必要であるという仮説を試験するためにプレコンディショニングセッション中RSCで神経活動を減衰させるために投与されました。重要なことに、実験者は、行動パラダイムまたは薬理遺伝学的アプローチは、ほとんどの行動パラダイムと結合することができるように、本明細書に記載の実験デザインに限定されるものではありません。 分析は、通常、前処理セッション（フェーズ1）の間に生成されたデータに対して実行されていないのに対し、それはラットはコンディショニングセッション（フェーズ2）の間の光食品関連を学んだかどうかを定量化することが重要です。 Fiの中で示されるようにグレの3A、実験（EXPT）とコントロール（Ctrlキー）の両方のラットは、ラットは、視覚刺激（光）と食品の報酬との間にパ...

このプロトコルは、ラットが学習と記憶の課題に従事している間に、離散的な脳領域でのニューロン活動を一時的および遠隔的に沈黙させる方法を説明しています。このアプローチは、薬理遺伝学(Designer-Receptors-Exclusively-Activate-by-Designer-Drugs)と、学習のさまざまな要素を区別するように設計された行動パラダイム(感覚プレコンディショニング)を組み合わせたものです。

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while animals are engaged in learning and ...

この手順の目的は、動物が学習および記憶タスクに従事している間に、脳の特定の領域におけるニューロン活動を一時的かつ遠隔的に抑制することである。これは、まずデザイナー受容体とレポーターを含む a a V を注入用シリンジに充填することで達成される。次のステップは、ラット脳の標的領域に a a V を注入することである。次に、生物学的に不活性なデザイナー薬であるクロザピンおよびその酸化物を調製し、ラットに全身投与します。最終ステップとして、感覚前条件付けパラダイムを用いて行動試験を実施します。最終的に、ラットの脳組織に対して免疫蛍光顕微鏡観察を行い、デザイナー受容体の配置を確認します。この手法は、モチベーション、注意、学習および記憶の調節を含むがこれらに限定されない、行動神経科学分野における主要な疑問を解決するのに役立ちます。アデノ随伴ウイルスを扱う際は、常に機関のすべての予防策に従ってください。このビデオで使用されているウイルスは、バイオセーフティレベル1の化合物に分類されています。10%漂白剤溶液を準備します。AV廃棄物を除染するために、漂白剤溶液を入れたビーカーと滅菌済みの10 µLシリンジを用意してください。ワークスペースにて、a Vの分注液が入ったマイクロ遠心チューブを標準的なベンチバイスに固定します。10 µLシリンジに、少なくとも4 µLのa A vを充填します。4 µLのa a v溶液の中に気泡が入っていないことを確認してください。使用後、空になったウイルスチューブは10%漂白剤の入ったビーカーに廃棄してください。廃棄容器にさらに10%の漂白剤を加え、30分間放置した後、施設のガイドラインに従って除染済みの液体廃棄物を廃棄します。定位固定装置の下および、ウイルス操作専用エリアとして指定した隣接スペースに吸収性ベンチペーパーを敷き、手術エリアを準備します。麻酔導入後、3%isof、フッ素、および酸素を毎分1Lの流量で投与しました。両眼の間から耳の少し後ろまで、被毛を剃毛します。剃毛後、ラットを定位固定装置に固定した状態で、誘導チャンバー内に3分間戻します。眼軟膏で目を保護し、ベタディンで洗浄して切開部位を準備します。眼から約2 mm尾側から開始し、頭蓋骨上の皮膚に2.4 cmの中線切開を加えた後、皮膚を牽引して頭蓋骨を露出し、bregmaとlambdaが明確に見えるまで頭蓋骨から膜組織を除去します。頭蓋骨が水平であることを確認した後、ドリルをbregmaに配置して座標をゼロに設定し、次にドリルを目的の内側、外側、および前後座標に移動させます。0.9、0.7、または0.5 mmのドリルビットを使用して孔を開けます。輸液ポンプを、ウイルスを 0.2 µL/min の速度で注入するように設定します。シリンジを脳定位固定装置の注入アームに装着し、目的の座標までシリンジを下げます。ウイルスの注入が完了した後、ポンプを使用して所定量のウイルスを注入します。針の経路を伝わって逆流するのを防ぐため、シリンジを10分間そのまま保持し、その後、毎分約5 mmの速度でゆっくりとシリンジを引き上げます。次に、次の座標に移動し、すべての座標に投与が完了するまでこの手順を繰り返します。承認されたプロトコルに従って創傷を閉鎖し、術後の鎮痛処置を行った後、ラットを敷材、蓋、および適切な表示のある清潔なケージに入れます。ラットの麻酔から完全に回復した後、飼育室に戻します。デザイナー受容体が十分に発現するように、行動試験を開始するまで3週間以上の期間を設けてください。この図は、感覚プレコンディショニング・パラダイムの3つのフェーズである、プレコンディショニング相、コンディショニング相、およびテスト相を示しています。デザイナー薬物であるクロザピン-N-オキシド（CNO）は、設計された受容体を活性化させることで神経活動を抑制するために使用されます。CNOは、テストのどの段階の前でも投与可能です。本手順では、各プレコンディショニングセッションの30分前にCNOを投与します。プロトコルの記述部分の指示に従って、1 mg/mLの新鮮なクロザピン-N-オキシド溶液を調製し、行動テストの30分前にCNOを1 mg/kgの用量で腹腔内投与してください。適切な行動セッションのコンピュータコードを起動します。30分が経過した後、ラットを試験チャンバーに入れ、聴覚刺激と視覚刺激の提示からなる12回の混合試行を行い、4回行われる64分間のプレコンディショニングセッションの1回目を開始します。6回の試行では、プレコンディショニング刺激であるトーンを10秒間提示し、残りの6回の試行では、直後に5秒間フラッシングライト刺激を提示します。白色雑音（非提示刺激のみ）を10秒間提示します。プレコンディショニング相の完了後、5日間連続で実施するコンディショニングセッションを開始します。ラットに対し、5秒間の視覚刺激（点滅光）の提示直後に2個の45 milligramのフードペレットを与えるという試行を8回行います。コンディショニングセッションの完了後、7分間の試行間インターバルを設けます。単回78分のテストセッションを行い、聴覚刺激のみを提示する12回の混合試行をラットに提示します。そのうち6回の試行では。トーン刺激（前条件刺激）のみを10秒間提示します。残りの6回の試行では、ホワイトノイズ（非対刺激）のみを10秒間提示します。行動タスクの完了後、直ちにラットをチャンバーから出し、飼育施設に戻します。プロトコルの記述部分にある詳細な手順に従って、コンディショニング相およびテスト相のデータを分析します。タグ付きレポーターまたはレポータータンパク質に対する免疫組織化学染色を行った後、顕微鏡で染色切片を観察し、デザイナー受容体および／またはレポーターの局在と発現が期待通りであるかを確認します。対照群および実験群のラットは同様に、コンディショニングセッション中に点滅光刺激と食物の間のパブロフ連想を学習しました。セッションにおいて、両群とも条件付けセッション中に食餌報酬を得ようとする動機が見られました。対照的に、重要なテストセッションでは、実験群のラットは事前条件付けされた聴覚刺激と提示されていない聴覚刺激を識別できませんでしたが、対照群のラットは事前条件付け刺激の提示に対して、より顕著なフードカップ行動を示しました。したがって、実験群ではなく対照群のラットにのみ、感覚事前条件付け効果が認められました。この画像は、げっ歯類の脳における関心領域へのウイルス注入部位の組織学的検証を示しています。この技術の開発により、神経科学分野の研究者が、複雑な行動に対する特定の脳領域または細胞種の寄与をin vivoで探索することが可能になりました。

a-method-for-remotely-silencing-neural-activity-rodents-during

Research

JoVE Journal

Behavior

行動

本稿では、同時に複数の認知行動をテストし、げっ歯類のために神経活動を記録することができる完全に自動化された汎用性の高いシステムを提案する。...

マルチ認知機能のテストとげっ歯類の神経活動を記録するための完全に自動化された汎用性の高いシステム

麻酔をかけた新生児の子犬を温熱パッドの上に置きます。頭皮をエタノールで消毒します。薬物活性化阻害受容体の遺伝子を保有するアデノ随伴ウイルスを含むウイルス溶液と追跡色素を注射器に充填します。注射器の先端を子犬の頭に合わせ、ウイルスをゆっくりと脳に注入して均一に分布させます。子犬が回復するのを待ちます。インキュベーション中、ウイルス粒子はニューロンに入り、その遺伝物質を核に放出します。それは神経細胞膜上の抑制性受容体の発現につながります。これらの受容体はイオンチャネルと結合しますが、活性化されるまでニューロンのシグナル伝達に影響を与えません。次に、数日かけて子犬の首に標的薬を皮下投与します。この薬は血液脳関門を通過し、抑制性受容体に結合します。これにより化学遺伝学的反応が引き起こされ、神経膜を横切るイオンの流れが変化し、ニューロンのシグナル伝達が沈黙します。この化学遺伝学的サイレンシングは、脳障害をモデル化し、異常な脳活動の研究に役立ちます。...

新生マウスにおけるニューロン活動の化学遺伝学的サイレンシング

出典: Lai, J., et al. げっ歯類脳における電気生理学的記録と抑制剤のマイクロインジェクションの同時投与J. Vis.

ラットにおける神経活動の阻害とその電気生理学を用いた検出

げっ歯類オペラントコンディショナー完全に自動化されたプロトコルが提案されている。プロトコルは、感覚運動統合と認知対照実験の基礎となる、この制御に影響を与える神経活動への広がりを調査するために、行動のイベントの正確な時間的制御に依存しています。...

感覚統合と認知制御実験のための完全に自動化されたげっ歯類エアコンプロトコル

新しい刺激応答の関連付けを学ぶことは、最終的には個々のニューロンのスパイク出力を変えるに反映されている神経プロセスを幅広く行っています。ここでは、動物は、取得し消火し、単一の実験セッション内で条件反応を再取得しながら、単一ニューロン活動の継続的な登録を可能にする行動のプロトコルを記述します。...

自由に学習の三つの段階を越えハトを移動する単一ニューロン」の活動電位を記録する

ここでは、薬物のマイクロインジェクションによる脳深部構造の阻害と、同時の電気生理学的記録によるその影響のリアルタイムモニタリングという2つの機能を備えたガラスピペットを作ります。...

同時電気生理学的記録およびげっ歯類の脳における阻害剤のマイクロ注射

シャトルボックス回避学習、行動神経科学においてよく確立されています。このプロトコルは、げっ歯類での学習シャトルボックスは、サイト固有の電気皮質内微小刺激（ICMS）と学習と知覚の複数の側面を研究するためのツールとして、in vivoでの録音での同時慢性と組み合わせることができる方法について説明します。...

知覚と学習を研究するためのツールと​​しての電気生理学的皮質の記録と刺激と組み合わせたシャトル・ボックストレーニング

迷走神経刺激（VNS）は、行動の範囲を変更するには、前脳にターゲットを絞ったシナプス可塑性を誘導するためのツールと​​して浮上しています。このプロトコルは、恐怖の絶滅メモリの統合を容易にするためにVNSを実装する方法について説明します。...

ツールとしての迷走神経刺激は、絶滅の学習のための関連経路の可塑性を誘導するために

覚醒マウスにおいて、細胞外神経活動を同時に記録し、記録部位付近で複数の神経活性物質を放出する電極の構築方法を提示します。この技術により、目的のニューロンへの推定される局所シナプス入力の詳細な分析が可能になります。...

覚醒マウスにおける神経活性物質のMicroiontophoreticアプリケーションと組み合わせることで神経活動の細胞外記録

アウェイク行動マウスにおける慢性神経録音のためにマイクロドライブアレイの構築

学ぶ 薬理遺伝学的手法を用いてラットの特定脳領域の神経活動を一時的にサイレンスし、感覚前条件付けパラダイムによる学習・記憶課題への影響を解析する方法です。

学習の離散段階中げっ歯類におけるリモートサイレン神経活動のための方法

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