Name: 茸乳頭の客観的な分析のためのデンバー乳頭プロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: 学ぶデンバー乳頭プロトコルを用いた茸乳頭の客観的定量法。青色染色と二分鍵を活用し、観察者間のばらつきを減らし、味覚研究における信頼性の高い密度測定を実現します。

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この作品は、国立衛生研究所と研究資源のための国立センターから2008年から2012年の間に科学教育パートナーシップ賞（SEPA）R25 RR025066によって部分的に資金を供給されました。ジョン·ヘイズ、スーコールドウェル、ポール·ブレスリン、カーラ·シューベルト：様々な実験室でのシナリオでDPPの使用に関する文献、我々の結果とフィードバックの思慮深い議論の味フィールド内の同僚に感謝します。自然と科学のデンバー美術館でのリーダーシップと遠征健康内の味覚ラボの遺伝学内の市民科学をサポートするスタッフにもありがとうございました。ベアアラゴン、マイク·アーチャー、蘇アタマン、マイケル·バグリー、A&#39;netteベルトラン、ダイアナBoyles、ウェンディ隠密、サーシャドゥーリー：最後に、など、このプロトコルを開発し、使用して自分の時間と献身のために私たちのボランティア市民科学者のすべてにありがとうございました、パティドゥリーバー、ジェシカERN、ローラHarmacek、ショーン·ヒバート、ジョイスHutchens、マット·チュ、Letaキーン、ウィレムLeenhouts、ステファニ呂kjan、アシュリー·マシューズ、マイク·モーゼル、ステファニー·ミラー、ハリーモルガン·ロドリゲス、グリフィンScherma、アリッサSchickedanz、テリー·サイモン、ディラントーマス、ルディ·トーレス、タイラー·ウィルソン、ダイアンWoltkamp。

本研究で得点の画像が自然と科学（博物館）10のデンバー美術館で味ラボの遺伝学で行わ大きな味覚研究の一環として収集しました。より大規模な研究の被験者は、18から93歳の範囲の博物館の訪問者（N = 1195）でした。被験者は7大陸の6から​​来ているが、参加者は主にヨーロッパ系のものでした。各被験者のデータは、1つの30分ラボセッション中に収集しました。西治験審査委員会は、プロトコル、書面によるインフォームドコンセントを与えたが承認され、被験者は自分の時間をボランティアとして参加し、研究への参加のために補償されませんでした。 1.データ収集<ol><li>画像キャプチャ<ol><li>ショーは自分自身をポーズする方法の写真（ 図1）とどのような撮影された画像は次のようになりますを施します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52860/52860fig1.jpg" /> 図1：イメージキャプチャポーズ。 </strオング&gt;これは正しく、その舌の写真のポーズをとるために、GOTラボの被験者に示した写真です。 </li><li>直接の対象は、紙ハンドタオルで自分の舌を乾燥し、彼らの口から突出した舌を残します。 </li><li> 1インチの先端で滅菌、レーヨンアプリケーターを用いて舌の先端に1：36濃度の青色食用色素の約3ミリリットルを適用します。被験者が自分の口に舌を返し、過剰な染料を除去するために飲み込む必要があります。 </li><li> 図1に示すように、被験者は安定性のためにテーブルの上に支え手と肘に自分のあごに、自分自身を提起しています。直接の対象は、その舌に快適な距離を延長し、自分の歯の間に静かに固定します。 </li><li>正中線の隣に舌の左側の前方の先端にパンチで直径10mmの円形の切り抜きを有する濾紙2.5センチ片を接着（ 図1参照）。 </li><li>舌の少なくとも三つのクローズアップ画像を撮影、CAその領域内のすべてのFPの可視化を確実にするために全体の10ミリメートルの円形の切り欠きをpturing。安定性のための三脚に取り付けられた高品質のデジタルポイントと撮影カメラのマクロ設定を使用します。 <ol><li>スチルカメラの推奨ズーム範囲内ながら全体の切り欠きが撮影される程度に拡大します。カメラレンズの面は舌の平面に平行であることを確認し、切り欠きは長円形の代わりに写真に円形に表示されていること。彼らは、高品質とカウントするのに有用であることを確認するために写真を確認します。 </li></ol></li></ol></li><li>画像選択と準備<ol><li>コンピュータに写真をアップロードします。 </li><li>舌が広く、カメラに向かって平らになるように、同じ被験者の舌の撮影した画像のうち、最高のズーム、少なくとも歪んだ角度で舌の上での構造体との間に明確な定義に基づいて、さらなる分析のために1つだけ選択。 </li><li>オープンソースで選択されたRAW画像を開きますので、ftware、ImageJの。 「プラグイン」をクリックし、ドロップダウンメニューのスクロールで「分析」とクリックし、「セルカウンターを。」セルカウンタが表示されたら、セルカウンタに画像をリンクするために、「初期化」をクリックします。 注：ここでは、32ビットJava 1.6.0_10バージョンでのImageJ 1.45秒を使用します。 <ol><li>得点の間とFPを獲得する後続のステップで使用するための一貫性を保つために、50％の標準的な倍率を使用してください。次のセルカウンタに画面の左側にこの画像を移動します。この画像は、（ 図2、画面の左側を参照）にコピーAと呼ぶことにします。 </li></ol></li></ol></li><li>定量化された乳頭の直径を測定するためのRAW画像（コピーB）の第2のコピーを開きます。スコアリングプロセスを通じて、個々の得点王の好みに必要に応じて、ズームイン、ズームアウト。 2つのコピーが誤って混乱していないので、画面の右側に、このコピーを移動します。 （ 図2の右側を参照してください。スクリーン） </li><li>ラインツールをクリックします。正確にどのような角度でろ紙の10ミリメートル内側の円全体の直径を描画し、クリックして &quot;分析&quot;とする限り、必要に応じてにコピーB、ズームを使用した「スケールを設定します。 &quot;&quot;既知の距離」を記入すると、「10であることが「規模が代替角度を測定することにより、正しいことを確認し、直径範囲は9.8〜10.2ミリメートルの間であることを確認してください。そうでない場合は、このステップを繰り返します。 </li></ol><img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52860/52860fig2.jpg" /> 図2：コピーA及びコピーBのコピーA（左）は、細胞カウンターウィンドウにリンクされ、コピーB（右）は、個々の好みにズームすることができるがスコアラするスコアラーからの一貫性のために50％の倍率で残ります。 デンバー乳頭プロトコル二値キーを使用して2得点FP <ol><li>各候補papil用ラは、それがFPであるかどうかを判断するための基準の詳細を、次の二分のキー（ステップ2.2から2.5）を使用します。 FPとして分類されている乳頭の視覚のために、プロセスの各ステップで拒否されているもののために、図3を参照してください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52860/52860fig3.jpg" /> 図3：拒否された乳頭対FP。図3aは、図3b-3Eは、各ルールに違反する領域を円で囲んているが、いくつかの予選FPと舌です。 （ 図3b）の領域は非晶質です。 （ 図3c）乳頭は小さすぎます。 3D）乳頭がそれを取り巻くものに比べて青、（3E）乳頭陥凹は、その周囲と比較されます。 </li><li>シェイプ<ol><li>候補乳頭が（不定形）非晶質であるかどうかを確認します。一般的に認識された幾何学的形状（楕円形、立方形、円形）がある場合は50％ズームで表示されます。 </li><li>幾何学的形状は、（ 図3aを参照）が存在する場合、2.3のステップに移動します。 </li><li> THER場合eは、コピーA（50％のズーム）には幾何学的な形状ではありません（ 図3bを参照）、セルカウンタ·ウィンドウに移動し、クリックして「タイプ1」、FPアモルファスではなく、としてそれをマークするために候補乳頭をクリックします。この以降のタイプ1-4をクリックすると、得点は、彼らがすべての候補乳頭に対処し、ステップ2.7.2で議論に役立つ構造を拒否したときに違反したルール分類しているかを知ることができます。 </li></ol></li><li>色<ol><li> 50％でズームをコピーして、舌の表面上の任意の色の区別があるかどうかを判断するために参照してください。その場合は、次の2.3.2に進みます。そうでない場合、決定要因としての色を使用しないでください。 2.4のステップに移動します。 </li><li>候補乳頭が（ 図3aを参照）、それを周囲の組織または乳頭よりも軽量であるかどうかを確認します。候補乳頭のいずれかの部分がピンク色のままで、または軽く染色した場合、2.4のステップに移動します。 </li><li>候補乳頭は青であり、周囲の乳頭がある場合（ 図3cを参照してください）ライター、セルカウンタ·ウィンドウに移動し、セルカウンタの「タイプ2」をクリックします。コピーAでは、としてあまりにも青ではなく、FPをマークするために候補者をクリックします。 </li></ol></li><li>サイズ<ol><li>コピーBを使用して、一方が快適に候補乳頭の概要を見ることができる距離にズームイン。 </li><li>ラインツールをクリックし、候補乳頭の最長寸法を横切って測定します。 「分析」してから「測定」を測定長さが0.5mm以上である場合（ 図3aを参照）、2.5のステップに移動]をクリックします。 </li><li>測定された長さは、0.499ミリメートル以下である場合は、正確さを保証するためにもう一度測定します。それは（のF igureの3Dを参照）はまだ0.499ミリメートル以下であれば、セルカウンタウィンドウで、コピーAの「タイプ3」をクリックして、小さすぎではなく、FPとしてそれをマークするために候補乳頭をクリックします。 </li></ol></li><li>不況<ol><li>候補乳頭が均一であるかどうかを判定し、コピーAを使用して、評価する彼舌または上昇の残りの部分とIGHT。乳頭が裂け目にある場合は、隙間なく、舌の表面で他の構造に比べてその高さを決定します。乳頭が（ 図3Eを参照してください）それを囲む乳頭よりも低い場合、「タイプ4」を使用し、コピーAの、FP凹んだとしてそれをマークするために候補乳頭をクリックしません。 </li><li>候補乳頭は舌の残りの部分と均一な高さのいずれかであるか（ 図3a参照 ）上昇した場合は、使用する&quot;タイプ5&quot;は、それをクリックして、これがFPであることをマークします。このタイプ5の合計は、生のFPスコアです。 ImageJのコピーAの種類1-5から細胞カウンターで得点も色付マークを保存しないように、この時点でコピーを閉じないでください</li></ol></li><li>コピーAの保存<ol><li>ノートブック生FPスコアに書き留めておきます。 </li><li>セルカウンタウィンドウで、「イメージのエクスポート」をクリックします。ラボの所望のネーミングシステムに保存します。これは警官の開放を可能にします将来的にはY Aはタイプ1〜5の色付マークを保持します。これは、生のFPのスコアは保存されません。 </li></ol></li><li>品質管理<ol><li> 2個々の得点によって、それぞれの写真をスコアと7を比較します。 </li><li>高いFP生のスコアが低いFP生スコアの10％以内で​​あれば、コンセンサスFPスコアのために一緒に2つのスコアを平均します。 2 FP生のスコアが10％を超えて異なる場合は、画面上に両方の得点の写真を引き出します。 <ol><li>最終的なコンセンサススコアに矛盾の説明を補助し、与えるためにカウンタタイプ1-4を使用してください。コンセンサスが議論の中に到達できない場合は、スコアリングから休憩を取ります。後の時点で、画像を再採点し、議論します。まだ合意に達することができない場合は、第三の得点王に引き出します。他の二つの画像との対話を獲得するためにそれらを確認して下さい。 </li></ol></li></ol></li></ol> 3.トレーニングの得点DPPを使用します<ol><li>トレーニングの背景<ol><li> 2得点した画像の様々なカウント、個別に得点し、同じ基準を使用していたことを確認するために定期的に付与します。個々の数が得点、各画像の一貫互いに10％以内で​​あった場合にのみ（上記確定）の方法は、許容できると考えられ、DPPと命名しました。 </li><li>得点の順に（補足は2-17図 ）15公式の画像と15のトレーニング画像を選択してください。画像を選択中に数え切れないほどあるとみなされた場合は、画像をスキップして、次の連続画像を選択します。 注意：ラボが正しい写真撮影のテクニックをマスターしている間、彼らが選択したように、これらの画像は、高品質とサイズが異なります。選択された画像の一つは、このプライマリカウント処理を介して不可算と思われたが、得点が必要なときに電話をかけることができたことを確認するために、中に放置しました。したがって、唯一の15は、画像を記録したものの、研修生に与えられた16の画像があります。 </li><li> DPPを使用して、上記の得点は15トレーニング画像をカウントし、コンセンサスを作成しましたそれぞれに得点。 </li><li>研修生15公式イメージを与え、ベースラインを作成するために、ミラー＆リーディを使用して得点をお願いします。レコードのスコア。ステップ3.2に従った集合研修を実施しています。ステップ3.2が完了した後は、得点は再び15公式画像をスコアし、そのスコアを記録しています。 </li></ol></li><li> DPP上で後続の得点を訓練<ol><li>トレーニング得点に最初のトレーニング画像を与え、この画像には、いくつかの乳頭のためのDPPを示しています。 FPとして各乳頭を選択するか、拒否するための推論を話し合います。研修生は、その写真の残りのためのスコアリングを実施する継続し、コンセンサス番号を付与する（GOT Labのコンセンサス番号と1-5マーカーを入力し、補足図1を参照）することができます。この写真をDPPの理解を確実にするために関係なく、10％の矛盾を説明します。 </li><li>その後の得点を第2のトレーニング画像を与え、彼らはDPPを使ったスコアがあります。 </li><li>研修生生FPのスコアが10以内である場合確立されたコンセンサスの割合は、セクション3.1.3から数え研修生は、次の画像に移動し、手順を繰り返しすることができます。 </li><li>スコアが10％の範囲外にある場合は、理解し、矛盾を識別し、DPPの矛盾理解に対処するためのタイプ1-5を表す研修生の着色されたマークを使用しています。 </li><li>研修生に画像を再採点し、もう一度新しいスコアを確認する機会を与えます。成功した場合、すべての画像が完了するまで、研修生は、次の画像に移動します。 </li></ol></li></ol>

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著者は、彼らが競合する金融利害関係がないことを宣言します。

DPPを使用して、画像内の分散は、独立した得点を横切ってカウントし、内·スコアラーの数は有意に減少しました。この方法は以下の主観ビデオ顕微鏡なし視覚FP濃度解析を行うが、それはこの方法が唯一のスコアFPことに留意すべきです。 DPPはFPとして分類構造は味孔を有しており、従って味覚乳頭であることを保証することはできませんもカウントは、この方法の選択図の性質は、それが一貫性と精度を介して信頼性を確立することである本物の味蕾密度20,23の反射であること。しかし、一貫性のある方向の結果にバイアスをかけることができます。 、より厳密にFPの形態を特徴づけると二分キーを作成することで、このstudy.Howeverの範囲を超えて延長する味蕾密度（ 例えば 、ビデオ顕微鏡）の真の測定値を使用して、他の方法に対する精度をテストするには、この方法は、アドレス·ミラー＆ FPのより特徴づけ、そのフィールドにリーディの充電その形態及び定量2のコンセンサスを得るために行われる必要があります。さらに、彼らはこの特徴付けは、「被験者間の違いのいくつかを明確にし、研究者の間で2異なる結果のいくつかを説明しています。」かもしれないことを示した味とnutrition-におけるFPの役割に矛盾の多くの定量化の統一された方法を提供することにより、関連の研究は、整流されてもよいです。 二分キーは異なる画像キャプチャ技術のために調整されてもよいです。測定スケールのための既知の距離を簡単にサランラップやガラスは、画像キャプチャの舌の上に置かれた場合に割引することができ、各研究室と不況で使用される直径に設定することができます。 GOTラボでは、中性舌が乳頭の最良の定義ことが明らかになりました。これは、ロバをしたまぶしさを作成し、バックカメラに光を反射するようにサランラップやガラスの原因となった研究室での光の量にすることができますsment難しいです。いくつかの研究室では、彼らは、染料より挑戦カウントするように見つけると述べているが、GOTラボは舌の大部分の茸と糸状乳頭の間の理想的なコントラストを提供1:36の濃度に希釈した青色食用色素を発見しました。 FPの特性のための二分の鍵の作成は、一貫して舌の上の構造を分析し、その結果の報告に自信を持つように、画像取り込み、様々な方法を使用して、別の研究室の研究者を可能にします。最後に、二分のキーの使用は、構造体またはオブジェクトの品質が研究に研究から一貫性のない番号を提供している科学的方法論の他の分野での目的を有していてもよいです。

乳頭は舌の表面上に見えるのバンプです。茸（FP）、葉状、城壁で囲まれた、および糸状：乳頭の4つのタイプがあります。糸状乳頭は舌の表面に広がっているが、城壁で囲まれただけ舌の裏側に局在している、と葉状は側面にあります。これとは対照的に、FPは、舌の前方に向けて配置されています。彼らは糸状がいない間の味覚芽を含んでいる可能性を持っているので、FP、葉状および有郭乳頭は、味覚と考えられています。味蕾は、化学の味物質​​を検出し、脳内の味覚信号に刺激を伝達を担う細胞のクラスターです。唾液と食べ物の分子は、味分子はその後、味覚細胞を活性化する可能性を持っている味の孔と呼ばれる開口部を介して味蕾に入ります。 最初の舌の組織学的研究で観察されたように興味深いことに、味蕾密度に大きな個人差があり、18死体（ミラー、1988）から1。芽自体を味わう生活でビデオ顕微鏡を使用して、味の孔と茸状乳頭を識別するための方法を開発するためにミラー＆リーディ（1990）を導いた適切な倍率、照明、染色技術を使用している場合しかし、味孔が表示され、舌の表面に表示されていません人間2。ラボの数は依然として写真とほとんど、あるいはまったくの倍率を使用して、元のビデオ顕微鏡法を変更しました。茸状乳頭は、より視覚化がはるかに容易になりますので、これらの後者の技術を使用して孔があり、ラボは味孔の代わりに、茸状乳頭をカウントになりました。そうすることで、それは茸状乳頭密度は、多くの茸状乳頭味の孔を含んでいるか、芽3を味わっていないにもかかわらず、味細孔密度のための合理的な代理指標であるとします。城壁で囲まれたと葉状乳頭よりFPより可視およびアクセス可能であるが、それらの画像取り込みが少ないTIだけでなく私は、ビデオ顕微鏡2,4の別の方法を介して味細孔分析よりも消費します。 1990年に、ミラー＆リーディは気孔密度はさらに、この解剖学的関係に加えてBartoshuk ら 5に裏付けされたFPの密度3と相関すること味を見つけるために、この技術を使用し、ミラー＆リーディも発見した上位8人味孔密度分布も評価ショ糖、塩化ナトリウム、及びプロピル（PROP）の半分の大幅より強い他の8人3がやったよりも。 Bartoshuk らによるその後の研究（1994）は42被験者5に、閾値上PROPの味強度と茸状乳頭密度、ならびに味孔密度との相関関係を観察しました。この便利な方法は、その舌の多くの乳頭を有する対象は、苦味物質のフェニルチオカルバミドを含む多くの味物質に強い反応を誘発することを報告して影響力の研究につながった（PTC）とPROP 6,7。 PTCとPROPは、しばしば人の味覚感度の表現型とそれらの遺伝子型との間に明確なリンクのために使用されるよく研究味物質です。集団研究は、遺伝子のホモ接合劣性ディプロを持っている人、TAS2R38は、遺伝子8-10の支配またはヘテロ変異体のキャリアよりもPROPする有意に低い感度を有することが示されています。この遺伝現象は最初のアーサー·L·フォックスは、PTC 11に「味失明」の発見を発表した1932年に報告されました。これらの苦味化合物を味わうことができる人々の間で、味の強度は耐え難いほど苦い6に少し不快からどこにでも変えることができると報告しました。 TAS2R38では説明できない分散を説明するために、理論は、それが舌の4にFPの密度に起因することができることを出すました。 味の研究が進むにつれて、金融商品取引法dはFPと苦味感受性の役割に関するこの理論の周りに2つの考え方に分割しました。多くの研究は、FPの密度がPROPの要因は、4,6,12,13の感度であることを、元の主張を裏付けているが、ロール10を複製することができないことを報告し、証拠はそれに反論することが判明している小さな、しかし重要な不測の事態がありました、 14,15,16。 Delwiche ら 。 （2001）の傾向が非常に可変であることを警告しました。 FP密度は被験者全体の苦味感受性の違いを一様ではないアカウントを行い、7を PROPするには、少なくとも中程度の感度を有する被験者についてのみ実証しました。 FPを定量化する方法についてはあまり厳密に定義されたミラー·リーディ方法の使用に加えて、フィッシャーによって行わビーバーダムの子孫研究15を除いて、 ら 。、上記の研究のほとんどは小さなサンプルがあったことに留意することが重要ですまた、上の矛盾の発見に寄与することができるサイズ味はFPの役割。 糸状乳頭は、色素を吸収して青色にしながら、FPはピンクのままであるため簡単に説明すると、ミラー＆リーディの精液の方法論の論文（1990）において、著者らは、FPを定量化するために青い舌を染色しました。彼らは、「丸みを帯びたピンク色の構造は直径約0.5mm」2としてFPに分類しました。著者らはさらに、分析作業のために、このメソッドを使用する前に、FPの特性をより厳密に定義する必要があることを助言し、既に文献に記さばらつきが2」は、異なる対象集団、異なる方法、および異なる研究者に起因するかもしれない」と結論付け、その一方で研究では、FPが17,18、大2、ピンクやライター2、および上昇し4を染色ラウンドであることが一般に受け入れられている特性につながっています。額面通りにすると、これらの特性は非常に単純に表示されます。味覚ラボの遺伝学では、出会ったの使用（ラボまたはラボを持って）HODは予選で得点の個々の試みによって、複雑で存在していたいくつかの、全てではないが、特性の上記の特性の重要性を優先しました。これらの合併症は、はるかに大きい乳頭の真っ只中にピンクが登場小さな乳頭を含め、このように色の変化に基づいて分類を排除する青色色素を吸収し、全体の舌。代わりに丸の長方形の乳頭。異言は、同じ画像の広く多様なFP数を報告得点に貢献し、すべてのそれらの標高にばらつきを有していません。 分析におけるこれらの変化は、主観を特定一般的に受け入れられてFP特性に例外を特定し、最終的に正確かつ客観的にFPを定義し、得点のプロトコルを考案するために、文学を確認するために私達を導きました。 まず、FPの形状が丸みを帯びた、マッシュルーム状構造17,18として文献に記載されています。を除くしかし、注目すべきイオンも言及しました。ミラーは、用語「茸」はキノコ形されていない誤った名称と、その多くのFPであるが、サイズおよび形態18で広く変えることができることを強調しました。メリスら 。 （2013）は、一方向にFP径が他の方向19に比べて、少なくとも2つの標準偏差より長かったと考えられていたいくつかの乳頭&quot;歪んだの、「記載しました。また、チェン＆ロビンソンは、染色によりFPを示すときに、彼らは外見20にフラット突破から長尺の範囲であったことがわかりました。上記の例外を指摘し、FPの特性のラウンドであるとキノコ形は狭すぎる定義が表示されます。 第二に、FPの色が青色染料と舌を染色した後、7「青の背景にピンクの円」と記載されています。ライターを染色することは文献を通してFPの最も一貫した基準であったが、それはまだ均一な修飾子ではありませんでした。チェン＆<html> ;ロビンソンは、識別が困難と20不確実な作り、FPが常に軽く染色されなかったことを観察しました。それは、舌が異なる色素を吸収し、コントラストは、多くの舌には明らかであるが、他はすぐに青色色素21の痕跡を失うながら、いくつかは区別せずに完全に青になっていることを次に表示されます。 第3の特徴、FPの大きさは、0.5ミリメートルから0.97ミリメートルの範囲の6,18、論文の中でかなり一致しました。文献ではミラーは、舌の背側前方に乳頭の2つのサイズの範囲があったことを指摘しました。小径の乳頭のほとんどが糸状18であった、より大きな直径の乳頭は、主に茸状及び円錐乳頭ました。しかし、ビーバーダムの子孫研究21を除いて、大きさは構造が文献で​​FPがあるかどうかを判断するためには表示されませんでしたが、すでに「茸」に分類乳頭に供しました。 _content &quot;&gt;最後に、上昇はミラーが指摘しても、舌の縁の近くに、この基準を使用する際に糸状と茸状乳頭の間の区別が困難である特徴第FP 4として表示されている。彼は、標高に大きく変化FPの2つの例を与え、別の高さが0.1mm未満であったが、それでも明らかにこの観察はまた、フォローアップとShahbake らによって確認された。18の観察された2つの味孔を有していた。4 1は、高さが0.8ミリメートルでありますこれらの定義とその報告例外は味フィールドが長いFPおよびMiller＆リーディから一般的に使用されるプロトコルの欠点を特徴付けるに矛盾を認識していることを示しています。実際、ミラー＆リーディはさらにFP 2の機能を定義するフィールドをexhortedを。私たちはときに、PAP得点が異なる特性に異なる重みを与え、その重要性を優先したという仮説を立てましたillaeは、乳頭が形大きなキノコだったときのように、すべての基準を満たすことができなかったが、青色に染色します。これは、以前に発表された研究の研究者は、おそらく小さなサンプルサイズと組み合わされた場合、この方法の使用から来る様々な結果を説明することができるこれは、同じことをやったと推論されました。 GOTラボは、客観的な測定を使用して各特性を定義し、分析に優先かを示すために特性を優先し、ガイドラインを開発することによって、FP法では、このギャップを取り上げました。この方法は、デンバー乳頭プロトコル（DPP）、舌のデジタル写真から正確で再現数を確保するためにFPの明確かつ明瞭な特性を持つ二分の鍵です。 DPPは、このように、個々の解釈を除去し、FP濃度を分析するときに、より一貫性のある結果を確保し、以前に使用されミラー＆リーディ方法を標準化するための提案された方法です。そうすることにより、DPPは、より自信を持ってDを使用することができます味はFPの役割をetermine。 被験者を撮影した舌画像は、この研究の真の主題である研究室の市民科学者（得点）で分析しました。市民科学者の研究室のコアは、16から80年代半ばに、年齢（歳）の範囲のコミュニティからのメンバーで構成されています。 2012年に博物館が委託総括評価報告書は、科学に強い関心を持つようにし、三分の二は、科学的な規律22の大学の学位を取得したと市民科学者が記載されています。候補市民科学者が現在口の中の言葉を介して動員され、成功した博物館でベテランのボランティアとのインタビュープロセスを完了する必要があり、彼らは上の位置に適用する機会を持つ前に、博物館の永久的な健康展、遠征健康に試用期間を受けますラボ。一度研究室に受け入れ、市民の科学者たちは、ヒト対象を登録する認定になるための12週間のトレーニングを受けます秒。この認定に続いて、彼らは研究室での様々な技術（ 例えば、乳頭計数、DNA抽出）と追加の認証および定期的な品質管理対策を次のようにトレーニングモジュールを取ることができるが、これらの市民科学者が積極的にデータ分析に参加する機会を持っています。市民の科学者たちは自分の時間をボランティアや博物館への貢献のために補償されません。

<table><tbody><tr><td>画像J</td><td>国立衛生研究所</td><td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij">http://rsb.info.nih.gov/ij</a></td><td></td></tr><tr><td>食品染料、ディープブルーシェード</td><td>エスコ</td><td>http://escofoods.com/blue-food-coloring.html</td><td></td></tr><tr><td>滅菌レーヨン先端OB/GYNアプリケーター</td><td>ピューリタン</td><td>25-808 1PR</td><td></td></tr><tr><td>グレード1フィルター</td><td>ペーパーWhatman</td><td>Whatman番号:1001-325</td><td></td></tr><tr><td>Coolpix P100 (10.3 メガピクセル) と P500 (12.1 メガピクセル)</td><td>ニコン</td><td>http://imaging.nikon.com/lineup/coolpix/</td> <td>どちらのモデルもウェブサイトで入手できないようです</td></tr><tr><td>ペーパーハンドタオル</td><td>クリネックス</td><td>https://www.kleenex.com/HandTowelsDetail.aspx</td><td></td></tr></tbody></table>

茸乳頭の客観的な分析のためのデンバー乳頭プロトコル

Denver Papillae Protocol for Objective Analysis of Fungiform Papillae

デンバー乳頭議定書の目標は得点間の一貫性のスコアリングを確保するために、茸状乳頭（FP）の特性を定義し、優先順位を付けるために二分の鍵を使用することです。このプロトコルは、味細孔密度のプロキシとしてFPを使用して、味覚研究の最後の二十年から生じた必要性のオフに構築します。ラウンド、軽く染色し、大規模な、と上昇：FP密度は、歴史的にそれらの形態のミラー＆リーディの1990特徴付けを用いて分析されています。本研究では、著者らは、FPの形態のより厳密な定義が概説するために必要なことをあらかじめご了承しました。アクションへの呼び出しにもかかわらず、フォローアップの文献にはミラー＆リーディのオリジナル作品を引用し続け、ほとんどの研究で、不足しています。その結果、FP密度レポートは味覚感度のFPの役割に矛盾した結論に寄与することができる、小さなサンプルサイズと組み合わせて、非常に可変されているとしています。味覚ラボの遺伝学は、この明らかなinconを探検しましたカウント中sistencyとは、FPの報告資質のすべてではありませんが、得点には個別に異なるこれらの特性の重要性を優先したことを発見し、乳頭はいくつかを持っていたときには指導がなかったです。この主観性の結果は同じ舌画像の非常に可変FP数です。デンバー乳頭プロトコルをさらに定義し、ミラー＆リーディによって出す特性の重要性を優先し、その二分の鍵を使用することにより、この結果を改善するために開発されました。提案手法では、味と栄養の研究の分野の研究者のためのFPを定量化するための標準的な方法を作成するのに役立つ可能性があります。

ここでは代表的な写真は、ラウンド、大きな、ピンクの分野規格に基づいてFPの識別のための一般的に使用されるミラー＆リーディ方法を使用してときに、2つの個々の得点によりスコアまたは軽く染色し、上昇し、同じ写真が2得点によって採点されますDPPを使用。示すカウントは、DPPを使用して、より低い分散と比較して、元のメソッドを使用して観察された高分散の代表的なものです。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52860/52860fig4.jpg" /> 図4：DPP定量対ミラー＆ザリーディ定量左の画像はミラー＆リーディメソッドを使用して、2つの得点」のカウントの代表です。右の画像は、DPPを使用して、2つの得点」のカウントを表します。赤はスコアラー1である、黄色がスコアラー2で、グリーンは得点1＆2です。 DPの統計的信頼性Pは、以前の変動10を評価するために、混合線形モデルを用いて検討しました。簡単に言えば、DPPは、スコアの一貫性において果たす役割を評価するためのデータを生成するために、15の画像が2得点しました。スコアの最初のバッチでは、DPPナイーブ得点にはミラー＆リーディ方法2を使用していました。得点者は、その後、DPPを使用するように訓練された画像が個別に品質管理（ 図5）を詳述するセクション2.7で説明した最終的な合意ステップなしで再評価されました。 FPスコアデータセットは、その後によるプロトコル（ 図6）内に、得点のばらつき二つの間の相互作用の組み合わせの違いを評価するために、混合モデルで使用しました。 6.99（SE = 150）によって、より高いカウントにつながるDPPとDPP（p値&lt;1×10 -6）に比べてミラー＆リーディメソッドを使用している場合、このモデルは、得点に有意な差が認められました。スコアの変動の5.2％は残りの原因、スコアラーに25.9パーセントによる訓練によるものであり、画像10に固有の変動のために。次に、内·スコアラーの変動を決定するためのデータを生成し、ランダムな順序で30一連の画像は、11個人によって記録しました。得点者に知られず、画像のこのシリーズを繰り返した三つの画像が含まれていました。我々は、画像をversusrepeatedの異なる画像を比較スコアの変動の劇的な違いを観察しました。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52860/52860fig5.jpg" /> 図5：ポストDPPトレーニング対DPP-ナイーブパネルはデンバー乳頭プロトコル訓練を前後15画像のレビュースコアのボックスプロットを提供します。白丸は異常値を示しているのに対し、各箱ひげ図の場合は、円の中に充填された平均値を示しています。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52860/52860fig6.jpg" /> 図6：得点分散の変化は灰色をtを表します彼はDPPの訓練の前に、個々の得点の分散します。ブラックDPPトレーニング後同じ得点王です。

ここでは、デジタル写真から茸状乳頭密度を測定するためのプロトコルを提示します。この方法は、ミラー＆リーディ（1990）による茸状乳頭の元の記述の仕事に優先順位付けし、客観的な特性の測定基準を構築します。

The goal of the Denver Papillae Protocol is to use a dichotomous key to define and prioritize the characteristics of fungiform papillae (FP) to ensure ...

この手順の全体的な目的は、二分法的な鍵（dichotomous key）を用いることで、スコア間および研究室間で一貫した方法で真菌状乳頭を定量化することです。まず、食用色素で被験者の舌を青色に染色し、1 cmの切り抜きがあるフィルターペーパーを舌に貼り付けることでこれを達成します。次のステップは、被験者の舌の高品質な接写画像を撮影することです。次に、判定者は二分法鍵を用いて、候補となる乳頭の形状、大きさ、色、および隆起度を確認します。無定形でなく、背景よりも少なくとも0.5 mmピンク色で、陥没していない乳頭は、真菌状乳頭としてスコアされます。最後のステップは、2つのスコア間でカウント数を照合し、その差が10%以内であることを確認することです。最終的に、Denver Papillaeプロトコルは、スコア判定や研究室間で一貫したカウントを確保するために、真菌由来乳頭（fungi form papillae）の特徴を定義し優先順位を付けるために使用されます。MillerおよびReadプロトコルなどの既存の手法に対するこの手法の主な利点は、真菌由来乳頭を定量化する際のスコアの主観性を低減できる点にあります。これは、各特徴を明確に定義し、二分鍵を用いることで、真菌由来乳頭として分類されるすべての構造が各基準を満たしていることを確認することによって実現されます。この手法は、味覚分野における重要な疑問、例えば、fungi formm乳頭の密度が味覚知覚においてどのような役割を果たすか（あるいは果たさないか）を定義することなどに答えるのに役立ちます。私たちがこの手法を考案したのは、シチズンサイエンティストにMillerおよびReading法を用いてfungi formm乳頭の計数を行ってもらった際、同一の舌画像であっても計数値に大きなばらつきがあることに気づいたことがきっかけでした。評価者へのヒアリングの結果、彼らが重視する特徴に優先順位の違いがあり、また、要件の一部は満たしているがすべては満たしていない乳頭の数え方について、個々人で判断が異なっていたことが明らかになりました。手順の実演を行うのは、味覚遺伝学研究室の市民科学者ボランティアであるRudy Torresです。被験者の準備として、ポーズの取り方と撮影される画像のイメージを写真で提示してください。被験者にペーパータオルで舌を拭き、舌を口から出した状態にしてもらうよう指示してください。1インチのチップを持つ滅菌済みレーヨンアプリケーターを使用し、1/36濃度の青色食用色素を約3mL、舌尖部に塗布します。被験者に舌を口に戻し、飲み込んで余分な色素を取り除くよう指示します。次に、安定させるために顎を手に置き、肘をテーブルにつけた状態で、写真に示す姿勢をとるよう被験者に指示します。被験者に舌を心地よい距離まで出し、軽く歯で固定するように指示します。直径10 mmの円形に切り抜かれた2.5 cmのフィルターペーパーを、舌の左側内側の先端に貼り付けます。正中線の横に、安定させるため三脚に固定した高品質のデジタルコンパクトカメラを設置します。マクロ設定を使用して、舌の接写画像を少なくとも3枚撮影します。その際、10 mmの円形切り出し領域全体を捉え、その範囲内のすべての真菌、形態、乳頭、またはFPを可視化できるようにしてください。カメラの推奨ズーム範囲内で、切り出し領域全体が撮影されるまでズームインします。カメラレンズの平面が舌の平面と平行であること、および写真の中で切り出し領域が円形に見えることを確認してください。計数に有用で高品質な写真であることを確認するため、細長いレビュー写真は使用しないでください。まず、同一被験者の舌を撮影した画像をコンピュータにアップロードします。舌の構造が最も鮮明に定義されており、かつ歪みの少ない角度で撮影され、舌がカメラに対して幅広く平らに写っているものを1枚だけ選択し、以降の解析に使用します。選択したRAW画像をオープンソースソフトウェアのImageJで開きます。「Plugins」をクリックし、ドロップダウンメニューから「Analyze」までスクロールして「Cell Counter」をクリックします。Cell Counterが開いたら、「Initialize」をクリックして画像とCell Counterを紐付けます。スコア間の整合性を保ち、以降のステップで利用するため、倍率は標準の50%に設定してください。fpをスコア付けするために、この画像を画面左側のセルカウンターの隣に移動します。この画像は「コピー」と呼ばれます。定量化する乳頭の直径を測定するため、元の画像の2つ目のコピーを開きます。2つのコピーを誤って混同しないよう、このコピーを画面の右側に移動してください。2枚目の画像はコピーBと呼びます。スコアリングのプロセス全体を通じて、個々のスコアラーの好みに応じて必要に応じて拡大および縮小を行ってください。コピーBでラインツールをクリックします。フィルターペーパーの直径10 mmの内円に沿って、任意の角度で正確に直径線を描画できるよう、必要十分なまでに拡大し、「analyze and set scale」をクリックします。既知の距離として10を入力します。別の角度を測定してスケールが正しいことを確認し、直径の範囲が9.8から10.2ミリメートルであることを確かめます。Denver PAPALEプロトコル（DPP）では、各候補乳頭がfpであるかどうかを判定するために、形状、色、サイズ、および後退を考慮します。二分法鍵を用いたスコアリングのトレーニング手順はこのビデオでは示しませんが、スコアリングを開始するための手順は付随するプロトコルテキストで確認いただけます。50%ズームで、候補となる乳頭が無定形または形状をなしていないかを確認します。楕円形、立方体形、円形など、一般的に認識される幾何学的形状があるかを確認してください。幾何学的形状が見られない場合は、セルカウンターウィンドウに移動し、「type one」をクリックしてください。コピーA。候補となる乳頭をクリックし、無定形であり味蕾乳頭（fp）ではないことをマークします。本ステップおよび以降のステップでタイプ1から4をクリックすることで、スコアラーがすべての候補乳頭を確認したことが判明し、構造を拒絶した際にどのルールに違反したかを分類できます。候補乳頭に幾何学的な形状がある場合は、次のステップに進んで色を確認してください。コピーAを参照し、舌の表面に色の分化があるかどうかを判定します。色の違いが見られるが、候補となる乳頭が青色で周囲の乳頭がより淡い色の場合は、セルカウンターウィンドウに移動し、コピーAのセルカウンターで「type two」をクリックします。候補をクリックして、「two blue」としてマークし、fpではないことを記録します。色の違いがない場合、または候補となる乳頭の一部がピンク色のままか、あるいはより淡く染色されている場合は、サイズ判定のための次のステップに進みます。コピーBを使用して、候補となる乳頭の輪郭が十分に見える倍率までズームします。ラインツールをクリックし、候補となる乳頭の最も長い次元にわたって測定します。クリックして解析し、測定された長さが0.499 millimeters以下であるかを確認してください。正確性を期すため、もう一度測定します。まだ0.499 mm以下である場合は、セルカウンターウィンドウの「type three」をクリックし、候補の乳頭をクリックして、小さすぎるためfpではないとマークします。測定された長さが0.5 mm以上の場合は、そのまま陥入状態の pemeriksaan を行い、候補の乳頭が舌の他の部分と同等の高さであるか、あるいは隆起しているかを確認します。乳頭が溝にある場合は、舌の表面ではなく、溝内の他の構造と比較してその高さを判断してください。乳頭が周囲の乳頭よりも低い場合は、セルカウンターウィンドウでタイプ4をクリックし、コピーAで候補となる乳頭をクリックして、陥没しておりfpではないことをマークします。候補となる乳頭が舌の他の部分と同等の高さであるか、または盛り上がっている場合は、タイプ5をクリックし、これがfpであることをマークします。このタイプ5の合計が、未補正のFPスコアとなります。コピーを保存するため、未加工のFPスコアをノートに書き留め、セルカウンターウィンドウの「export image」をクリックし、研究室で指定された命名体系に従って保存します。これにより、将来的にコピーAを開いた際に、タイプ1から5までのカラーマークを保持することができます。なお、品質管理用の未加工FPスコアは保存されません。各写真は2名の判定者が個別にスコア付けし、そのスコアを比較する必要があります。高い方のFP生スコアが低い方のFP生スコア平均の10%以内であれば、2つのスコアを合わせてコンセンサスFPスコアとします。2つのFP生スコアに10%以上の差がある場合は、スコア付けされた両方の写真を画面上に表示させてください。不一致についての議論および最終的なコンセンサススコアの決定を補助するために、タイプ1から4のカウンターを使用してください。コンセンサスが得られない場合は、3人目のスコアラーに画像のスコアリングを依頼し、その後、他の2人のスコアラーと協議してください。代表的な写真は、FP同定のために一般的に用いられるMiller法および3D法を用いて、まず2人の個別のスコアラーによってスコアリングされました。その後、同じ写真をDPPを用いて2名のスコアラーが採点しました。赤はスコアラー1、黄色はスコアラー2、緑はスコアラー1と2の両方を表しています。これらのカウントは、11個人のスコアのバリアント比較において、元の手法で観察された高い分散に対し、DPPAを用いた場合に分散が低くなることを示す代表的な例です。グレーで示されたDPPトレーニング前と黒で示されたDPPトレーニング後を比較したところ、トレーニング後にスコアの分散が有意に減少したことが明らかになりました。この手法を習得すれば、1枚あたりの画像につき5分以内で完了させることができます。この手順を行う際は、各写真を新鮮な視点で確認し、候補となる乳頭をすべて見逃さないよう、こまめに休憩を取ることが重要です。このビデオを視聴することで、二分法的な検索表を用いて乳頭状突起からの真菌を一定の手法で定量化する方法について、十分に理解することができます。

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神経科学

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