Name: ヒト母体·胎児のインターフェイスから白血球の単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 学ぶヒト母体胎児界面からの白血球単離法。機械的解離と酵素処理、密度勾配遠心により細胞表面マーカーを保持し、フローサイトメトリー解析可能な生細胞を得る技術です。

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この作品は、児童の健康と人間開発のユニス·ケネディ·シュライバー国立研究所、NIH / DHHSによってサポートされていました。この作品はまた、妊産婦、周産期や小児保健におけるウェイン州立大学周産期イニシアティブにより、部分的には、サポートされていました。 私たちは感謝して、原稿の彼女の重要な測定値のためのモーリーンMcGerty（ウェイン州立大学）を認めます。

このプロトコルは、フローサイトメトリーによる免疫表現の準備のために基底脱落膜および壁側脱落膜からの白血球の分離に適しています。さらに、単離された細胞は、細胞選別、細胞培養、RNAの単離、及び細胞診のために使用することができます。このプロトコルに記載されたサンプルを使用して作業する前に、人間の倫理的な承認は、現地研究倫理委員会及び治験審査会から取得する必要があります。研究目的のためのヒトサンプルの収集と利用が児童の健康と人間開発のユニス·ケネディ·シュライバー国立研究所（NICHD）、国立衛生研究所（NIH）、保健社会福祉省（DHHSの制度審査委員会によって承認されました、ベセスダ、MD、USA）とウェイン州立大学（デトロイト、MI、USA）。書面によるインフォームドコンセントは、従来の組織サンプルの集合をすべての妊婦から得ました。 注：動物血液で作業しながら、細胞、または危険組織単位剤、このプロトコルで述べたように、それは適切なバイオセーフティと実験室の安全措置に従うことが必須です。 ヒト脱落膜組織の1解剖注：基礎プレートは、ベースの下や胎盤に取り付けられており、母体の表面を表します。 chorioamniotic膜は、羊膜と絨毛膜を含みます。基底板は、基底脱落膜を含み、絨毛膜は、壁側脱落膜（ 図1）を含みます。 <ol><li>脱落膜基底<ol><li>胎盤（ 図1Aおよび図1B）のいずれかの子葉から底板の部分を解剖。 </li><li>上向きに胎盤絨毛で滅菌まな板の上に置きます。胎盤絨毛を示す側面は通常、外観の毛むくじゃらの組織と流血の赤です。基底板は、滑らかで、色は淡い赤色です。 </li><li> VILLを削除するには、シャープ、細かい点ハサミやピンセットを使用してOUの組織および血管。プロセス（ 図1C）中に1×PBS（無料- -およびMg 2+のCa 2+）に浸した組織を保ちます。これらの作品の3の2を収集し、血液（ 図1D）を除去するために、1×PBSでそれらを徹底的にすすぎます。 </li></ol></li><li>脱落膜Parietalis <ol><li> chorioamniotic膜（約10cm×10センチ、 図1E）の作品を分析。絨毛膜を上に向けて、ボードの上に置きます。絨毛側は血まみれの血栓が含まれており、通常は色が黄色がかった光です。 </li><li>できるだけ血の塊（ 図1E）の多くを除去するために、細かい点鉗子を使用してください。 1×PBSを明確に実行されるまで、膜から余分な血液をきれいにするために、滅菌1×PBS中で膜を洗浄します。 </li><li>優しく膜から脱落膜層をこすり取るために使い捨ての滅菌細胞スクレーパーを使用してください。 MEMに滅菌1X PBSを適用しますブレーンこのプロセス（ 図1F）が完成しています。脱落膜組織を収集し、滅菌1×PBS（ 図1G）で50mlのプラスチックチューブに配置します。 </li></ol></li></ol> 2.機械的脱凝集および酵素消化<ol><li> 50ミリリットルのプラスチックチューブに滅菌1×PBSで（ステップ1.2.3から）（ステップ1.1.3から）基底脱落膜または壁側脱落膜から解剖組織を洗ってください。室温で5分間、300×gで遠心分離することによって、組織のペレットを収集します。 </li><li>ペレットを乱すことなく、慎重に組織ペレットの上方に位置し、上清を吸引除去します。 注：彼らは赤血球が含まれているため、この時点では、ペレットは非常に緩んでいます。ペレットの体積が約3未満またはmlである場合、細胞剥離溶液を6mlの37℃に予め温めでペレットを再懸濁します。ペレットを3mlの体積よりも大きい場合（約2回目の追加以上の細胞剥離溶液を添加組織サンプルの電子量）。 </li><li> C管に均質化した組織（基底脱落膜+細胞剥離液や壁側脱落膜+細胞剥離液）を転送します。 </li><li>自動解離でCチューブを配置し、対応するプログラムを実行します。 注：基底脱落膜のためのプログラムは、1回あたり668合計ラウンドで17秒間実行されます。壁側脱落膜のためのプログラムは、1回あたり235合計ラウンドで37秒間実行されます。これらのプログラムは、基底脱落膜または良好な収率および細胞生存率と壁側脱落膜から白血球を分離するためにカスタマイズされています。 </li><li>組織の機械的解離に続いて、例えば、ACCUTASEとして市販されている細胞剥離液で組織を消化します。穏やかに攪拌しながら37℃で45分間（タンパク質分解およびコラーゲン分解酵素が含まれていますカクテル）。 </li></ol>白血球の3分離<ol><li>インキュベーション後、DIGEに1×10mlのPBSを追加stion混合し、50mlのプラスチックチューブに100μmのセルストレーナーを介して渡します。消化混合物の粘着性に応じて、1つは、1つの混合物のためのいくつかの細胞ストレーナーを使用する必要があります。 </li><li>室温で5分間、300×gで1×PBSでチューブと遠心分離機を記入してください。慎重に細胞ペレットの上に1×PBSを除去し、氷冷FACS緩衝液5mLでペレットを再懸濁。 注：6.1に進み、一緒に多形及び単核白血球を研究するために、単核白血球を研究するために、3.3に進みます。 </li><li> 15ミリリットルのプラスチックチューブに20％、5mlの密度勾配媒体（1.077 + 0.001グラム/ ml）を加え、ゆっくり密度勾配媒体の上に細胞懸濁液をオーバーレイ。サンプルの積層が、それは、細胞懸濁液を密度勾配媒体を混合しないことが重要です。 </li><li>ブレーキなしで4℃で30分間、500×gで、スイングアウトローターで遠心します。これは、細胞とlの混合を避けるためにブレーキをオフにすることが非常に重要ですグラデーションをosing。白血球は、密度勾配媒体およびFACS緩衝液との間のインターフェイスに記載されています。 </li><li>ピペットを用いて、非常に慎重にFACS緩衝液と細胞の破片が含まれている上位層を削除します。界面でのバンドは脱落膜単核細胞および多形核白血球の一部が含まれています。 </li><li>全く新しい15ミリリットルのプラスチックチューブに界面でのセルを転送します。 FACS緩衝液の少なくとも3倍以上のボリュームを追加します。 </li><li>細胞をペレット化するため5分間、300×gで遠心分離します。上清を吸引除去し、FACS緩衝液で細胞を洗浄します。 RTで5分間、300×gで遠心分離して別の細胞をペレット化。 注：ステップ6を参照して、免疫表現を実行するには、ステップ5を参照して、細胞選別を実行するには、ステップ4を参照して、細胞培養を行うことができます。 </li></ol> 4.アプリケーション - 細胞培養<ol><li> USI生存細胞をカウントし、RPMI培地1640 1mlにステップ3.7からの細胞を再懸濁自動セルカウンターまたは血球計およびトリパンブルー溶液0.4％をngの。 </li><li> 1×10 6細胞/ mlの細胞濃度を作るためにRPMI培地の量を加えます。細胞は、今の文化のための準備が整いました。 </li></ol> 5.アプリケーション - 初代細胞培養のためのマクロファージの単離<ol><li>磁気CD14マイクロビーズ（10 7細胞あたり20μlのビーズ）と、ステップ3.7からの細胞を標識する、CD14 +細胞を単離するために、15 4℃で分、磁場を印加することにより、細胞の他のタイプとは別のCD14 +細胞をインキュベートします。 MACSバッファーと磁場の除去により2回洗浄した後、MACS緩衝液で磁気的に保持さCD14 +細胞を溶出させます。 </li><li> RPMI培地1640中で遠心分離、再懸濁細胞ペレット次の細胞（ 図2）をメッキするための準備ができています。 </li></ol> 6.アプリケーション - 免疫表現<ol><li> immunophenotために細胞を使用するには、yping、1×1mlのPBSにステップ3.7から細胞を再懸濁します。自動セルカウンターまたは血球計およびトリパンブルー溶液0.4％を使用して生細胞を数えます。 </li><li>固定可能な生存力色素（ 図3）を用いて細胞を標識。 FACS緩衝液で2回細胞を洗浄し、染色緩衝液中で細胞を再懸濁します。 4℃で15分間のFcRブロッカーでインキュベートします。 </li><li>蛍光色素に結合させ、細胞外の抗体を追加します。例えば、このプロトコルでは、抗CD3、抗CD19、抗CD14、抗CD15、および抗CD56抗体（ 表1）を使用します。暗所で4℃で30分間インキュベートします。 </li><li> 1×PBSで2回洗浄した後、細胞を、フローサイトメーターを使用して、染色緩衝液500μl中で分析されます。脱落膜組織に見られる白血球亜集団を分析するために使用されるゲーティング戦略の表現は、 図4に示されています。 </li></ol>

著者らは利益相反を明らかにしていない。

ヒト母体·胎児の界面に浸潤白血球の機能および表現型特性の特徴は、妊娠障害につながる免疫機構の理解に不可欠です。いくつかの技術が妊娠10,14,25,28,37,42,43を通してヒト母体胎児のインターフェイスから白血球を単離するために記載されています。しかし、これらの技術のそれぞれが別個のものである、異なる酵素を使用するか、またはそれらの組み合わせを酵素、異なる解離時間を必要とする、組織の量を指定していない、と、最も重要なのは、常に単離された細胞の生存率を指定していません。本明細書に説明されたプロトコルは、生存能力の高い収率で得られたヒト母体·胎児のインターフェイス（基底脱落膜および壁側脱落膜）で浸潤白血球の単離を可能にし、市販の試薬、バッファの準備、組織量、およびインキュベーション時間validaに関する詳細な情報を提供します我々の研究室でのテッド。 白血球分離工程の最初の重要なステップは、組織の解離です。このステップは、機械的な人種差別廃止および/または酵素的解離を伴います。機械的な人種差別廃止に成功壁側脱落膜（ 図1F）を</strong...

妊娠は、3つの異なる免疫学的位相によって特徴付けられる：1）注入およびプロ炎症反応に関連した初期の胎盤形成（ すなわち 、注入は「開いた傷を&#39;似ています）。 2）妊娠中期および免疫恒常性は母体·胎児の界面で主に抗炎症状態を経て達成され、妊娠の第三期のほとんど。 3）分娩、プロ炎症状態1-7。免疫細胞は、妊娠6-9を通して彼らの豊かさと局在変化母体胎児の界面での炎症反応の調節に重要な役割を果たしています。 ヒトでは、母体胎児のインターフェイスは、母体（脱落膜）と胎児（絨毛膜または栄養膜）の組織との間の直接の接触面積を表しています。このインタフェースは含まれています：1）脱落膜は、線が子宮腔胎盤で覆われていないことをparietalisと並置されています平滑絨毛膜に、 2）それは間質性栄養膜10（ 図1）に侵略された胎盤の基底板に位置する基底脱落膜、。接触のこれらの領域の親密は、母体の免疫システム11-13胎児抗原暴露するための条件を作成します。驚くことではないが、白血球は、典型的な間質型細胞と腺細胞8,14,16に加えて、脱落膜細胞8,9,14,15の30〜40％までを含みます。母体·胎児の界面での白血球の役割は、栄養膜浸潤17の制限、らせん動脈のリモデリング18,19、母体の寛容12,20の維持、及び労働21-26の開始を含む複数のプロセスを包含する。適応免疫系の先天性四肢両方の白血球、 すなわち 、T細胞、マクロファージ、好中球、B細胞、樹状細胞、およびNK細胞は、脱落膜組織において同定されており、それらの割合および活性化状態は、妊娠6-10,12,14,24,27-30を通して空間的および時間的に変化することが示されています。白血球集団および/ ​​または機能の摂動は、自然流産31、子癇前症32、子宮内発育制限32,33、および早産7,24に関連しています。したがって、ヒト母体·胎児の界面における表現型の特徴と、白血球の機能の研究では、妊娠障害に調節不全の免疫学的経路の解明を容易にします。 白血球の表現型および機能的特性を決定するために使用される最も強力なツールの一つは、フローサイトメトリーを同時に複数のパラメータ34-36の定量分析を可能にする技術が流れています。フローサイトメトリーにより白血球を分析するために、単一細胞懸濁液中の白血球の分離が必要とされます。したがって、この方法は、レイを浸透分離します母体·胎児のインターフェイスからkocytesは、​​それらの表現型および機能的特性を研究するために必要とされています。 いくつかの方法は、ヒト母体胎児界面10,14,25,27,37-39から白血球を分離するために記載されています。いくつかは、機械的解離10,25,27,38を適用しているが、他の人は組織解離用の酵素消化37,40を使用しています。機械的な分解がより低い収率と低生存率41を生成し、酵素的解離は、生存能力及び細胞表面マーカーの保持42に影響を与える可能性があるため、本明細書に記載の方法は、細胞の生存率を損なうことなく、単離された白血球の収量を増加させるために、酵素前処理して穏やかな機械的解離を組み合わせます。方法の同様の組み合わせは、母体胎児界面39における脱落膜組織からの白血球の分離に有効であることが実証されています。したがって、本明細書に記載されたプロトコルは、メカを伴いますメス、かみそりの刃、または手術用はさみ10,28に対向して、従来のミンチに比べ、時間と労力を節約しながら一貫性を増加させ、自動組織解離とnical分解。組織解離のために選択された酵素は、のAccutaseました。一般的に使用されるコラゲナーゼ43とは異なり、44ディスパーゼ、トリプシン45は 、のAccutase（細胞剥離液）は、一般的なタンパク質分解的かつ効率的なまだ穏やかな解離46,47に貢献するコラーゲン分解活性の両方を兼ね備えています。解離後、白血球は、密度勾配遠心分離により脱落膜細胞の全集団から濃縮​​されます。様々な密度勾配媒体は、以前パーコール（コロイダルシリカ粒子の懸濁液）48とフィコール（高合成分子量のショ糖の重合体）49をしている最も一般的なものは、利用されてきました。ショ糖ポリマーによる分離の優れた効率はprevioされていますusly 50に示し、本明細書にさらに記載されるプロトコルは、この密度勾配媒体は、単核白血球の十分に高い純度を生成することを証明します。 したがって、本明細書に記載されたプロトコルは、ヒト脱落膜組織から白血球を分離するために、自動組織解離、細胞剥離液で酵素消化、および密度勾配媒体（1.077 + 0.001グラム/ ml）で白血球の分離と機械的に組織脱凝集を兼ね備えています。このプロトコルは、細胞生存率と共に、細胞表面抗原を維持することが証明されています。単離された白血球は、フローサイトメトリー、およびin vitroでの機能研究と免疫表現を含む、複数の用途に使用することができます。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Dissection</td></tr><tr><td>滅菌解剖ツール:手術用ハサミ、鉗子、細いピンセット&nbsp;</td><td>任意のベンダー</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>1X リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>(1X PBS)</td></tr><tr><td>大小のシャーレ</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Dissociation</strong</td></tr><tr><td>>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td>(細胞剥離液)</td></tr><tr><td>滅菌 2 ml セーフロック コニカルチューブ</td><td>任意ベンダー50ml</td><td></td><td></td></tr><tr><td>円錐形遠心分離管任意の</td><td>ベンダー100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&micro;m セルストレーナー</td><td>FALCON/Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 丸底ポリスチレン試験管</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C チューブ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Cell Culture</td></tr><tr><td>RPMI 培養液 1640&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td>(1X) (10% FBS and 1% P/S)</td></tr><tr><td>プラスチックチャンバースライド</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>Thermo Scientific Corporation</td><td>HEPA Class 100</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>Fisher Scientific</td><td>ISOTEMP 110</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>Nexelcom</td><td>Cellometer Auto2000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>オリンパス</td><td>オリンパス CKX41</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cell Separation</td></tr><tr><td>MS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Cell separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu;m プレセパレーションフィルター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-40</td><td></td></tr><tr><td>マルチスタンド</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 ml セーフロック コニカルチューブ</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MACS バッファー&nbsp;</td><td></td><td></td><td>(0.5% ウシ血清アルブミン、2 mM EDTA および 1X PBS)</td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</strong</td></tr><tr><td>>FcR Blocking</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>(Fc Block)</td></tr><tr><td>抗ヒト細胞表面抗原抗体&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>(表1)</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 生存率色素</td><td>BD Biosciences</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>Lyse/Fix buffer&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>346202</td><td></td></tr><tr><td>FACSバッファー&nbsp;</td><td></td><td></td><td>(0.1% BSA, 0.05% アジ化ナトリウム, 1X PBS, pH=7.4)</td></tr><tr><td>染色緩衝液&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>554656</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution 0.4%</td><td>Life Technologies</td><td>15250-011</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>20% 密度勾配培地 (1.077 + 0.001 g/ml)</td></tr><tr><td colspan="4">Additional Instruments</td></tr><tr><td>Incubator with shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>MAXQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>LSR-Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機&nbsp;</td><td>ベックマン・コールター</td><td>SpinChron DLX</td><td></td></tr><tr><td>真空システム</td><td>任意のベンダー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>自動組織解離器&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>gentleMACS解離者</td><td></td></tr></tbody></table>

ヒト母体·胎児のインターフェイスから白血球の単離

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

妊娠は、生殖組織および母体·胎児のインターフェイス（基底脱落膜および壁側脱落膜）での白血球の浸潤を特徴とします。このインタフェースは、母体と胎児の組織との間の接触の解剖学的部位です。したがって、妊娠中の免疫学的な作用部位です。母体·胎児の界面における浸潤白血球は、移植、妊娠の維持、および配信のタイミングで中心的な役割を果たしています。したがって、これらの白血球の表現型および機能的特徴付けは、妊娠障害につながるメカニズムへの洞察を提供します。いくつかのプロトコルは、基底脱落膜および壁側脱落膜から浸潤白血球を単離するために記載されています。しかし、インキュベーションの試薬、酵素、および時間の一貫性の欠如は、それが困難なこれらの結果を比較することができます。本明細書に記載の穏やかな機械的および酵素的ディスの使用を組み合わせた斬新なアプローチであります白血球細胞外および細胞内マーカーの生存性および完全性を維持するociation技術は、母体·胎児の界面でのヒト組織から単離されました。別に免疫表現、細胞培養、および細胞選別から、このプロトコルの将来のアプリケーションは、多数かつ多様です。このプロトコルに続いて、単離された白血球をDNA インビトロ白血球機能（ すなわち 、食作用、細胞毒性、T細胞増殖、および可塑性など ） におけるメチル化、標的遺伝子の発現、および反応性酸素種の産生を決定することができます母体·胎児の界面で。また、記載されたプロトコルを使用して、この研究室では、母体·胎児の界面に新たな、希少白血球を記述することができました。

母体·胎児のインターフェイス（基底脱落膜および壁側脱落膜）でのヒト組織の切開は、図1に示されている。この手順では、基底脱落膜（ 図1A - D）を含む基底板の解剖を含んでいます。脱落膜の基底は、基底板（図1C）からの胎盤絨毛（胎児側）を除去することによって得られます。壁側脱落膜を穏やかに漿膜（ 図1E - F）を掻き取って回収される。 図2孤立したマクロファージ（CD14 +）の形態は、磁気セルソーティングを使用して、長期的な妊娠中の壁側脱落膜から収集を示しています。単離されたマクロファージは、培養の3日後、サイトカインを放出する能力を維持した（データは示さず）。基底脱落膜および壁側脱落膜から単離された生存細胞の収量は、 図3に示されており、それは両方で90％以上です。 <st栄&gt;図4は、T細胞（CD3 +）、好中球（CD15 +）、マクロファージ（CD14 +）...

ここに記述されているのは、decidua basalisおよびdecidua parietalisの浸潤する白血球を分離し、さらに研究するためのプロトコルです。これは、人間の母体と胎児のインターフェースです。このプロトコルは、細胞表面マーカーの完全性を維持し、フローサイトメトリー分析によって証明されているように、ダウンストリームアプリケーションに対して十分な生存細胞を産出します。

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

本手順の目的は、ヒトの脱落膜、基底脱落膜（baus）、および壁側脱落膜（decidua paral）から白血球を分離することです。まず、胎盤からヒトの脱落膜組織を切り出します。次に、機械的な分散と酵素消化により、脱落膜組織を解離させます。次に、細胞懸濁液を1×PBSで洗浄した100 µmのセルストレーナーでろ過し、4°Cで300 ×gにて5分間遠心分離して細胞ペレットを得ます。最後に、細胞懸濁液を密度勾配溶液の上に載せて遠心分離し、白血球を含む界面を回収します。最終的に、単離された白血球を免疫表現型解析、細胞培養、および機能研究に使用することができます。本手法が機械的分離や酵素消化などの既存の手法に対して持つ利点は、機械的な組織解離を自動組織処理装置と組み合わせ、Accutaneによる組織消化および密度勾配を用いた白血球分離を併用している点にあります。本プロトコルは、細胞生存率における細胞表面抗原を保持することが証明されており、その意義は、出生前合併症の発症機序に関連する母児界面への浸潤白血球の機能的および表現型的な特性の理解にまで及びます。研究目的でのヒトサンプルの収集および利用は、Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development、National Institutes of Health、Department of Health and Human Services、およびウェイン州立大学の機関審査委員会（IRB）によって承認されました。組織サンプルの採取前に、すべての妊婦から書面によるインフォームド・コンセントを得ました。まず、胎盤の1枚の葉から基底板の一部を切り出します。それを滅菌済みのカッティングボード上に置き、血赤色で毛状の外観を呈している胎盤絨毛側を上にします。基底板は滑らかで淡赤色をしています。組織を1×PBSに浸したまま、鋭利な細い先端の剪刀とピンセットを用いて、絨毛組織と血管を取り除きます。2〜3片を採取し、PBSで十分に洗浄して血液を除去してください。decidua parietalisを単離するために、10 cm × 10 cmの正方形に切り出します。血塊を含み、通常は淡黄色である絨毛膜が上を向くようにしてボードの上に置きます。次に、精細鑷子を使用して、可能な限り多くの血塊を取り除きます。その後、滅菌済みの1×PBSで、PBSが透明になるまで膜を洗浄します。使い捨ての滅菌セルスクレーパーを使用し、メンブレンにPBSを供給しながら、脱落膜層を慎重に掻き取ります。脱落膜組織を回収し、50 mLのプラスチックチューブに入れた滅菌PBSに加え、脱落膜球や脱落膜傍組織を機械的に分散させます。まず、50 mLチューブ内で1×PBSを用いて組織を洗浄します。次に、組織を300 G、室温で5分間遠心分離します。ペレットを乱さないように注意して、上清を吸引除去します。その後、テキストのプロトコルに従って組織と剥離溶液を再懸濁し、均質化した組織をCチューブに移します。チューブを自動解離装置にセットし、組織をAccutaseなどの市販の細胞剥離溶液で解離させ、対応するプログラムを実行します。37 °Cで緩やかに攪拌しながら45分間インキュベートし、消化させます。インキュベーション後、消化液に10 mLのPBSを加え、100 µmのセルストレーナーを通して50 mLチューブに回収します。粘性によっては、1回の消化液をろ過するために複数のストレーナーが必要になる場合があります。PBSでチューブを満たし、室温で300 Gにて5分間遠心分離します。上清を慎重に取り除き、氷冷したfax bufferを5 mL加えて細胞ペレットを再懸濁します。単核白血球を解析するため、15 mLプラスチックチューブに20%密度勾配培地を5 mL加えます。次に、細胞懸濁液をゆっくりと上層に重層し、層が混ざらないように注意します。スイングローター付き遠心機を用いて、4 °C、500 Gでブレーキなしで30分間遠心分離すると、密度勾配培地とFACSバッファーの界面に白血球が集まります。続いて、FACSバッファーと細胞残渣を含む上層を注意深くピペットで除去します。界面には、残存する単核細胞と一部の多形核白血球が含まれています。この層を新しい15 mLチューブに移します。チューブにfaxバッファーを少なくとも3倍量加え、300 Gで5分間遠心分離します。細胞をペレット化するため、上清を吸引し、細胞培養を行う前に、faxバッファーで2回目の細胞洗浄を行います。テキストプロトコルに従ったソーティングおよび免疫表現型解析の結果、本図は磁気細胞分取法を用いて正期妊娠の脱落膜パリア層から回収した単離マクロファージの形態を示している。単離されたマクロファージは、3日間の培養後もサイトカインを放出する能力を維持している。密度勾配遠心分離後、脱落膜、basalis層および脱落膜パリア層から単離された生存細胞の回収率を算出した。ここに示すように、固定可能な生存率を用いたところ、各脱落細胞集団において90%以上でした。ここでは、T細胞、好中球、マクロファージ、NK細胞、NKT細胞、およびB細胞を含む、可視化されたゲーティング内での多形核白血球および単核白血球の解析のためのゲーティング戦略を示しています。正期妊娠において、本図は正期妊娠から単離した残留細胞由来の好中球、マクロファージ、T細胞、およびB細胞を示しています。最後に、正期産から単離された残存細胞由来のNK細胞、NKT細胞、およびT細胞を本プロットセットに示します。習熟すれば、適切に実施することでこの手法は3時間で完了できます。本手順を行う際は、血液による混入を避けるために組織を十分に洗浄すること、および手順の間、組織と酵素カクテルを常に視界に入れておくことが重要です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

マウス脳から浸潤白血球を得るために迅速な方法が記載されている。この方法は連続Percoll勾配と白血球に富む層を選択し、精製する不連続フィコール勾配を利用しています。分離された白血球は、フローサイトメトリー測定によって特徴付けることができる。...

脳浸潤白血球の分離

ここでは、臍帯血から前駆体のサブセットB-細胞を単離するためのプロトコルを記述します。核酸の十分な量と質を細胞から抽出したDNAまたはRNAを利用して、その後のアッセイに使用することができる。...

臍帯血から前駆B細胞サブセットの分離

ここで説明されているのは、マウスの母体-胎児インターフェース(子宮、脱落膜、および胎盤)の組織の浸潤白血球を分離し、分析するためのプロトコルです。このプロトコルは、ほとんどの細胞表面マーカーの完全性を維持し、フローサイトメトリー分析を含むダウンストリームアプリケーションに十分な生存細胞を生成します。...

母体·胎児界面におけるマウス組織からの白血球の分離

ここで我々が​​分離し、これらの組織から間葉系幹/間質細胞（MSC）の拡大が続く人間の満期胎盤から胎児と母体組織の切開のための方法を記載しています。...

単離およびヒト胎盤組織由来の間葉系幹/間質細胞の増殖

初代ヒト胎盤（絨毛）及び脱落膜の器官培養を確立するための簡単​​な方法が記載されています。絨毛および脱落膜器官培養は、人間の母体胎児の界面での病因を研究するための貴重なツールです。通性細胞内細菌リステリア菌による感染が実証されています。...

母体・胎児のインターフェイスでの感染症を研究するためにヒト胎盤および脱落膜器官培養

ここで、我々は、ヒト臍帯（UC）および臍帯に胎児胎盤サンプル単離のための（CL）、ウォートンゼリー（WJ）、臍帯胎盤接合（CPJ）、および胎児胎盤（FP）裏地の解剖のためのプロトコルを提示しますそして外植片培養技術を用いて、間葉系間質細胞（MSC）の特徴付け。...

ヒト臍帯及び胎児胎盤由来間葉系間質細胞の単離および特徴付け

このプロトコルは、アプリケーション (すなわち免疫細胞化学、フローサイトメトリー、等) の様々...

用語胎盤の胎児膜から主のひと脱落膜細胞の分離

母乳はヒト免疫不全ウイルス(HIV)を伝播するが、HIVに感染した母親によって授乳された乳児の約15%だけが感染する。母乳で育てられた乳児は毎日〜105−108母性白血病を摂取するが、これらの細胞は研究されている。ここでは、母乳白球の単離と、その間に行能力の分析について説明する。...

HIV標的の抗体依存性細胞性性性過小細胞症アッセイにおけるヒト母乳からの白球細胞の単離

これは、妊娠中および非妊娠マウスの両方から子宮リンパ球細胞を単離する方法である。この方法は、FACSの表現型、細胞分類、機能アッセイ、RNA-seq、プロテオミクスなどの複数の下流アプリケーションに使用できます。ここでのプロトコルは、フローサイトメトリーによる細胞性の細胞の1個の子宮型を表示しています。...

フローサイトメトリーによる分析のための子宮内生リンパ球細胞の分離

このプロトコルは、インフルエンザ感染後のマウス肺からの生存免疫集団および非免疫集団の定常状態からの分離を詳述しています。また、上皮細胞および骨髄系細胞サブセットを同定するためのゲーティング戦略も提供します。...

マウス肺からの生きた骨髄系および上皮細胞集団の単離

このプロトコルにより、ヒトの胎盤の基底部十座および絨毛膜から原発HLA-G+の絨毛膜(EVT)の精製、特徴解析、培養が可能になります。一次EVT培養は96時間の生存能力を維持し、サンプルマッチした母体免疫細胞との共培養や、その後のフローサイトメトリクスおよび分子分析を可能にします。...

表現型および機能解析のためのヒト胎盤組織からのHLA-G+ 外芽外栄養芽細胞の精製

学ぶヒト母体胎児界面からの白血球単離法。機械的解離と酵素処理、密度勾配遠心により細胞表面マーカーを保持し、フローサイトメトリー解析可能な生細胞を得る技術です。

ヒト母体·胎児のインターフェイスから白血球の単離

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