Name: 母体·胎児界面におけるマウス組織からの白血球の分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: 学ぶマウスの母体・胎児界面からの白血球分離法。機械的解離と酵素処理により、子宮・胎盤・脱膜組織から生存率の高い免疫細胞を単離し、フローサイトメトリーなどの下流解析に利用可能です。

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NGLは、ウェイン州立大学周産期母子でイニシアティブ、周産期や小児保健によってサポートされていました。私たちは感謝して、原稿の彼らの重要な読書のためのモーリーンMcGertyとエイミーE. Furcron（ウェイン州立大学）を認めます。

このプロトコルに記載されたサンプルを使用して作業する前に、動物の倫理的な承認は、現地研究倫理委員会及び治験審査委員会によって与えられなければなりません。このプロトコルで述べたように、動物の血液、細胞、または危険な薬剤で作業している場合は、適切なバイオセーフティと実験室の安全行動に従わなければなりません。 1.マウスの取扱い及び組織収集<ol><li>無菌ワークステーションを準備し、組織収集のための無菌のツールを入手してください。これらのツールは、大小の手術用ハサミ、ピンセット、および先の細いピンセットが含まれます。 （ - 22°C 20）を室温に平衡化 - （5ミリリットル3）1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液を充填し、適切な組織名で標識された小さなペトリ皿が挙げられます。 （10〜15ミリリットル）も1×PBS溶液で満たされた標識されていない大きなペトリ皿を、含みます。 </li><li>妊娠中のマウスを安楽死させる（10.5から19.0日後交尾（DPC）または送達の前に）二酸化炭素を使用して（CO 2）。マウスを安楽死させていることを確実にするために、頸椎脱臼技術を使用しています。 注：10.5 DPCの前に、それは手動で子宮組織から脱落膜組織を分離することは困難です。脱落膜白血球の分離が必要でない場合、子宮非妊娠マウスの組織または10.5 DPC &lt;におけるマウス由来のものからの白血球は、このプロトコルに従うことによって行うことができます。 </li><li>無菌手術用ハサミを使用して、完全に皮膚や筋肉組織の下腹部の部分を削除します。子宮と卵巣が表示されるまで、ピンセットで、さておき、他のすべての臓器に移動します。子宮がついたままで、腹腔（ 図1A）の外に移動するために鉗子を使用しています。 </li><li>各子宮角の卵管と子宮卵管接合部の遠位に卵巣の位置を確認します。小さな手術用はさみを使用して、子宮卵管接合部で切開を行い、子宮血管を含む腸間膜から子宮角を分離します。その後、子宮頸部での消費税は腹腔（ 図1B）から子宮角をデタッチします。 </li><li>小さな手術用ハサミで、子宮頸部と子宮角の下側セグメント間の切開を行います。子宮角を開けないようにするために、このプロセス（ 図1C）の間、子宮頸部の一部を添付しておきます。 </li><li>移植部位を水和するために - （15ミリリットル10）1×PBS溶液で満たされた大きなペトリ皿に（子宮頸部を含む）子宮角を浸し。 </li><li>まだ1×PBS溶液に浸漬しているが、小さな手術用ハサミで子宮角から任意の脂肪をトリミングします。解剖を通して1×PBS溶液に浸漬した組織にしてください。 </li><li>ピンセットで所定の位置に子宮角を持ち、小さな手術用はさみ（ 図1D）を使用して、インター注入領域を切断横と子宮からの移植部位の1つを削除します。移植部位はに囲まれ、胎児が含まれています漿尿膜、および子宮、脱落膜、および胎盤組織。 </li><li>鉗子を使用して、所定の位置にサイトを保持し、胎盤と脱落膜組織（ 図1E）に隣接した子宮壁に小さな切開を行います。これらは子宮壁と胎児を含む漿尿膜（ 図1F）の両方から分離された状態になるまで、胎盤/脱落膜の周囲にトリム。 </li><li>胎盤を除去し、1×PBS溶液中に脱落膜組織と場所を添付（3〜5ミリリットル;ステップ1.12を参照してください）​​。 </li><li> （3〜5ミリリットル）1×PBS溶液で満たされたペトリ皿に子宮組織に取り付けられた絨毛尿膜に囲まれた胎児を配置します。これらの組織の水和は、子宮壁（ステップ1.14参照）からの漿尿膜の分離を容易にします。 </li><li>先の細いピンセットを使用して、静かに胎盤表面から脱落膜組織（白灰色の層）を剥離。これを実行します胎盤および脱落膜組織（ 図1G）の完全性を維持するために慎重に進みます。 </li><li> （ - 5 mlずつ3）1×PBS溶液で充填された2つの別々に標識されたペトリ皿中の胎盤および脱落膜組織を配置します。 </li><li>静かに先の細いピンセットで絨毛尿膜から子宮壁を取り除きます。これらは、子宮組織です。 </li><li> （3〜5ミリリットル）1×PBS溶液で満たされたペトリ皿に子宮組織を配置します。 </li><li>すべての移植部位が処理されるまで繰り返して、1.15を介して1.8を繰り返します。 </li><li>酵素消化の間に細胞の収率を向上させるためにいくつかの子宮、脱落膜、および胎盤組織を収集します。組織の量は、ごみの大きさに依存します。しかし、白血球の分離が組織の&gt; 2枚が必要です。 注：別の妊娠日に移植部位の解剖に関する詳細情報については、Investigatiにガイドの第二章で見られる画像を表示マウスの妊娠42の上。 </li></ol> 2.子宮、脱落膜、および胎盤組織解離<ol><li>適切な組織名を使用して、いくつかの滅菌2ミリリットルをコニカルチューブにラベルを付けて、氷上で酵素液を1000μlのバイアルを置きます。 </li><li>標識された2ミリリットルの円錐管に子宮、脱落膜、または胎盤組織の - （150から100mg）、1×PBS溶液で満たされたペトリ皿から、二枚を転送します。 </li><li>各2ミリリットルコニカルチューブに冷酵素溶液500μlを追加します。 </li><li>細かい滅菌ハサミで、それは細かくみじん切りされるまで酵素溶液に浸漬した組織を解離し始めます。時間が経つにつれて、懸濁液は乳白色の外観を開発します。このステップでは、サンプルの過剰な操作を防止するために、以上の2分を超えてはなりません。 </li><li>組織が解離された後、2ミリリットルコニカルチューブに冷酵素液の余分な500μlを添加します。 </li><li>氷上で2ミリリットルコニカルチューブを置きます。 </li><li>すべての組織が処理されるまで繰り返し、個々の組織に2.6を介して2.2を繰り返します。 </li><li> 37ºCでインキュベーターに氷からホモジナイズした組織（みじん切り組織+酵素溶液）サンプルを用いて、すべての2ミリリットルを円錐管に移し、穏やかな軌道撹拌（80 rpm）を行ってください。 35分 - 30インキュベートします。インキュベーターの温度はインキュベーション時間を開始する前に安定化していることを確認します。 </li><li>インキュベーション後、インキュベーターから解離組織と2ミリリットルを円錐管を除去し、それ以上の消化を防止するために氷の上に置きます。 </li><li>組織タイプに応じて滅菌50mlコニカルチューブにラベルを付けます。ふたを取り外し、滅菌セルストレーナー（100μmの孔サイズ）に置き換えます。 </li><li> 〜1×PBS溶液20mlをセルストレーナーを介して、円錐管が使用して2ミリリットルから解離した組織を注ぎます。組織の断片は、セルストレーナーに残る細胞懸濁液は、それを通過します。 </li><li>ジを洗いますセルストレーナーでssociated組織2 - トランスファーピペットを用いて1×PBS溶液20mlで3回。 </li><li>空の2ミリリットルを1×PBS溶液（1ml）で円錐管を洗浄し、セルストレーナーを介してコンテンツを注ぎます。 </li><li> 50mlコニカルチューブからの細胞ストレーナーを取り外し、蓋を交換してください。 4ºCで10分間、1,250×gでチューブを遠心。 </li><li>慎重に、細胞ペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。細胞ペレットは、単離された白血球との間質細胞が含まれています。 </li><li>ウシ胎児血清（FBS）を含まないRPMI培地1ml中の細胞ペレットを再懸濁します。穏やかに混合します。渦を使用しないでください。 </li><li> 5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブにきちんとFBSの500μlを添加して、ゆっくりと細胞懸濁液をオーバーレイ。 </li><li>細胞破片をPBS / FBSの界面に保持される生細胞をペレット化するために、室温でブレーキなしで1100×gで10分間遠心分離します。 </li><li>細胞ペレットを触れることなく、上清を吸引除去します。セルLペレットは、主に生細胞が含まれています。 </li><li> オプション：以下に説明するように、20％の飽和多糖溶液を使用し、単核細胞を濃縮します。 <ol><li> FBSを含まないRPMI培地1000μlの細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>製造業者の説明書に従って5mlのポリスチレンプラスチックチューブに20％飽和の多糖溶液1mlを加え、ゆっくりとこの溶液の上に細胞懸濁液をオーバーレイ。サンプルを重ねているが、細胞懸濁液を20％飽和多糖溶液を混合することは避けてください。 </li><li>ブレーキなしで室温で30分間、500×gで、スイングアウトローターで遠心します。これは、細胞を混合し、勾配が失われないようにブレーキをオフにすることが非常に重要です。単核細胞を、20％飽和多糖類溶液と1×PBS溶液との間のインターフェイスに記載されています。 </li><li>吸引し、上清を捨てます。細胞ペレットは、主に単核細胞が含まれています。 いいえテ：、生存性染色および細胞内染色を行い免疫表現を実行するには、手順3を参照して、唯一の生存性染色および細胞外染色を実行するには、手順4を参照して、分離された白血球の細胞培養を実行するには、手順5を参照して、実行するには、手順6を参照するには磁気細胞選別は、ステップ7を参照してください。 </li></ol></li></ol>修正可能細胞3.生存率染色<ol><li> 1×PBS溶液を1100μlの細胞ペレットを再懸濁します。マイクロピペットを用いて穏やかに混合します。 </li><li> 5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブに100μlの細胞懸濁液を転送します。 5ミリリットルポリスチレンチューブに1×PBS溶液400μlを添加します。このチューブは、組織の自家蛍光のためのコントロールです。ステップ3.5まで4ºCで保管してください。 </li><li>新しい5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブに細胞懸濁液の残りの千μLを転送します。生存性色素の1μLを加え、穏やかに均質化します。 4ºCで暗所で30分間インキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、千＆＃を追加181; 1×PBS溶液のL。手で穏やかに混合します。 </li><li>遠心分離機の両方の5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブは、4ºCで10分間1250×gで（3.2と3.3ステップ）。吸引し、上清を捨てます。 注：細胞ペレット（ステップ3.3）は、細胞ペレット（ステップ3.2）は、組織の自家蛍光のための対照となるステップ4で使用されます。 </li></ol> 4.免疫表現<ol><li>抗マウスCD16 / CD3250μlに細胞ペレットを再懸濁し（1希釈：FACS緩衝液で100 [0.1％BSA、0.05％アジ化ナトリウム、1×PBS溶液を、pHが7.4]）。静かに細胞懸濁液を混ぜます。渦を使用しないでください。 </li><li> 10分間4℃で暗所での5mlポリスチレンチューブ中の細胞懸濁液をインキュベートします。 </li><li>インキュベーション後、細胞外の細胞表面マーカーまたはアイソタイプ適合対照抗体と反応する各抗白血球モノクローナル抗体50μlの（抗体希釈液を検証する必要があります）を追加します。例えば、白血球亜集団を分析するために、抗MOを使用CD45、Ly6G、F4 / 80、CD11cの、CD49b、B220、CD3、CD4、およびCD8（ 表1）：以下の白血球の細胞表面マーカーと反応する抗体を使用しています。 </li><li>細胞外マーカーに対する抗体は、5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブに追加された後、穏やかに混合します。 4℃で30分間、暗闇の中でインキュベートします。 </li><li>このインキュベーションの間、固定緩衝液調製及び前ウォーム（脱イオン水で希釈し、1：5）37ºCに、必要に応じ。その使用が必要になるまで、暗闇の中で37ºCでバッファをしてください。 </li><li> 30分間のインキュベーション後、5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブにFACS緩衝液の500μlを添加し、穏やかに混合します。この工程は、細胞を洗浄し、未結合の抗体のいずれかの過剰を除去するために必要です。 </li><li> 10分間4℃で1,250×gでサンプルを遠心。吸引し、上清を捨てます。 注：細胞内染色を必要としない場合、細胞内染色が必要な場合は、ステップ5を参照の透過を行い、セル内その後、ウラルここ染色、および固定（ステップ4.8）に進みます。 </li><li>細胞ペレットに予熱した固定緩衝溶液500μlを添加し、37ºCで10分間暗闇の中でインキュベートします。 </li><li> 5ミリリットルポリスチレンプラスチックチューブにFACS緩衝液500μlの分注します。穏やかに混合します。 </li><li> 10分間4℃で1,250×gでサンプルを遠心。吸引し、上清を捨てます。 </li><li>各サンプルにFACS緩衝液500μlのを追加します。これらのサンプルは、現在、フローサイトメトリーによって分析することができます。最良の結果を得るためにすぐにサンプルを取得します。 </li></ol>修理不可能細胞5.生存率染色<ol><li>細胞外免疫表現した後、FACS緩衝液500μlの細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>サンプルのみを取得する前に4 &#39;、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール二塩酸塩（DAPI、200 / mlの）の1μlを添加します。 </li><li>フローサイトメーターを使用して、DAPIを追加した後、2分 - 1内のサンプルを可視化します。 </li></ol><ol><li>滅菌ヒュームフードの下にワークステーションを準備します。水浴を用いて37℃にRPMI培地を事前に温めます。 </li><li>細胞計数のためにFACS緩衝液1000μlの細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>製造者の指示に従って、自動細胞カウンターまたは血球計および0.4％トリパンブルー溶液を使用して生細胞の数を数えます。総生細胞数を記録します。 </li><li>遠心分離機FACS緩衝液を除去するために10分間、4℃で1,250×gで細胞。 </li><li>静かに2〜3回ピペッティングすることによって予め温めておいたRPMI培養培地500μlで細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>滅菌した24ウェルプレート中の細胞の所望の数をプレートし、37℃でインキュベートします。インキュベーション時間は、調査の質問によって決定されます。 </li></ol> 7.磁気細胞ソーティング<ol><li> MSカラム、磁気細胞分離、15：次の物質とクリーンワークステーションをセットアップしますmlのコニカルチューブ、30μmの分離前フィルタ、およびマルチスタンド。 </li><li> MACS緩衝液（0.5％BSA、2mMのEDTA、1×PBS溶液、pH7.2）で500μlの細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>自動セルカウンターまたは血球計および0.4％トリパンブルー溶液を使用して、全生細胞数をカウントし、記録します。 </li><li> 10分間4℃で1,250×gで細胞を遠心。吸引し、上清を捨てます。 MACS緩衝液の別の500μlのを追加します。 </li><li>製造メーカーの推奨事項に従って、磁気分離を行うに進みます。 </li><li>フローサイトメトリーまたは顕微鏡によって純度を決定します。 </li></ol>

著者らは、利害の対立を開示していません。

母体·胎児の界面に浸潤白血球の豊かさと表現型の特徴を記録する一貫性のあるデータの収集は、妊娠関連の合併症の病因を理解するために不可欠です。いくつかの技術は、妊娠31,38,39,43-46を通して母体胎児の界面でのマウス組織からの白血球浸潤の単離を容易にすることが記載されています。しかし、それぞれの技術は、異なる別の酵素を使用するか、またはそれらの組み合わせを酵素、異なる解離時間を必要とする、最も重要なのは、常に単離された細胞の生存率を指定していない、組織の量を指定し、しません。本明細書に説明されたプロトコルは、高い生存率母体·胎児の界面でのマウス組織から浸潤白血球の単離を可能にし、検証に市販の試薬、バッファの準備、組織量、およびインキュベーション時間についての詳細な情報を提供します研究室。 白血球の単離プロセスの最も重要なステップの一つは、組織の解離です。このステップは、機械的な均質化および/ ​​または表現型の特徴47で使用される細胞外タンパク質の完全性を変化させることができる酵素反応を伴います。本明細書に記載されるプロトコルは、胎盤...

妊娠中の免疫寛容は、独特の変化が母親の免疫システム内で発生する期間です。これらの変更は、母親が胎児、半同種移植片1を許容することができます。胎児が父親の主要組織適合遺伝子複合体（MHC）は2抗原発現、および胎児細胞が母体循環3において見出されています。しかし、胎児は4,5を拒否されていません。この謎は完全には理解されていません。 最新の仮説は、母体·胎児寛容は性交と受精6,7中に作成され、満期妊娠8-10を維持するために維持されていることを述べています。この母体·胎児寛容の内訳は、妊娠10〜16の初期および後期の段階で病気のメカニズムを考えられています。母体胎児の耐性は、Mac、T細胞（調節性T細胞、Th1細胞、Th2細胞、およびTh17細胞）を含む様々な白血球サブ集団の参加を含みますrophages、好中球、マスト細胞、NK細胞、及びNKT細胞、樹状細胞、及びB細胞、妊娠15,17-19を通して密度および局在のその変化。母親の免疫系が胎児性抗原20,21と相互作用する解剖学的部位-母体·胎児許容範囲は、母体·胎児の界面20で濃縮されています。 胎児の絨毛外栄養膜細胞が子宮粘膜22-24に侵入したときに母体胎児のインターフェイスは、胎盤形成中に作成されています。このインタフェースの胎児側には、胎児の周囲の膜は、胎盤内で特殊な上皮表面を作成し、合胞体栄養細胞が母体血22との直接接触を介して栄養交換を制御します。インターフェイスの母体側では、脱落膜は、マウスですべての脱落膜細胞の50％〜30％を占めて白血球の異種のプールを募集しています。 maternへの参加に加えて、アル免疫寛容、これらの細胞は、妊娠中の異なるプロセス、 例えば 、感染症、受精から生殖器官の保護、胚移植の7,25、脱落膜血管新生26、血管リモデリング24,27、栄養膜浸潤28、胎盤に重要な貢献者であります開発24,25、および、最終的には、分娩15,17。したがって、母体·胎児寛容に関与する白血球の研究は、妊娠関連の合併症の病因を解明するために不可欠です。 免疫組織化学および免疫蛍光法の使用は、直接可視化および子宮、脱落膜、または胎盤白血球29,30のローカリゼーションのためのデータを生成しているが、さらに、これらの組織31,32のそれぞれに白血球の特定のサブセットを明らかにしたフローサイトメトリー分析。さらに、フローサイトメトリー母校の密度および割合を決定するために使用されていますNAL-胎児のインターフェイス白血球33と外および細胞内タンパク質8-10,34の発現レベル。母体胎児の界面での白血球のフローサイトメトリー分析は、単一細胞懸濁液を必要とします。脱落膜、子宮、胎盤組織から浸潤白血球を単離するために、組織解離の二つの方法が使用されてきた：機械的および酵素。両方の方法は、これらの組織の細胞外マトリックス（ECM）の浸潤白血球の分離を可能にします。それはより少ないせん断力関連の損傷35と白血球のより高い収率を可能にするような酵素組織解離は、機械的組織解離よりも優れています。その結果、機械的な組織解離は、サンプルの変動性と不均一性を高めることができるプールの組織36を必要とします。しかし、機械的解離は、目的の抗原を酵素的解離または時によって変更することができるときに選択することができる細胞の機能興味のあるのは、（ 例えば 、NK細胞の細胞傷害性）を保持する必要がある35。 ECMを分解する特定の酵素を用いたタンパク質分解の使用は、機械的解離で観察された低い収率を排除します。いくつかの研究は、37 32コラゲナーゼ、トリプシンの使用を報告している、DNアーゼ31は、38ディスパーゼ、および種々の酵素32,39の商業カクテル。しかし、自然と異なる酵素の濃度と消化の期間は、細心の注意を払って定義され、免疫表現するために必要な細胞表面抗原エピトープの完全性の維持を確実にするために検証する必要があります。さまざまな表面構造は、多数のモノクローナル抗体によって認識される白血球の表面エピトープを除去するための悪名高いされ、トリプシンなどのいくつかの酵素を用いて、異なる酵素による破壊に差次受けやすいです。 本明細書の導入proteolytを用いる方法でありますICおよびコラーゲン分解酵素カクテルは、のAccutaseと呼ばれます。この酵素溶液は、母体胎児の界面でのマウス組織を解離まだ効率的ながら十分に穏やかであり、解離反応を停止し、他の解離試薬または血清の添加を必要としません。また、解離の時間を検証する必要があるが、それは上記の酵素40,41よりも堅牢で、供給として使用する準備ができていると。 組織の脱凝集の両方のタイプの組合せの利用は、得られた細胞の質および量を改善します。このように、いくつかの研究は、満足のいく結果31,32,37に機械的および酵素的解離の併用を実装しています。本明細書に記載されるプロトコルが確立され、我々の研究室で確認されました。それは強固な酵素分解に続いて穏やかな機械的解離の組み合わせを使用しています。このプロトコルは、の単離およびさらなる研究を可能にします母体·胎児の界面でのマウス組織における浸潤白血球（子宮、脱落膜、および胎盤）。フローサイトメトリー分析によって示されるように、以下のプロトコルは、細胞表面マーカー及び収率下流アプリケーションのための十分な生存可能な細胞の完全性を維持します。最後に、このプロトコルは、母体·胎児のインターフェイスを構成する種々のマウス組織の分析と比較のための細胞調製物の整合性を維持します。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Magentic Cell Separation</td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Cell Separator</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu;m pre-separation filters</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 円錐管</td><td>サーモフィッシャー</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>MACS バッファー</td><td>Militenyi Biotec</td><td>Laboratory 調製</td><td>物 (0.5% ウシ血清アルブミン、2mM EDTA および 1x PBS、pH 7.2)</td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>アキュターゼ酵素溶液</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>抗マウスCD16/CD32</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>533142</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス細胞外抗体</td><td>BD Bioscences/eBiosciences</td><td></td><td>表 1</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>フィッシャー</td><td>S227-500</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 生存率色素</td><td>Life Technologies</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>固定緩衝液</td><td>BD Biosciences</td><td>558049</td><td></td></tr><tr><td>FACS 緩衝液</td><td>BD Biosciences</td><td>ラボ調製</td><td>0.1% BSA, 0.05% アジ化ナトリウム, 1x PBS, pH 7.4</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液 0.4%</td><td>BIO-RAD</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Additional Instruments</td></tr><tr><td>Incubator with shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>Legend LXTR</td><td></td></tr><tr><td>真空システム</td><td></td><td></td><td>研究室を構築</td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td>Incubator 3307</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>プレシジョン</td><td>51221035</td><td></td></tr><tr><td>セルカウンター</td><td>BIO-RAD</td><td>TC20 自動セルカウンター</td><td></td></tr><tr><td>光学顕微鏡および蛍光顕微鏡</td><td>ツァイスおよびオリンパス</td><td>ツァイス LSM780およびオリンパス CKX41</td><td></td></tr></tbody></table>

母体·胎児界面におけるマウス組織からの白血球の分離

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

妊娠中の免疫寛容は、母親の免疫系が発達中の胎児を受け入れ、育成するために、特徴的な変化を受けることが必要です。この公差は、性交中に開始受精および注入中に設立され、妊娠中を通して維持されています。母体·胎児の寛容の活性細胞および分子メディエーターは、胎盤と子宮と脱落膜組織を含む母体胎児のインターフェイスとして知られている胎児と母体組織との接触部位に濃縮されています。このインタフェースは、間質細胞および浸潤白血球で構成され、その豊かさと表現型の特徴は、妊娠の経過とともに変化します。母体胎児のインターフェイスにおける浸潤白血球は、一緒に妊娠を維持局所微小環境を作成し、好中球、マクロファージ、樹状細胞、肥満細胞、T細胞、B細胞、NK細胞およびNKT細胞を含みます。これらの細胞間の不均衡、または任意inappropそれらの表現型でriate変化は、妊娠中の病気のメカニズムと考えられています。したがって、母体胎児のインターフェイスに侵入白血球の研究は、妊娠関連の合併症を引き起こす免疫機構を解明するために不可欠です。本明細書に記載の母体胎児の界面でのマウス組織から浸潤白血球を分離するために、タンパク質分解およびコラーゲン分解酵素カクテルと強固な酵素分解に続いて穏やかな機械的解離の組み合わせを使用するプロトコルです。このプロトコルは、十分に保存された抗原性および機能的特性を有する生存可能な白血球（&gt; 70％）の高い数の分離を可能にします。単離された白血球は、その後、免疫表現型、細胞選別、イメージング、免疫ブロット法、mRNA発現、細胞培養物、およびこのような混合白血球反応、細胞増殖、または細胞傷害性アッセイなどのインビトロの機能的アッセイを含むいくつかの技術によって分析することができます。

母体·胎児のインターフェイスからのマウスの組織の切開は、 図1に示されています。この手順は、移植部位（ 図1D）を含む、腹腔（ 図1A、B）、子宮角（ 図1C）を開くと、子宮組織の集合（ 図1E）、胎盤（ 図1F）、および脱落膜組織16.5で（ 図1G）が DPC。 図2は、単離されたマクロファージの形態を示している（F4 / 80 +）、磁気細胞選別を使用して16.5 DPCにおける脱落膜および子宮組織から採取しました。単離されたマクロファージは、サイトカイン（データは示さず）を放出する能力を維持します。脱落膜、子宮、胎盤から単離された生存細胞の収量は、 図3に示し、細胞生存率は全ての組織において70％以上である。 図4は、polymorphonucleを分析するためのゲーティング戦略を示しています<...

ここで説明されているのは、マウスの母体-胎児インターフェース(子宮、脱落膜、および胎盤)の組織の浸潤白血球を分離し、分析するためのプロトコルです。このプロトコルは、ほとんどの細胞表面マーカーの完全性を維持し、フローサイトメトリー分析を含むダウンストリームアプリケーションに十分な生存細胞を生成します。

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

この手順の全般的な目的は、マウスの母子界面に浸潤した白血球を単離することです。まず子宮、胎盤、および子宮内膜（eua）を採取することでこれを達成します。組織は酵素溶液中での機械的解離によって分解され、続いて酵素消化が行われます。得られた細胞懸濁液をろ過および洗浄し、次いで胎児牛血清密度勾配を用いて、目的の免疫細胞を非生存細胞などの細胞残渣から分離します。最終的に、単離された白血球を免疫表現型解析、細胞培養、またはセルソーティングに使用することが可能です。この手法を考案したのは、母体胎盤界面から白血球を単離するためのプロトコルを確立しようとした際、既存の報告手法では、我々が目的とする希少な免疫細胞の単離が困難であることに気付いたためです。本手順のデモンストレーションは、私の研究室のリサーチアソシエイトであるMile El Sanchez RodriguezとMarcina Hernandezが行います。母体胎児界面組織を採取するには、まず滅菌済み外科用はさみを用いて、下腹部の皮膚および筋肉組織を完全に除去します。次に、ピンセットを使用して、子宮と卵巣が見えるまで他の臓器をすべて脇に寄せます。その後、子宮を腹腔外に移動させます。UCTおよび各子宮角の子宮管接合部より遠位にある卵巣を確認します。次に、子宮管接合部を切開し、子宮血管を含む腸間膜から子宮角を分離します。子宮頸部で切除し、腹腔から子宮角を切り離します。次に、外科用剪刀を用いて、子宮頸管と子宮角下節の間を切開します。この際、子宮角が開かないように、子宮頸管の一部を付着させたままにします。その後、着床部位を水和させるため、子宮角と子宮頸管を10～15 mLのPBSを満たした大きなシャーレに浸します。組織から脂肪分を取り除きます。次に、鉗子で子宮角を固定します。植え付け部位間の領域を横方向に切断し、子宮から植え付け部位の1つを取り出します。続いて、その部位を固定し、胎盤および残存組織に隣接する子宮壁に小さな切開を加えます。胎盤と脱落膜の周囲を切り取り、組織が子宮壁と絨毛膜膜の両方から分離するようにします。その後、胎盤とそれに付着している脱落膜組織を、3〜5 mLのPBSを入れた新しいペトリ皿に移します。胎児を別のPBS入りのペトリ皿に移し、先端の細いピンセットを使用して、胎盤表面から白灰色の脱落膜組織を慎重に剥離します。胎盤および子宮内膜（ECI）組織の完全性が維持されるよう注意しながら、胎盤とECI組織を、それぞれ個別にラベルを貼ったPBSを満たした2つのペトリ皿に分けます。次に、精密ピンセットを使用して、絨毛膜尿膜の子宮壁を慎重に除去し、これらの子宮組織をPBSを満たした新しいペトリ皿に入れ、組織を機械的に解離させます。次に、100～150 mgの子宮盤および胎盤組織を、個別にラベルを貼った2 mLコニカルチューブにそれぞれ移します。各チューブに、氷冷した酵素溶液1を500 µL加えます。その後、滅菌済みの鋏を用いて、懸濁液状になるまで各組織を2分以内で機械的に分散させます。乳白色に濁るまで待ちます。各チューブに冷やした酵素溶液をさらに500 µLずつ加え、氷上に置きます。その後、すべての組織を37 °Cで80 RPMの緩やかなオービタルシェイキング条件下でインキュベートし、30〜35分後にチューブを氷上に置いて消化を停止させます。次に、各組織スラリーを100 micronのストレーナーでろ過し、個別にラベルを貼った50 milliliterのコニカルチューブに回収します。その後、2 milliliterのチューブとストレーナーを20 millilitersのPBSで2〜3回洗浄し、すべての細胞を回収してください。すべての細胞のろ過が完了したら、遠心分離を行い、ペレットを乱さないように注意して上清を吸引除去します。単離した白血球およびストローマ細胞を、ボルテックスせずに1 milliliterのRPMI培養培地で緩やかに再懸濁させてください。次に、各組織について、5 mLのポリスチレンチューブに500 µLのウシ胎児血清を加え、細胞懸濁液を血清の上にゆっくりと重層します。最後に、すべての細胞を重層し終えたら、中断することなく遠心分離を行い、細胞ペレットに触れないように上清を吸引します。これらの画像は、子宮接合部および子宮組織から単離したF4/80陽性マクロファージの形態を示しています。接合後16.5日における母体および胎児の界面組織からの細胞が示されています。この方法で分離した後の生存率は70%を超えており、好中球、マクロファージ、T細胞、NK細胞、および樹状細胞の集団が含まれています。特に、CD11cを共発現するマクロファージの高い割合が含まれており、母体胎児界面組織から分離された白血球亜集団が確認されます。また、B細胞、CD4陽性T細胞、CD8陽性T細胞、およびこの密度プロットで観察されるように、CD3陽性CD4陰性CD8陰性T細胞も分離されています。本手順を行う際は、組織および酵素カクテルを氷上で保持して適切な温度を維持すること、また、本手順に従った消化操作中に組織を過剰に操作しないことが重要です。また、免疫表現型解析、細胞培養、セルソーティング、DNA/RNA抽出などの他の手法も実施可能です。このビデオを視聴することで、母胎界面である子宮および胎盤から浸潤白血球を単離する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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学ぶマウスの母体・胎児界面からの白血球分離法。機械的解離と酵素処理により、子宮・胎盤・脱膜組織から生存率の高い免疫細胞を単離し、フローサイトメトリーなどの下流解析に利用可能です。

母体·胎児界面におけるマウス組織からの白血球の分離

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