原子間力顕微鏡イメージングおよびサポートされている脂質二重層のフォーススペクトロスコピー

次の実験の全体的な目標は、原子間力顕微鏡を使用して相分離膜の物理的特性を画像化し、調査することです。これは、最初にジリオ、ホスファチジルコリン、fgo、ミエリン、およびコレステロールを2対2対1の比率で混合して、相分離脂質混合物を形成することによって達成されます。次に、原子間力顕微鏡を用いてリポソーム懸濁液をMICA表面に沈着させることにより、支持脂質二重膜を調製します。

次に、二重層の表面をスキャンして、高さなどの構造的特徴を測定できる地形画像を作成します。次に、力分光法を二重層の特定の領域で行い、二重層の物理的特性、特にブレークスルー力と膜の厚さを調査します。最終的に、結果はFM画像と力曲線に基づいて、異なる脂質相間の特性の違いを示しています。

蛍光顕微鏡法などの既存の方法と比較した場合のこの手法の主な利点は、FMがサンプル上でプローブできる分解能の向上と追加の特性です。この方法は、生体膜の構造やそのような膜に埋め込まれたタンパク質など、生物物理学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。さらに、メンブレンの物理的特性を調べ、メンブレン活性剤の組成の変化や追加によってこれらの特性がどのように変化するかを監視することもできます。

一般に、この方法に不慣れな人は、サンプルの壊れやすい性質のために苦労します。これは、サンプル調製、カンチレバーの取り扱い選択、FMイメージングおよび分光法条件に影響を与えます まず、DOPC、スピノ、ミエリン、コレステロールを所望の濃度でクロロホルムに溶解することから始めます。次に、18.38マイクロリットルのDOPC、17.1マイクロリットルのシンミエリン、11.3マイクロリットルのコレステロールを組み合わせて、1ミリグラムの総脂質とそれぞれ2対2対1のモル比の溶液を作ります。

溶液をボルテックスして混合し、窒素などの不活性ガスで乾燥させた後、さらに真空下で1時間以上乾燥させます。次に、乾燥脂質を100マイクロリットルのPBSに溶解して、1ミリグラム/ミリリットルの濃度にします。渦巻きして約1分間激しく混合します。

複数の層状小胞を含む曇った懸濁液を得るため。バイアルの側面に脂質フィルムが付着していないことを確認してください。10マイクロリットルのマルチ層状脂質懸濁液を取り、150マイクロリットルの支持脂質二重層緩衝液を追加します。

次に、溶液を混合し、それを小さな2ミリリットルのキャップ付きガラスバイアルに移し、パラフィルム超音波処理で密封します。混合物を室温で浴中で10分間超音波処理する。この間、溶液は透明になり、直径約50ナノメートルの小さなユニまたは小胞が生成されます。

ガラスカバースリップを水で洗い、続いてエタノールで洗い、風乾させます。次にマイカディスクを取り、粘着テープで外層を剥がします。透明な光学的に透明な接着剤を一滴垂らして、MICAディスクをカバースリップに取り付けます。

次に、真空グリースを使用してプラスチックシリンダーをMICAに取り付け、漏れがないことを確認します。リポソーム溶液全体をマイカに直接ピペートし、さらに140マイクロリットルの支持脂質二重層緩衝液を追加して、300マイクロリットルの容量に到達します。次に、0.9マイクロリットルの1モル塩化カルシウム溶液を添加して最終濃度3ミリモルのカルシウムに到達し、サンプルを摂氏37度で2分間インキュベートし、次にこのステップで摂氏65度で少なくとも10分間インキュベートし、支持した脂質二重層緩衝液を摂氏65度に予温します。

必要に応じてバッファーを追加し、サンプルが乾燥しないようにします。サンプルチャンバーをカバースリップで覆うことも、サンプルの水分補給を維持します。次に、サンプルをあらかじめ温めた担持脂質で層緩衝液で10〜15回穏やかにすすぎ、カルシウムと未融合の小胞を取り除きます。

洗濯手順後に二重層が乾燥しないように、洗濯手順中は特に注意してください。サポートされている二重膜を室温まで冷却します。原子間力顕微鏡で測定する前に、原子間力顕微鏡またはFMをセットアップして、溶液中の脂質二重膜のイメージングを行います。

メーカーの仕様に従った接触モードを使用して、サンプルにバッファーを添加し、実験全体を通してバッファーに浸漬します。サンプルをA FMステージにマウントし、すべての防振モジュールがオンになっていることを確認します。システムが平衡化して熱ドリフトが減少するまで、少なくとも15分間待ちます。

次に、接触するまで、柔らかいFMカンチレバーチップを使用して、接触モードでサンプルにアプローチします。二重膜は非常に壊れやすいため、接触モードイメージング中はA FMチップの設定値を最小限にして、力を最小限に抑え、サンプルとの接触を維持しながら熱ドリフトを補正します。イメージングが完了したら、各スキャンラインを多項式レベリング関数に適合させて画像を処理します。

メンブレンとの接触を失ったスキャンのライン除去を実行します。A FM製造会社の独自のソフトウェアを使用して、電気信号の力測定への正しい変換を決定するために、メーカーのプロトコルに従ってカンチレバーを校正します。二重膜の領域をイメージングした後、二重層内の5ミクロン×5ミクロンの領域を選択して力分光法を実行します。

その領域の 16 x 16 グリッドでフォースカーブを取るように AFM を設定します。これにより、領域ごとに 256 のフォースカーブが生成されます。次に、Z ピソの変位を 400 ナノメートルに設定します。これにより、Zピエゾの最大移動範囲が決定され、測定の合間にカンチレバーがサンプルから完全に後退するようになります。

次に、アプローチ速度を毎秒800ナノメートルに設定し、リトラクト速度を毎秒200ナノメートルに設定します。また、この場合は各力曲線の最大目標力を 12 ナノ ニュートンに設定します。すべてのパラメータを設定したら、A FMソフトウェアの実行ボタンを押してフォースカーブを取得します。

各条件に対して少なくとも 500 個の力曲線を取得して良好な統計を確保し、値のヒストグラムをプロットし、ヒストグラムをガウス分布に当てはめて、分布のピークと幅を取得します。この研究を用いた脂質組成により、2つの主要な膜領域が形成されます。fing、ミエリン、コレステロールで構成される液体秩序領域と、DOPCを主成分とする液体無秩序領域があります。

A FMイメージングからの高さプロファイルは、高さプロファイルを見ることにより、膜構造に関する重要な情報を提供できます。二重膜の厚さは、膜の欠陥の存在を利用して測定できます。高さマップは、順序フェーズと無秩序フェーズの高さの差を測定するためにも使用できます。

力分光モードから導出された力曲線は、ここに示すように、力曲線のピークで力の値を分割することにより、ブレークスルー力を測定するために使用されます。さらに、膜の厚さは、力曲線のピークから距離値を引いて距離値にすることで導き出すことができます。力曲線が再び上昇し始めたら、この手順を試行している間、Bレイヤリングソリューションを保持し、FMアセンブリを常に監視して、チップへの熱ドリフトとD蓄積の影響を補正することを覚えておくことが重要です。

共焦点蛍光顕微鏡などの他の方法を実行して、膜ダイナミクスなどの追加の質問に答えることができます。このビデオを見た後、supported by layersを準備し、FMを使用してこれらの二重層の物理的特性を画像化および調査する方法を十分に理解できるはずです。