Name: の実装インビトロ薬剤耐性アッセイ：臨床的に関連性のメカニズムを暴くための可能性を最大化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: 学ぶインビトロ薬剤耐性アッセイの手法で、細胞株を用いて耐性機構を迅速に同定する方法です。全エクソームシーケンスと機能アッセイにより、臨床的に関連する変異を発見し、がん治療戦略の改善に貢献します。

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著者は、原稿準備中のフィードバックに対してH3 Biomedicineの同僚に感謝したいと思います。

1.目的の化合物（複数可）のためのGI 50の評価 <ol><li>適切な播種密度を評価する目的の細胞株の成長曲線（複数可）を生成します。播種後の様々な時点での細胞数をプロット（日2、4、6、8）0日に対してこれは、目的の細胞株の相対的増殖速度を提供し、そのような初期播種密度を評価するために使用されるべきです合流は7日以内に、96ウェルプレートに達していません。 </li><li>成長曲線が決定されると、GI 50を評価するために、細胞培地100μlに不透明、透明な底の96ウェルプレート中の細胞の適切な数のシード。 1.1で使用され、決定された細胞株に基づく細胞数を播種。一般的には、24時間〜の倍加時間、 例えば 、HCT116と急成長している細胞株のシード3×10 3細胞 。 <ol><li>アッセイプレート（日-1）を準備します。培地Iの100μl中の所望の密度でアッセイプレートのために、種子細胞nは青で網掛けウェル（ 図1）。ウェルズは、専用のメディアが含まれている白で強調しました。 </li><li>コントロールプレート（日-1）を準備します。コントロールプレートには、独立した96ウェルプレート中の培地を100μlのステップ1.2.1のように細胞の同じ密度をシード。この「0日」の読み取りは、分析される化合物の細胞増殖抑制/細胞毒性性質（ 図2）を解釈するのに役立つだろう。 </li></ol></li><li>次の日（0日）、コントロールプレートをお読みください。 RTに発光細胞生存性試薬（製造業者の指示に従って緩衝液と混合のCellTiter-グロ基質）を平衡化し、均一な溶液を得るために、コンテンツを反転させて穏やかに混合します。セル/メディアミックスの100μlに試薬を80μlを添加して、細胞溶解を誘導するために30分間の内容を振ります。 <ol><li> 560 nmでの0.1〜1.0秒、検出波長の露出に設定ルミノメーターで記録しルミネッセンス。 </li></ol></li><li> （化合物を試験化合物を追加します。アッセイプレート（0日））に興味のあります。 10濃度（化合物および1 DMSOのみ、化合物プレートを含む9の希釈）の合計200倍最終濃度でDMSO中の化合物の4段階希釈：1にします。最初の出発点として、0.03μMの200X最低用量と2,000μMの最高用量（最終容量200μl）を目指します。 </li><li> 10倍の最終濃度（最終容量100μlの、中間プレート）での化合物媒体ミックスを作るために培地に連続希釈した化合物を追加します。アッセイの3日目で使用するために-20℃で化合物プレートを保管してください。最高用量は、10μM（ 例えば 、列B、CおよびD、0日目）（ 図1）であるように、三連で細胞に化合物媒体ミックス10μlのを追加します。 37℃で3日間のアッセイプレートをインキュベートします。使用後の中間プレート（複数可）を破棄します。 </li><li> 3日目に、1.4で製造した化合物プレートを使用して、400μlの1×化合物媒体ミックスを準備します。メディアを取り出し、自動に乾かすためにアッセイプレートを反転残留メディアを除去するための2〜3倍にペーパータオルをclaved。青色で陰影ウェルに化合物/メディア（100μl/ウェル）を追加し、蒸発させた （図1）を防止するために、ウェル周囲にメディアの100μlを添加します。さらに3日間、37℃でアッセイプレートを再インキュベートします。 </li><li> 6日目に、ステップ1.3で説明したように発光読み取りを行うことにより、生存細胞の相対数を評価します。 </li><li>化合物の静的/毒性の性質を評価するために、0日目の読み取りを使用してください。細胞増殖抑制剤は、細胞周期停止を誘導するのに対し毒性剤は、アポトーシスを誘導します。化合物（6日目の読み取りは、0日目読書の下にある）有毒である場合、抵抗アッセイのためのGI 50、およびGI 50×5の濃度を選択することを検討してください。化合物が静止状態（D0の読み以上）を誘導する場合は、GI 100と抵抗アッセイのためのGI 100 X5（ 図2）を検討してください。 </li></ol> 2.薬剤耐性アッセイのセットアップ<ol><li>ウィット作業した場合haの細胞増殖抑制剤、耐性アッセイのために150 mm 2の組織培養皿（容量= 30mL）中30-40％のコンフルエンスに種子細胞。毒性物質で作業する場合は、70〜80％コンフルエンスでシード。 </li><li>無傷のミスマッチ修復（MMR）機構を保有する細胞株については、発癌物質N-エチル-N-ニトロソウレア（ENU）を用いて37℃でステップ2.1 O / Nから細胞をインキュベートします。ゲノムの不安定性を向上させるために50 mg / mlのENU（終濃度50μg/ ml）のストック溶液を30μlの細胞を扱います。欠陥MMR（ 表2および3）を有する細胞株について、ENUまたは他の発癌物質による治療が必要ではないかもしれません。 <ol><li>他の細胞株では、マイクロサテライト不安定性12を使用して、NCI基準によってMMR欠損を決定する、またはマイクロサテライト不安定性アッセイまたはMMR遺伝子13-15のエピゲノム/ゲノムプロファイリングを使用して公開特性評価に基づいて。 </li></ol></li><li>の試験化合物（複数可）で細胞を処置しますステップ1.8で決定された濃度での関心。典型的な3日間の生存率アッセイ10で細胞死を引き起こす毒性の高い化合物では、低用量の治療（すなわち、GI 50）で開始し、漸増堅牢になるまで2〜3週間毎の化合物の濃度（GI 50の倍数）を増加させます抵抗が観察されます。メディアを補充し、すべての3 Dを配合。 </li><li>選択が開始された後耐性クローンが出現するまで、3〜4日ごとにメディア/化合物の組み合わせを変更します。処理した細胞はDMSO処理対照細胞の急性期治療に比べて、薬物治療中に大きく成長/生存性を示したときに定義することにより抵抗値が出てきます。 </li></ol> 3.単一細胞クローンの単離<ol><li>細胞の生存能力のあるクラスタに対して位相差顕微鏡（倍率40倍）を用いて培養皿を調べます。 </li><li>マーキングペンで皿の底にマーク満足クローン。平均サイズであるクローン（大きなコロニーを選んでもよいです複数のセルから発信）と、他のコロニーから単離しました。ステップ3.3で概説2つの方法のいずれかを使用してクローンを選択してください。 </li><li> アプローチ1：ピペッターを使用した（図3） <ol><li>増殖培地を取り出して、任意の浮遊細胞を除去するために、1×PBSですすいでください。 </li><li> （ピペットに接続されている、好ましくはP200）ピペットの先端でクローンを「選ぶ」へのガイドとして、ブラックマークを使用してください。 </li><li> （細胞の最適な回復を可能にするために、半化合物濃度で）新鮮な培地200μlで48ウェルプレートにクローンを転送します。 </li><li>細胞は、200μlの新鮮な培地/理想的な化合物濃度を追加する前に、2〜3日で回復できるようにします。 </li><li> 3〜4日ごとにメディア/化合物を変更し、クローンを拡大していくために続けます。 </li></ol></li><li> アプローチ2：クローンディスクを使用した（図3） <ol><li>ステップ3.2で説明したようにクローンをマーク。 </li><li> 5 mlの0.25％のTを含む10cmの組織培養皿に3 mmのクローニングディスクを置きrypsin-EDTA 2分間。 </li><li>ディッシュから培地を吸引は、耐性クローンを含有し、滅菌使い捨てピンセットを用いてトリプシン浸しクローニングディスクでクローンを重ねます。 </li><li>クローンは37℃のインキュベーター中で、プレートを持ち上げ方法を簡単に応じて、1〜2分間のままにしておきます。 </li><li>滅菌ピンセットを使用してディスクをクローンピックアップし、200μlの新鮮な培地と化合物の半分の濃度で48ウェルプレートに移します。 </li><li>ピペットは、上下優しくクローニングディスクから細胞を除去し、37℃（ウェル中にディスクをクローンまま）でO / Nインキュベートします。 </li><li>翌朝は、48ウェルプレートからのクローンディスクを削除し、200μlの新鮮な培地/化合物（半理想的な化合物濃度）でウェルを補充。 </li><li> 3日後、化合物の理想的な濃度でメディアを補充します。 </li><li>メディア/化合物を3〜4日ごとに変更し、クローンを拡大していくために続けます。 </li></ol></li></ol> 4. Rの程度を評価単離されたクローンのesistance <ol><li> 10~20個のコロニーが展開されると、抵抗の度合いを評価するために、手順1で説明したように、GI 50曲線を生成します。 </li><li>常に選択プロセス中に、DMSOで処理した対照集団を含みます。これは、抵抗値のスペクトルが大きいことが起こっている可能性が非常に高いです（他は完全な耐性を示すのに対し、いくつかの部分を示します）。両群間で異なる場合があり耐性機構としてこれらの各クラスから数個のクローンを収集します。 </li></ol> 5.次世代シーケンシング<ol><li> 15ミリリットルで2万個の細胞（コントロールおよび耐性クローン）（5分間500×gで）をスピンダウンのgDNAおよびRNAコレクションの両方の円錐バイアル（したがって、2×2百万円）。 </li><li> 1×PBSで2回洗浄し、分離のための準備ができるまで-80℃でペレットを凍結します。 </li><li>製造業者のプロトコルに従ってRNAまたはのgDNAを単離するために、市販の抽出キットを使用してください。 </li><li>次世代シーケンシングのためのサンプルを提出しますベンダーのプロトコル10を使用 。 </li></ol> 6.バイオインフォマティクス試料の分析（全体exomeシーケンシング） <ol><li>プリプロセスシーケンスデータのベストプラクティスのDNA配列のパイプライン16によります。 <ol><li>マッピングされたすべてのは、広帯域無線接続17を用いて、ヒトゲノムGRCh37を参照するように読み込みます。 Samtools 18で圧縮されたBAM形式に圧縮されていないSAMフォーマットされたアラインメントを変換します。ソートアライメントはによってSamtoolsとの調整。ピカードを使用して、読み取りグループを追加します。 （BWA、Samtoolsとピカードコマンド特定については、補足テキスト1、ライン1-4を参照） </li><li>マークは、すべての重複は19を設定ピカールツールからMarkDuplicatesコマンドを使用して読み込みます。インデックスSamtoolsでこのファイル。 （補足テキスト1行5-6） </li><li>すべての読み込み全体のミスマッチ塩基を最小限に抑えるために、インデルリアライナ20を使用して、小さな挿入または欠失を保有する領域に局所的に読み取り、再調整。 （補足テキスト1行7-8） </li><li>さらにaccuracを改善するために、バリアント呼び出しのyは、経験的に基本品質スコアの再キャリブレーションツールを使用して、基本品質スコアを再調整します。基本品質のキャリブレーションツールは正しい初期品質スコアだけでなく、読み、グループ、マシンサイクル、基本位置、およびジヌクレオチドコンテキスト（+前回の現在の塩基）を含むいくつかの機能の口座共変動を考慮に入れるべきではないだけ。ピカールPrintReadsと再校正BAMを生成します。 （このステップのための特定のコマンドについては、補足テキスト1行9-10を参照してください） </li><li>手順を繰り返し6.1.1配列を決定し、各サンプルについて（補足テキスト1行1-10）6.1.4を通じ。 </li></ol></li><li> tool19、21-23を呼び出しペアのバリアントを使用して、各クローン中の一塩基変異（SNV）を識別します。各クローンを配列決定のために、実行してペアリングバリアントは、マッチした「通常」として親クローンを使用して呼び出します。 （補足テキスト1行11） </li><li>再発をフィルタリングし、高品質の変異体およびバリアントの注釈ツール24と注釈のために準備します。 VAをDeprioritizeすべての耐性クローンに共通していないriants。 （補足テキスト2でRスクリプトを参照してください） </li><li>注釈ツール25、26を有する変異体を注釈を付けます。多くの変異型注釈ツールは、データがアップロードされ、リモートサーバで処理されることを可能に付随するWebアプリを持っています。 </li><li>高機能な影響を有することが予測される変異型を優先させる機能的影響の予測ツール27-29を使用してください 。バリアントの注釈と同様に、いくつかのツールは、Webインターフェイスを介して機能的影響の予測に利用できます。 </li></ol>

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細胞株（複数可）の選択：遺伝的状態とゲノム不安定性の特徴付け 確かに、首尾よく臨床的に関連する耐性機序の解明において単一の最も重要な要因は、最初の細胞株の選択があります。二つの要因が考慮されるべきです。まず、病気の定義遺伝形質を保有する同系統/サブタイプの細胞株（複数可）を選択することを目指して（ 例えば 、黒色腫におけるBRAF V600E）。適応症33,34の様々な両方の細胞株30-32とプライマリ/転移腫瘍に対する公開さトランスクリプトームおよび変異データの尋問は、選択プロセスを容易にします。臨床的に関連する遺伝子変異を有する細胞株の同定は、いくつかの例では、理想的であるが、これは、このようなスクリーニング方法の難しさや長さなどの要因に利用可能な細胞株または可能性の欠如のために可能ではないかもしれません。 35を加速することができることを期待して、DNA MMR機構における速い増殖速度および欠損して利用することができます。 COSMICデータベースに基づいて、いくつかの候補の細胞株は、二つの頻繁に変異したMMR遺伝子の一つ、MSH2もしくはMLH1（ 表2および3）に欠陥が存在します。あるいは、目的の細胞株は、このようなアルキル化剤のような物理的またはDNA反応性化学変異原でMMR、急性治療において軸受欠陥が存在しない場合はN -エチル- Nの -nitrosourea（ENU）はゲノム不安定性を増強するために使用することができます。両方のアプローチは、S大幅かもしれないが耐性クローンを達成し、フォローアップシーケンシングをする時間をホルテン、厳しい機能試験は、非機能、より多くのように候補遺伝子で実行する必要があり、乗客の変異が出現する可能性があります。 SNVsは、機能的に関連する変異を同定するための機会を最大化するように命じランクすることができます。まず、独立したクローンで再発されているものの変異を選択すると、これらの変異は、抵抗のドライバです可能性が増加します。イベントに反復突然変異が同定されていない、薬剤の作用機序に合わせSNVsに着目し（例えば、薬物標的または薬物標的の既知の下流エフェクター）が有意義であり得ます。最終的には、金の標準は常に薬剤感受性親細胞における異所性cDNA発現によって候補SNVsの抵抗性付与活性の実験的な評価です。 RNA配列決定の対のDNA 耐性クローンを、DNAおよび/またはRNAを生成した後必要に応じて配列決定することができます。 DNA配列決定、exomeまたは全ゲノムシーケンシングのいずれかが、生殖細胞系列などのSNP、インデルとコピー数変異体細胞変異体の同定を可能にします。よりコストに優しいexomeシーケンシングは、生成に焦点を当てているのに対して、既知のコード領域から読み込み、全ゲノムシーケンシングは、エンハンサーまたはmiRNAの36のような非コード要素に変異の同定を容易にすることができるゲノム全体のための配列データを生成します。遺伝子発現データは、DNA配列決定の間に測られていないので、それは機能的なドライバである可能性がある突然変異（単数または複数）を予測することは困難です。この点で、RNAの配列決定は、より高価なものの、この利点を提供しています。突然変異通話のみ発現されるRNA種に実行されるという事実は、目的の変異が機能ドライ​​バとすることができる可能性を高めます。フォローアップ機能テストのための突然変異のより集中調査を可能にすることに加えて、RNA配列決定もまた、抵抗の強力なドライバを果たすことができる遺伝子融合を含む遺伝子発現の変化、選択的スプライシングおよび新規なキメ​​ラRNA種を同定することができるという追加の利点を提供しています。 バイオインフォマティクスパイプライン 例のコマンドは、説明のために提供されているが、より詳細なドキュメントやチュートリアルは研究所16ブロードから入手可能であり、NGS解析を開始する前に、徹底的に読まれるべきです。次のコマンドは、すべてのツールと​​参照データがプリインストールされているシステム上のUNIXシェル環境用に設計されています。これらのコマンドは、FASTQファイルを含むペアエンドシーケンスは、「親」と「耐性」ベンダーから受信した「データ」ディレクトリに配置されているという名前の、二つの試料からの読み取りを想定しています。ほとんどの場合、これらのコマンドは、適応するか、追加のコマンドライン引数を使用して、特定のアプリケーション用に最適化uments（例えば、BWAコマンドに「-t 8」を追加すると8のCPUコア全体でマルチスレッド動作が可能になります）。 BAMファイルごとに1つだけのサンプルが特定のツールのファイル形式の要件に準拠するために、存在したとしても（生物学的サンプルにアラインメントを割り当てる）リードグループは、多くの場合、BAMファイルに追加する必要があります。グループパラメータRGID、RGSM、RGPL、RGPUを読み、RGLBは、任意のサンプル名を表す文字列、シーケンシングプラットフォーム、およびライブラリ戦略することができます。 in vitroでの対インビボのアッセイ インビトロ選択により同定いくつかの耐性機構を臨床的に関連することが確認されているが、メカニズムが臨床的耐性の関連又は優勢なメカニズムとして機能しない可能性が存在します。この理由の一つは、治療に対する耐性を駆動における微小環境のために必須の役割、実験プロトコル/セットアップdの欠けている成分を含んでいてもよいですこれまでiscussed。実際、いくつかの研究は、腫瘍細胞が間質37,38によって与えられる抵抗の先天的なメカニズムを示唆している間質細胞の存在下で培養した場合、腫瘍細胞を死滅させることができる抗がん剤が無効にされていることを示しています。そのような間質誘導性の獲得抵抗性のメカニズムを同定するために、in vitroでの共培養またはインビボ腫瘍の耐性アッセイでの実行を検討することができます。前者アッセイは非常に複雑であるため、多くの人が抵抗を運転中に間質の潜在的な役割に対処するための薬剤耐性腫瘍異種移植片を生成するに頼ってきました。このような研究は、間質は確かに後者において役割を果たし得ることを示唆し、in vitroでの選択に対する抵抗の両方に同一5とユニークな39のメカニズムを明らかにしました。しかし、人はそのような耐性腫瘍を発生させるために取ることができる時間の長さとフォローアップゲノム解析-complexitieの複雑さを意識なければなりません腫瘍内の分子や細胞の不均一に起因するの。 目標識別 薬剤耐性のメカニズムを解明することに加えて、このNGSベースのゲノムプロファイリングのアプローチは、化学プローブの細胞標的を同定するために適用することができます。歴史的には、複数の公平な方法は、定量的プロテオミクスに結合されたアフィニティー精製、酵母ゲノムの方法のRNAiスクリーニング、および計算推論40に近づく含む生物学的活性を有する低分子量化学物質の細胞の作用機序および標的を同定するために使用されています。表現型耐性細胞集団のNGSベースのゲノムやトランスクリプトームプロファイリングを使用して、薬剤耐性機構の解明の拡張として、独特の再発一塩基変異（SNVs）または抵抗を可能にする発現変化の識別は、化合物の機能的な細胞標的への洞察を提供することができます。 T彼が観察耐性メカニズムのサブセットは、小分子の直接の標的タンパク質をコードする遺伝子内の反復性の変異を含むことができるという考えに基づいています。最近、いくつかの報告は、特に小分子プローブ9,10の細胞標的を明らかにするために、プロファイリング大規模な癌細胞株の感受性などの他のアプローチと組み合わせて、アプローチの有用性を検証しました。

堅牢なシーケンシング技術と改良されたデータ分析ツールによる腫瘍ゲノムの詳細な分子特性は、特定の癌の型1,2内のキー遺伝子変異の発見につながりました。そのようなHER2、BCR-ABL、EGFRおよびALKのようなこれらの遺伝子病変を目的とした標的治療薬の開発は、かなりの患者1,2の生活の質を改善しています。抵抗値が最終的に出てくるしかし、この方法の特異性にもかかわらず、ほとんどの単一療法に対する臨床応答は、サブ最適でした。近年、著しい進歩が標的治療に対する耐性の分子的基盤を理解する上でなされました。興味深いことに、それは抵抗の顕著なメカニズムは永続的な目標/経路の活性が関与することが明らかになってきています。その一例として、アンドロゲン受容体（AR）は、前立腺癌のエンザルタミド治療は、AR自体に変異を活性化維持の充実につながる標的としたARシグナルOUTP阻害剤3-5の存在下でのUT。この知識は、1に積極的なキャンペーンにつながっている）エンザルタミド耐性のPCa 3にWTおよび変異AR機能の両方を抑制し続け、2）治療的介入のための標的とすることができるARシグナル伝達の潜在的な下流のノードを識別することができる第三世代のアンタゴニストを開発。同様に、EGFR、BRAFおよびABLを対象としているような阻害剤の他のクラスへの耐性は、多くの場合、元の中毒キナーゼ経路1を再活性化変異につながります。 抵抗は必然的に迅速に光にこれらのメカニズムをもたらすための方法を開発し、多くの患者に現れるという知識と効果的なフォローアップ療法の開発が可能になります。広く使用されている一つの方法は、Dの影響を受けやすいことがあり、遺伝的病変における濃縮度/枯渇を識別するための相対的な治療未経験または感受性腫瘍に対する臨床難治性腫瘍のゲノム解析を分析することですラグ発見。その約束にもかかわらず、迅速な発見を妨げ、このアプローチには2つの主要な債務があります。まず、ゲノムの質問のために腫瘍材料へのタイムリーなアクセスを得るためには、硬化療法が移動する際に重要なハードルとして機能することができます。腫瘍が重要な腫瘍内異質6,7を提示することができるので、第二に、耐性の設定で遺伝子損傷の無数のデコンボリューションは困難な場合があります。 これらの課題を踏まえ、耐性機構の前臨床発見への依存が高まってきました。このアプローチは、従来の治療の前に、または耐性の発現以下のいずれかのこれらのメカニズムを負担した患者における代替臨床管理戦略を案内することができる臨床試験1に著名な耐性機構の同定を可能にすることができます。 広く使用されているそのような前臨床発見ツールは、公正な機能RNAiスクリーニングを適用することです。試験を受験しますPLE、ウィテカーらは、NF1の損失は持続MAPK経路の活性化8を通して、RAFおよびMEK阻害剤に対する抵抗性を媒介することを識別するために、ゲノム規模RNAiスクリーニングを適用しました。これらの知見は、NF1における機能喪失型変異はRAF阻害に対して本質的に耐性であるBRAF -mutant腫瘍細胞および活性化8ベムラフェニブに耐性メラノーマ腫瘍において観察されたように、臨床的に関連することが見出されました。しかし、このアプローチの成功にもかかわらず、多くの臨床的に関連の目標は、多くの場合、おそらくこのアプローチの機能喪失バイアスに、識別されていません。 これとは対照的に、耐性機構の前臨床発見にはあまり偏ったツールは、NGSベースのゲノムやトランスクリプトームプロファイリングと結合された目的の化合物への長期の暴露による耐性細胞株の生成を伴います。このアプローチは、成功した自発的な識別するために、いくつかのグループによって実装されています再発の一塩基変異体または抵抗5,9,10を有効に発現の変化。例えば、ARにおける再発F876L変異は、最近試験管 3-5の前クリニック4でこの変異を同定するためにインビボ5 で異種移植腫瘍における耐性クローンで発見されました。ごく最近、バングら（2015）11は、長期薬物暴露中に発生する耐性クローンの大部分を表示するために、2つの臨床的に関連するモデルでClonTracerを使用し、最も機能的に関連する突然変異は、すでに事前既存の可能性があることを示唆している既存の亜集団の一部でしたそれは選択の11時にす ​​るために選択になります。 前述した腫瘍のゲノムプロファイルとは対照的に、より少ない不均一性から、このアプローチの利点は、「均質」耐性クローンは、潜在的なドライバのより正確な遺伝的解剖を容易に分析するために使用されます。 Furtherm鉱石は、エキサイティングな、抵抗性の機序を解明するための可能性に加えて、この方法はまた、この情報が不明10であるため、生物活性小分子の細胞の作用機序および標的を同定するために適用することができます。明確なこの方法の利点と複数の用途を考えると、ここでは、臨床的に意味の発見の可能性を最大化するために、このような前臨床画面の実装を成功さを詳述するプロトコルを提示します。

<table><tbody><tr><td>48ウェルプレート</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>07-200-86&nbsp;</td><td>クローンの拡張</td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-200-588</td><td>GI50カーブの生成</td></tr><tr><td>CellTiter-Glo</td><td>Promega</td><td>G7572</td><td>生存率試験</td></tr><tr><td>クローニングディスク (3 mm)</td><td>シグマ</td><td>Z374431</td><td>クローンのピッキング</td></tr><tr><td>滅菌鉗子</td><td>Unomedical</td><td>DF8088S</td><td>クローンのピッキング</td></tr><tr><td>RNeasy Plus RNA抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>74134</td><td>Isolating RNA</td></tr><tr><td>Blood and Tissue DNeasy extraction kit</td><td>Qiagen</td><td>69581</td><td>Isolating gDNA</td></tr><tr><td>GATK</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Indel realigner</td></tr><tr><td>MuTect</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Paired variant calling tool</td></tr><tr><td>Oncotator</td><td>The Broad Institute</td><td></td><td>Variant annotation tool</td></tr><tr><td>MutationAccessor</td><td>The BroadInstitute</td><td></td><td>機能影響予測ツール</td></tr></tbody></table>

の実装<em&gt;インビトロ</em&gt;薬剤耐性アッセイ：臨床的に関連性のメカニズムを暴くための可能性を最大化

Implementation of In Vitro Drug Resistance Assays: Maximizing the Potential for Uncovering Clinically Relevant Resistance Mechanisms

標的療法は最初は効果的ですが、必然的に耐性が生じます。耐性臨床検体の遺伝子解析など、いくつかの方法が適用されて、これらの耐性メカニズムを明らかにし、フォローアップケアを促進しています。これらのアプローチは臨床的に関連性のある発見につながっていますが、関連する患者資料の入手や、これらの検体から収集されたゲノムデータのデコンボリューションの難しさが、治癒への道筋を著しく妨げてきました。この目的のために、ここでは、第一選択治療と代替臨床管理戦略の改善を導く可能性のある迅速な発見のためのツールについて説明します。前臨床のin vitroまたはin vivoでの薬剤選択と次世代シーケンシングを組み合わせることで、耐性の機能的ドライバーとなる可能性のあるゲノム構造変異や遺伝子発現の変化を特定することができます。このアプローチは、変化の自発的な出現を促進し、これらのメカニズムが患者に観察される可能性を高めます。このプロトコールでは、接着ラインを使用して耐性を駆動する一塩基変異体を発見する可能性を最大限に引き出すためのガイドラインを提供します。

抵抗の主要な機能のドライバを発見するための可能性を最大化するために、拡張、表現型のテストおよび配列決定のための単一細胞クローンを選択します。 図4Aに示されるように、細胞毒性化合物＃1で長時間処理したHCT116細胞を処理（破線の黒丸）の間に成長し続けて耐性クローンの自発的な出現につながりました。これらのクローンは、アプローチ＃1を使用して採取し、図3で強調表示され、その後、表現型分析のために拡大しました。 図4（b）に示すように 、すべてのクローンは無関係の細胞毒性化合物のベルケイドに感受性を示したのに対し、耐性クローン1-3すべては、＃1とその近くのアナログ化合物＃2（大きな生存性/成長）を化合物にかなりの抵抗性を示しました。表現型耐性のを確認した後、gDNAを単離し、全体exome配列分析のために提出。バイオインフォマティクスツールは、これらの構造変異体上で狭めるために適用されたこと1）再発性であり、2）機能的影響（ 図5A）の可能性を有します。これら2つの基準を満たした構造の変異体は、独立したシーケンシングツールによって確認されました。 図5Bに示すように、全体exomeシーケンシングを用いて同定したヘテロ接合ミスセンス突然変異がサンガー配列決定法（;下のパネル、変異配列上パネル、WT配列）を用いて確認しました。配列確認の後、もともと耐性アッセイに使用される親細胞系は、機能的変異の役割を確認するために、変異体​​のcDN​​Aを発現する遺伝子操作されました。 図6に示すように、WT cDNAの過剰発現が耐性を付与することができなかったのに対し、変異体cDNAの強制発現は有意に抵抗のドライバーとして、この構造変化の機能的役割を確認し、＃1を化合物に表現型耐性を付与しました。この実験のために使用される全ての試薬 ​​は、表1に概説されています</s<html> trong&gt;。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig1.jpg" /> アッセイおよびコントロールプレート1.レイアウト図。ブルー日陰、化合物の治療ウェルホワイト日陰、培地のみ。図4および三重（BD又はEG）で投与される。化合物は、連続的に1に希釈します。 2化合物は、プレートごとに適用することができます。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig2.jpg" /> 2.代表の生存率曲線を図。赤い点線は、0日読み取り。x軸は右方向、y軸への化合物の用量の増加を示すDMSO対照ウェルに生存能力を相対的に表します 。 GI 100 = 100％の増殖阻害を達成するために使用される用量。 GI 50 = DMSO対照の50％まで生存率を減少させるために使用される用量。 _upload / 52879 / 52879fig3.jpg &quot;/&gt; 図3.拡張のための耐性クローンを選ぶための2つのアプローチが。ピックアップし、48ウェルプレートに明確に定義されたクローンを転送するために1 -使用ピペッターアプローチ。アプローチ2 - 使用クローンを持ち上げて、48ウェルプレートに転送するクローンディスクをトリプシンを浸しました。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig4.jpg" /> in vitroで 1位を配合するHCT116クローンのために達成抵抗の図4.確認。（A）化合物＃1耐性のHCT116クローンが連続3週間の選択後浮上しました。制御および耐性クローンの（B）生存率は、様々な化合物との72時間の処理後に試験しました。化合物＃2は、化合物＃1の近くにアナログです。ベルケイドは、コントロール、細胞毒性剤として使用しました。データは、3つの生物学的複製の平均値+標準偏差として示されています。 ユニークな、反復突然変異の図5.識別（一塩基変異体、SNVs）化合物＃1耐性のHCT116クローンにおける遺伝子Aインチ（A）作業フローのすべての耐性クローンに存在SNVsを識別するための、高機能な影響を与えると予測MutationAssessorこともできます。 （B）サンガーシーケンシングによる遺伝子Aの変異の確認。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52879/52879fig6.jpg" /> 図6.変異遺伝子の再発現A は 、インビトロで第1位化合物に対する耐性を付与した。設計HCT116細胞株の生存率は、化合物の1位と72時間の処理後に試験しました。 HCT116-WTまたは変異体細胞株は安定し、それぞれ、WTまたは遺伝子Aの変異体のcDN​​Aを発現しています。データは平均値+標準偏差Oとして示されています3つの生物学的複製物F。 <table><tbody><tr><td>サンプル名</td><td>アミノ酸</td><td colspan="2">一次組織</td><td>接合性</td></tr><tr><td> C-33-A </td><td> p.E768fs * 44 </td><td colspan="2">頸部</td><td>ヘテロ接合</td></tr><tr><td> C-33-A </td><td> p.S860 * </td><td colspan="2">頸部</td><td>ヘテロ接合</td></tr><tr><td> CML-T1 </td><td> P。？ </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td>ホモ接合</td></tr><tr><td> CP66-MEL </td><td> p.C822F </td><td colspan="2">皮膚</td><td>ヘテロ接合</td></tr><tr><td> CTV-1 </td><td> p.0？ </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td>ホモ接合</td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> p.Q130fs * 2 </td><td colspan="2">卵巣</td><td>ヘテロ接合</td></tr><tr><td> EFO-27 </td><td> P。？ </td><td colspan="2">卵巣</td><td>ヘテロ接合</td></tr><tr> &lt;TD&gt; HCC2218 </td><td> p.E467K </td><td colspan="2">乳</td><td>ヘテロ接合</td></tr><tr><td> J-RT3-T3-5 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td>ホモ接合</td></tr><tr><td> LNCaP細胞</td><td> P。？ </td><td colspan="2">前立腺</td><td>ホモ接合</td></tr><tr><td>たLoVo </td><td> P。？ </td><td colspan="2">大腸</td><td>ホモ接合</td></tr><tr><td> MOLT-13 </td><td> p.R711 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td>ホモ接合</td></tr><tr><td> NALM-6 </td><td> P。？ </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td>ホモ接合</td></tr><tr><td> NCI-H630 </td><td> p.R680 * </td><td colspan="2">大腸</td><td>ヘテロ接合</td></tr><tr><td> SKUT-1 </td><td> p.L787fs * 11 </td><td colspan="2">子宮内膜</td><td>ホモ接合</td></tr><tr><td> SKUT-1B </td><td>ピコリットル787fs * 11 </td><td colspan="2">子宮内膜</td><td>ホモ接合</td></tr><tr><td> SUP-T1 </td><td> P。？ </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td>ホモ接合</td></tr></tbody></table> 表1 MSH2 -mutated細胞株。細胞株（サンプル名）、アミノ酸置換、起源の系統と接合状態が示されています。 <table><tbody><tr><td>サンプル名</td><td>アミノ酸</td><td colspan="2">一次組織</td><td>接合性</td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> p.R100 * </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td>ヘテロ接合</td></tr><tr><td> CCRF-CEM </td><td> P。？ </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td>ヘテロ接合</td></tr><tr><td> CW-2 </td><td> p.Y130fs * 6 </td><td colspan="2">大腸</td><td>ホモ接合</td></tr><tr><td> DU-145 </td><td> P。？ </TD&gt; <td colspan="2">前立腺</td><td>ホモ接合</td></tr><tr><td> GR-ST </td><td> P。？ </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td>ホモ接合</td></tr><tr><td> HCT-116 </td><td> p.S252 * </td><td colspan="2">大腸</td><td>ホモ接合</td></tr><tr><td> IGROV-1 </td><td> p.S505fs * 3 </td><td colspan="2">卵巣</td><td>ホモ接合</td></tr><tr><td> MN-60 </td><td> P。？ </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td>ホモ接合</td></tr><tr><td> NCI-SNU-1 </td><td> p.R226 * </td><td colspan="2">胃</td><td>ホモ接合</td></tr><tr><td> P30-OHK </td><td> P。？ </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </td><td>ホモ接合</td></tr><tr><td> PR-メル</td><td> P。？ </td><td colspan="2">皮膚</td><td>ホモ接合</td></tr><tr><td> REH </td><td> P。？ </td><td colspan="2"> haematopoietic_and_lymphoid_tissue </TD&gt; <td>ホモ接合</td></tr><tr><td> SK-OV-3 </td><td> p.0？ </td><td colspan="2">卵巣</td><td>ホモ接合</td></tr><tr><td> SNU-1544 </td><td> p.S2L </td><td colspan="2">大腸</td><td>ヘテロ接合</td></tr><tr><td> SNU-1746 </td><td> p.E523K </td><td colspan="2">大腸</td><td>ホモ接合</td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.C233R </td><td colspan="2">膵臓</td><td>ヘテロ接合</td></tr><tr><td> SNU-324 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2">膵臓</td><td>ヘテロ接合</td></tr><tr><td> SNU-478 </td><td> p.V384D </td><td colspan="2">膵臓</td><td>ヘテロ接合</td></tr></tbody></table> 表2 MLH1 -mutated細胞株。細胞株（サンプル名）、アミノ酸置換、起源の系統と接合状態が示されています。

前または臨床的発症次 - - 標的治療に対する薬剤耐性は広範囲に及び抵抗のメカニズムを同定することが必要である代替臨床管理戦略を導くために重要です。ここでは、これらのメカニズムの発見を促進するためにシークエンシングを用いたin vitro での薬剤耐性株のカップルの導出にプロトコルを提示します。

Although targeted therapies are initially effective, resistance inevitably emerges. Several methods, such as genetic analysis of resistant clinical ...

本手順の全体的な目的は、さまざまなクラスの治療法に対する耐性を機能的に誘導する可能性のある、臨床的に関連した一塩基バリアントの迅速な前臨床的な発見を促進することです。この手法は、臨床における治療への機能的耐性に寄与し得る遺伝子変異はどれかという、腫瘍学分野における重要な問いへの回答に役立ちます。これにより、最終的には治療法の改善や、薬剤耐性患者に対する代替的な臨床管理戦略の指針を得ることが可能になります。本手法の主な利点は、自発的な変異の出現を促進し、耐性クローンに対してバイアスのないスクリーニング技術を適用するため、これらのバリアントが臨床における標的治療の再発を誘導している可能性が高くなることです。細胞株のGI₅₀を評価するための手順を、私の研究室の非常に熟練した研究者が実演します。ここに示すマップに従い、100 µLの細胞培地を用いて、細胞を透明底96ウェルプレートに播種し、アッセイプレートを準備してください。同様の手順でコントロールプレートを準備し、青色のウェルに細胞を、白色のウェルに培地のみを添加します。プレートを37°Cで一晩インキュベートした後、ルミネッセンス細胞生存率試薬を室温に戻し、転倒混和して穏やかに混ぜ合わせます。均一な溶液にするため、コントロールプレートのウェルに試薬を80 µLずつ添加し、30分間振とうします。細胞溶解を誘導します。ルミノメーターを用い、露光時間を0.1～1.0秒、検出波長を560ナノメートルに設定してルミネッセンスを記録します。次に、試験化合物をアッセイプレートに添加するため、DMSOを用いて2000 µMの濃度から開始し、合計10段階の4倍段階希釈系列を作成します。次に、連続希釈した化合物を培地に添加し、最終濃度の10倍となる化合物培地混合液を作成します。この化合物プレートを-20 °Cで保存し、アッセイの3日目に使用します。続いて、最高濃度が10 µMとなるように、希釈した化合物を10 µLずつ細胞に3連（triplicate）で添加します。プレートを37 °Cで3日間インキュベートします。3日目に、3日前に準備した化合物プレートを用いて、400 µLの1X化合物培地ミックスを調製します。アッセイプレートを反転させて培地を除去し、オートクレーブ済みペーパータオルで2〜3回叩いて拭き取ります。青色で網掛けされたウェルに化合物xを1つ加え、蒸発を防ぐために外周のウェルに100 µLの培地を加えます。6日目に、ビデオの前の段階で示した通り、ルミネッセンス測定を行い、生存細胞の相対数を評価します。その後、PRISMなどのソフトウェアを用いてGI 50値を算出します。算出されたGI 50値に基づき、薬剤耐性試験のための細胞調製を行います。細胞静止剤を使用する場合は、150 mm角の培養ディッシュに細胞を30～40%のコンフルエンスで播種します。毒性剤を使用する場合は、70～80%のコンフルエンスで播種します。テキストプロトコルに従って初期化合物濃度を決定した後、6日間の生存率アッセイで細胞死を引き起こす極めて毒性の高い化合物を含む、試験化合物で細胞を処理します。GI 50から開始し、強力な耐性が観察されるまで2〜3週間ごとに濃度を段階的に上げます。単一細胞クローンを単離するには、位相差顕微鏡を40倍の倍率で使用して培養皿を観察し、皿の底にある生存細胞のクラスターを特定します。平均的なサイズで、他のコロニーから十分に離れているクローンにペンで印を付け、P 200ピペッターを用いてクローンをピックアップします。ディッシュから培地を取り除き、XPBSを使用して浮遊細胞を洗い流します。ピペットチップでクローンを吸い上げ、0.25% Trypsin 50 µLを含む48ウェルプレートの各ウェルに移し、37 °Cで1〜2分間インキュベートします。その後、細胞を最適に回復させるため、化合物の濃度を半分にした新鮮な培地を200 µL加えます。3 mmのクローニングディスクを用いてクローンを単離するには、まずディスクを0.25%トリプシンEDTA 5 mLが入った10 cm組織培養ディッシュに入れ、2分間浸漬させます。次に、耐性クローンが入ったディッシュから培地を吸引し、クローンの上にトリプシンに浸したクローニングディスクを重ねます。クローンがプレートから剥離しやすい度合いに応じて、37 °Cで1〜2分間インキュベートします。次に、滅菌済みピンセットを使用してクローニングディスクを回収し、200 µLの新鮮な培地が入った48ウェルプレートに移します。化合物の濃度を調整しながら、ピペットで緩やかに吸い上げ・吐き出しを繰り返し、クローニングディスクから細胞を剥離させ、37 °Cで一晩インキュベートします。翌日、クローニングディスクを取り除き、細胞をインキュベートした後、薬剤耐性を評価します。ここに示すテキストプロトコルに従い、細胞毒性のある化合物1で長期間処理したHCT 116細胞では、処理中も増殖し続ける耐性クローンの自然発生が認められました。クローンはピペットマンを用いてピックアップされました。この図において、耐性クローン1から3はすべて、化合物1およびその近縁アナログである化合物2に対して有意な耐性を示しましたが、一方で、すべてのクローンは無関係な細胞毒性化合物であるVelcadeに対して感受性を示しました。表現型としての耐性が確認された後、gDNAを単離し、全エキソームシーケンシング解析に供しました。再発性があり機能的影響を及ぼす可能性のある構造変異は、サンガーシーケンシングなどの独立したシーケンシングツールによって確認されました。ここに示す例ではヘテロ接合性のミスセンス変異が認められ、その後、親細胞株を用いて変異型CDNAを発現させるようにエンジニアリングが行われました。一方で、野生型CDNAの過剰発現では薬剤耐性は付与されませんでした。変異型CD NAは化合物1に対して有意な表現型耐性を付与し、構造的変異が耐性の駆動因子として機能的な役割を担っていることが確認されました。このビデオを視聴することで、がん細胞において薬剤耐性が生じた後、その耐性を担う遺伝子をスクリーニングするための自発的耐性増殖を誘導する方法について深く理解できるはずです。この手法により、腫瘍学分野の研究者は、がん細胞株および動物モデルの両方において、バイアスのない方法で薬剤耐性メカニズムを探索することが可能となります。

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