の実装インビトロ薬剤耐性アッセイ：臨床的に関連性のメカニズムを暴くための可能性を最大化

この手順の全体的な目標は、さまざまなクラスの治療に対する耐性を機能的に駆動する可能性のある臨床的に関連する一塩基変異体の迅速な前臨床発見を促進することです。この方法は、どの遺伝子変異が臨床での治療に対する機能耐性に寄与し、最終的に薬剤耐性患者の治療の改善や代替臨床管理戦略を導く可能性があるかなど、腫瘍学分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、自然突然変異の出現を促進し、耐性クローンに偏りのないスクリーニング技術を適用しているため、これらの変異体が臨床で再発標的療法を推進している可能性が高いことです。

手順を実証するのは、私の研究室の非常に才能のある研究者になります 細胞株のGI50を評価するため。不透明な透明物に細胞を播種してアッセイプレートを調製します。ここに示すマップによる細胞培地の100マイクロリットルの底部96ウェルプレート。

同様の方法でコントロールプレートを調製し、青色のウェルに細胞を追加し、白色のウェルに中程度の細胞のみを追加します。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートした後、発光細胞生存試薬を室温まで平衡化し、反転させて穏やかに混合します。均質な溶液を得るには、コントロールプレートのウェルに80マイクロリットルの試薬を加え、内容物を30分間振とうします。

細胞溶解を誘導する。露光0.1〜1.0秒、検出波長560ナノメートルのルミノメーターを使用して、発光を記録します。次に、アッセイプレートに試験化合物を添加するために、DMSO中の化合物の4分の1希釈を2000マイクロモル濃度から始めて、合計10希釈の一連の希釈を行います。

次に、段階希釈した化合物を培地に加えて、最終濃度の10倍で混合した化合物培地を作ります。コンパウンドプレートは、アッセイの3日目に使用するために、摂氏マイナス20度で保管してください。次に、希釈した化合物10マイクロリットルを細胞に三重に添加し、最高用量が10マイクロモル

プレートを摂氏37度で3日間インキュベートします。3日目に、3日前に準備したコンパウンドプレートを使用して、400マイクロリットルの1つのXコンパウンド培地ミックスを準備します。アッセイプレートを反転させて培地を取り除き、オートクレーブペーパータオルで2〜3回軽くたたいて乾かします。

青色のシェーディングされたウェルに1つのx化合物を追加し、蒸発を防ぐために100マイクロリットルの中程度から周囲のウェルを追加します。6日目には、ビデオの前半で示したように、発光測定値を取得して、生存細胞の相対数を評価します。次に、薬剤耐性アッセイ用の細胞を設定した計算されたGI50値を使用して、PRISMなどのソフトウェアを使用してGI50値を計算します。

細胞増殖抑制剤を使用する場合は、150ミリメートル四方の培養皿で細胞を30〜40%コンフルエンスで播種します。有毒物質を使用する場合は、70〜80%のコンフルエンスで細胞を観察してください。テキストプロトコルに従って初期化合物濃度を決定した後、6日間の生存率アッセイで細胞死を引き起こす高毒性化合物の試験化合物で細胞を治療します。

GI 50から始めて、強い抵抗が観察されるまで2〜3週間ごとに濃度を段階的に増やします。単一細胞クローンを単離するには、40倍の拡大率で位相差顕微鏡を使用して培養皿を検査し、皿の底面にある細胞の生存クラスターを特定します。ペンを使用して、平均的なサイズで他のコロニーから十分に分離されたクローンをマークし、P 200ピペッターを使用してクローンを選択します。

増殖培地を皿から取り出し、1つのXPBSを使用して浮遊細胞を洗い流します。ピペットチップを使用して、クローンを持ち上げ、0.25%トリプシンの50マイクロリットルを含む48ウェルプレートのウェルに移し、摂氏37度で1〜2分間インキュベートします。次に、化合物の濃度が半分の200マイクロリットルの新鮮な培地を加えて、細胞を最適に回復させます。

3 mmクローニングディスクを使用してクローンを単離するには、5 mmの0.25%tripsin EDTAを含む10 cmの組織培養皿にディスクを2分間入れます。次に、耐性クローンを含むディッシュから培地を吸引し、トリップスおよび浸漬したクローニングディスクでクローンを重ねます。37°Cで1〜2分間インキュベートします。ただし、クローンがプレートからどれだけ簡単に浮き上がるかによって異なります。

次に、滅菌鉗子を使用して、クローニングディスクをピックアップし、200マイクロリットルの新鮮な培地で48ウェルプレートに移し、化合物の濃度を静かに上下にピペットで動かして、クローニングディスクから細胞を取り除き、翌日に37度で一晩インキュベートし、クローニングディスクを取り外し、細胞をインキュベートします。 次に、薬剤耐性を評価します。テキストプロトコルによれば、ここに示すように、HCT one 16細胞を細胞傷害性で長期間処理した。化合物番号1は、治療中に増殖し続ける耐性クローンの自発的な出現につながりました。

クローンはピペットマンを使用して選択されました。この図では、耐性のあるクローン1から3はすべて、化合物番号1およびその近い類似化合物番号2に対して有意な耐性を示しましたが、すべてのクローンは無関係の細胞毒性化合物に対して感受性を示しました。ベルケード。表現型耐性の確認後、GDNAを単離し、全エクソームシーケンシング解析に提出しました。

再発性で機能的な影響が見込める構造変異は、サンガーシーケンシングなどの独立したシーケンシングツールによって確認されました。ここに示されている例は、ヘテロ接合性のミスセンス変異を有しており、続いて、親細胞株は変異したCDNAを発現するように操作されました。一方、野生型CDNAの過剰発現は薬剤耐性を付与できませんでした。

変異体CD NAは、化合物番号1に対して表現型の耐性を有意に付与し、耐性のドライバーとしての構造的変異の機能的役割を確認しました。このビデオを見た後、がん細胞の発生後にがん細胞の薬剤耐性に関与する遺伝子をスクリーニングするために、自発的な耐性増殖を発症する方法を十分に理解しているはずです。この技術は、腫瘍学の分野の研究者が、がん細胞株と動物モデルの両方で偏りのない方法で薬剤耐性メカニズムを探求する道を切り開きます。