臨床的に関連の確立

本手順の全体的な目的は、本来の微小環境において創傷修復を追跡できる、臨床的に意義のあるモデルを作成することである。まず、鶏胚の眼から水晶体を摘出する。次に、水晶体の前面に小さな切開を加える。

次に、水晶体線維細胞塊をハイドロエルートします。続いて、前嚢に追加の切開を加えることで、関連する上皮を伴う水晶体嚢を平坦にします。最後のステップは、傷の治癒過程を追跡するために、損傷した培養物を組織培養ディッシュに固定することです。

最終的に、タイムラプス顕微鏡観察、共焦点顕微鏡観察、および生化学的解析を用いて、in vivo環境を密接に再現したモデルにおける創傷修復のメカニズムを明らかにします。この手法は、細胞がどのように協調して移動し創傷を閉鎖させるかなど、創傷治癒分野における重要な疑問への回答に寄与します。また、本手法は創傷修復プロセスの洞察を得るためにも有用です。

本手法は、ABERの創傷治癒、特に線維化や瘢痕形成の研究にも適用可能です。まず、滅菌済みのラミナーフローフード内に100 mmのペトリ皿を3枚置きます。そのうち2枚のペトリ皿に、室温のtris dextrose bufferを半分まで満たし、残りの1枚は空のままにしておきます。

次に、37.7 °Cのインキュベーターから受精した胚齢15日のホワイトレグホン鶏卵を取り出し、殻の外側を70% ethanolで清拭して滅菌します。続いて、卵を慎重に割り、中身を空の100 mmペトリ皿に移します。標準的なピンセットと精密鋏を用いて胚を斬首し、頭部をTST dextrose bufferが入った皿の1つに入れます。

15分以内に、ニワトリ胚の頭部をペトリ皿の蓋に移動させます。高精度ピンセットを使用して眼球の後方を挟み、眼球後方に小さな開口部を作ります。次に、ピンセットで硝子体を掴み、転がすような動作で硝子体をゆっくりと引き出します。

水晶体が付着した硝子体は眼から外れます。水晶体と硝子体を、Tex extras Bufferが入った残りのペトリ皿に移します。解剖を続行する前に、水晶体をバッファー内に30分を超えて放置しないでください。

次に、解剖顕微鏡下で高精度ピンセットを用いて水晶体を新しいペトリ皿の蓋に移動させ、ピンセットの端を使用して、水晶体と共に剥がれた毛様体細胞を注意深く取り除きます。その後、水晶体後嚢との接合部で硝子体を挟み切り、水晶体を硝子体から分離します。分離後、水晶体を35 mm組織培養ディッシュ内の200 µLのtris dextrose緩衝液の液滴に移し、水晶体の前方側面が上を向くように配置します。

水晶体の前方は、水晶体上皮の内側領域と赤道領域の境界を示す組織内の高密度のリングによって容易に識別できます。2本の高精度ピンセットを使用し、両手に1本ずつピンセットを持って組織を掴み、反対方向にゆっくりと引くことで、水晶体前嚢の中央に約850 micronsの小さな切開を加えます。次に、27.5ゲージの針を装着した1 mLシリンジに、300 µLのTSTデキストロース緩衝液を満たします。

針先を水晶体前嚢に設けた切開口から挿入し、水晶体の約半分まで進めます。次に、シリンジをゆっくりと押し、TSTデキストロース緩衝液を水晶体内に注入します。繊維細胞塊。

周囲の上皮および水晶体嚢から繊維細胞塊を剥離させるために、50から200 µLのバッファーを注入します。300 µLを超えて注入しないでください。高精度ピンセットを用いて、剥離した繊維細胞塊を前方切開部位から水晶体より除去します。

後嚢への付着部位から線維細胞塊を除去することで、損傷した上皮に囲まれた基底膜上に、再現性の高い創傷領域が形成されます。嚢包を起点として、水晶体の前方面から赤道部に向かって5箇所の切開を入れます。得られた、上皮が付着した5枚の水晶体嚢フラップを、嚢側を下に、細胞側を上にして培養皿上で平らに広げます。

ピンセットで星形の各点を軽く押し、カプセルをディッシュに固定します。これにより、x explanの最も外側の5つの先端に小さな窪みができ、ディッシュへの持続的な接着が可能になります。その後、35 millimeterディッシュからtris dextrose bufferを取り除き、1.5 millilitersの予温したM1 99に交換します。

L-グルタミンおよびペニシリン・ストレプトマイシンをそれぞれ1%添加した培地を用意します。ディッシュに蓋をして、インキュベーターに入れます。培養ディッシュを解剖顕微鏡下に置き、上皮細胞の中央遊走領域と元の接着領域との境界を観察します。

次に、2本の高精度ピンセットを使用して、2つの領域の境界線の両端を掴みます。境界線に沿って元の付着領域をそっと引っ張り、2つの領域を容易に分離させます。2つの領域が完全に分離するまで、培養全域にわたって分離操作を続けます。

標準的な分子生物学的または生化学的な分析手法を用いて、2つの画分を解析します。線維細胞塊が除去された直後、ment濃縮間葉系修復細胞のサブポピュレーションが活性化され、上皮の創傷端へと遊走します。これらの細胞は、治癒を開始するために、内在性の基底膜カプセルの細胞のない領域である中央遊走帯へと急速に移動します。

ここで述べる手法を用いれば、顕微鏡やビデオカメラでこの過程を観察するためのモデルシステムを完璧に準備することができます。創傷治癒は速やかに進行し、培養1日目までに創傷の広範囲が被覆されます。通常、3日目までには、中心的な遊走帯と元の付着帯が分離し、創傷治癒プロセスが完了します。本研究では、これら異なる領域間の分子的な差異を分析しました。

2つの領域において焦点接着キナーゼのレベルを測定した結果、移動特異的な中央移動領域において、リン酸化焦点接着キナーゼ量が増加していることが分かった。この擬似白内障手術の手技を習得し、適切に実施すれば、3分間で完了させることができる。このビデオを視聴することで、天然の微小環境における創傷修復を密接に模倣した擬似白内障手術モデルの作製方法について、十分な理解を得ることができるはずである。