Name: クラス1インテグロンおよび遺伝子カセットのための食品のスクリーニング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 学ぶクラス1インテグロンと抗生物質耐性遺伝子カセットの食品検出法。PCRスクリーニングとDNAシーケンスを用いて、生食用食品から耐性菌を同定し、遺伝子カセットを特性評価する実用的プロトコルです。

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ミカエラ·ホール、ラリッサビスポおよび技術支援のためのグスタボ·タバレスに感謝します。

生で食べたり、軽く調理される食品は、ヒトの健康のために最も懸念されます。例としては、サラダ、野菜、果物、甲殻類や甲殻類が含まれます。 1.サンプルの採取<ol><li>汚染を最小限に抑える条件下でサンプルを採取し、輸送中に独立した、クリーンバッグに格納されています。採取した後、サンプルを4℃で保存し、24時間以内に処理されるべきです。 </li></ol> 2.エンリッチド文化の準備<ol><li>果物と野菜： <ol><li>丈夫なビニール袋に材料の約10グラムを配置します。大きな材料を加工する場合は、果物や野菜の皮に集中しています。 90ミリリットルの0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.0の処理は30秒間パドルブレンダーに加えます。パドルブレンダーが使用できない場合は別の方法として、材料を手動で撹拌することができます。 </li><li> 2 50ミリリットルファルコンチューブ内に液体を収集します。ペレット細菌に7分間4,000×gで遠心分離管。 </lI&gt; <li>上清を慎重に除去し、無菌ルリアベルターニ（LB）ブロス30ml中のペレット化した細菌を中断。 </li><li> 37℃で25℃で1チューブを保持し、他の、シェーカーO / Nでインキュベートします。培養物は、毎分200振動（OPM）で振盪されるべきです。 4℃で保存培養必要になるまで。 </li></ol></li><li>シーフード： <ol><li>滅菌ピンセットとピンセットを用いて、胃（カキ）または消化管（エビ）を解剖し、0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0の200μLを含む滅菌1.5mlチューブに入れます。ホモジネートを作成するためのサンプルを柔らかく。 </li><li> 2滅菌5ミリリットルチューブにLBブロス5mlのを分配し、シーフードホモジネートとそれぞれに接種。 </li><li> 25℃、他の37℃で1チューブを保持する、シェーカーO / Nでインキュベートします。培養物を200 OPMで振とうすべきです。 4℃で保存培養必要になるまで。 </li></ol></li></ol>インテグロン3.スクリーニング文化2濃度で提供される緩衝液を用いて、この方法で使用されています。必要に応じて、ローレンツ（2011）24は、この雑誌の以前の問題で、PCRの最適化とトラブルシューティングの方法を概説しました。 <ol><li>ゆでたDNAの調製： <ol><li>滅菌0.5ミリリットルのPCRチューブに濃縮された培養物100μlを分注します。水浴またはヒートブロックを用いて、10分間99℃にサンプルを加熱します。 2分間氷上で寒さをスナップ。 </li><li> 5分間、14,000×gでマイクロ遠心は、細胞破片をペレット化します。氷に戻ります。 DNAサンプルは、必要になるまで-20℃で凍結することができますが、氷上で解凍する必要があります。 </li></ol></li><li> PCRを使用して、クラス1インテグロンのスクリーニング： 注：O / Nインキュベーションからの混合培養物をHS463a / HS464 PCRプロトコル（ 表1）を使用してクラス1インテグロンについてスクリーニングされます。 <ol><li>任意の潜在的SOUから離れて、氷の上のすべてのPCR試薬を解凍DNAの混入のRCE。陰性対照（ 表2）を含む、サンプルあたり48μlのPCRマスターミックスを構成します。バリアのヒントを使用して、各チューブにPCRマスターミックスの48μLを分注します。 </li><li>バリアのヒントを使用して、個々のPCRチューブに解凍したDNAの2μlを添加します。 PCRサーモに適切なプログラムを実行します。 </li><li>増幅の結果を評価するために、注入し、TBE緩衝液（90 mMトリス - ホウ酸、2mMのEDTA）で実行する2％アガロースゲル上でPCR産物の7μLを電気泳動。 100bpラダーなどの分子量マーカーを含みます。 </li><li>ポストは、DNA染色でゲルを染色し、UVトランスイルミネーターを用いて可視化します。陰性コントロールには増幅がなされていないことを確認してください。任意の特定のサンプルのための周りの470塩基対での強いバンドが混合培養がクラス1インテグロンを運ぶ細菌を含んでいることを示します。純粋なコロニーは今PCR陽性を返された混合培養物から単離されます。 </li></ol></li></ol><ol><li>連続希釈と拡散板： 注：PCR陽性の混合培養物からの単一コロニーを単離するために、混合培養物を連続リン酸ナトリウム緩衝液中で10倍に希釈し、その後、単一コロニーを回収するためにメッキされます。 <ol><li> 0.1Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH 7.0の9ミリリットルに混合培養の1ミリリットルを加え、反転により混合します。リン酸緩衝液をさらに9ミリリットルに希釈の1ミリリットルを追加し、10 -8の連続希釈に達するまで繰り返します。 </li><li>二重に、LB寒天上に10 -4〜10 -8希釈液100μLを広げます。最初の混合培養に用いたのと同じ温度でプレートO / Nをインキュベートします。次いで、プレートを、しかし、それは非常に迅速に、単一のコロニーを処理するのが最善である、必要になるまで4℃で保存することができます。 </li></ol></li><li>単一コロニーの選択と煮DNA調製： <ol><li>連続希釈プレートから単一コロニーを選び、SEこのようなコロニーの大きさ、形状、色などの基準を使用して、できるだけ多くの異なるタイプのコロニーをlecting。スプレッドプレートから単一コロニーを選択するために、滅菌爪楊枝を使用してください。 </li><li>コロニーにつまようじをタッチし、次に100μlの滅菌水を含むPCRチューブに移します。多数のコロニーをスクリーニングする場合は、その後コロニーをマイクロタイタートレイ中で調製する​​ことができます。水への細胞の一部を除去するために指の間つまようじをスピン。 </li><li>同じつまようじを使用して、コロニーのストリークを含むLBプレートに接種。各縞は約1cmの長さである場合、多数のコロニーは、標識されたプレート上に記憶することができます。あなたが分離株の適切な数を選択するまで繰り返し、1〜3を繰り返します。 </li><li>最初の富化培養に用いたものと同じ温度で、LBプレートO / Nインキュベートします。必要になるまで、培養物を、次いで、4℃で保存することができます。 </li><li>細菌懸濁液からDNAを調製するために、OUなどの手順に従ってください3.1節でtlined。純粋培養溶解物のスクリーニングのために、3.2節で概説されるようにHS463a / HS464 PCRを行います。 PCR陽性を返すの分離株は、ゲノムDNA（第5節）の製造のための、およびさらなる分析のために使用されます。 </li></ol></li></ol> 25を打つビーズを使用したインテグロン陽性単一コロニーの5のゲノムDNA抽出<ol><li> 4.2節で単離された純粋培養のサンプルとLBブロス5mlの接種。最初の富化培養に使用したのと同じ温度で振とう、O / Nをインキュベートします。 </li><li>ペレット細胞は7分間、4,000×gで、その後、上清を除去します。ライジング行列Eの高速取管で1ミリリットルCLS-TC溶液中でペレット化した細胞を再懸濁します。ビーズ叩解機を用いて、30秒間5.5メートル/秒でサンプルを処理します。 </li><li> 5分間、14,000×gで遠心分離管や滅菌1.5mlチューブに上清700μlのを回復します。 </li><li> M関6と5：1に希釈した結合マトリックスの700μLを追加5分間室温でidiniumチオシアンミックス。 1分間14,000×gで遠心し、上清を捨てます。 </li><li>ペレットを完全に再懸濁されるまで、800μlの塩エタノール洗浄（70％エタノール、0.1 M酢酸ナトリウム）、ボルテックスを追加。 1分間14,000×gで室温で5分間、遠心分離のために洗浄し、上清を捨てます。すべての上清を必要に応じて、マイクロピペットを使用して、削除されたことを確認し、その後5分間空気乾燥させ。 </li><li>ピペッティングにより200μlのTE（10mMのトリス-HCl、1mMのEDTA、pHは7.6）でペレットマトリックスを再懸濁します。 3分間室温でインキュベートします。 3分、転送滅菌チューブに溶出したDNAの160μlのための14,000×gで遠心します。 DNA抽出の収量および完全性をチェックするために2％W / Vアガロースゲル上のゲノムDNA抽出の一部を実行します。精製ゲノムDNAは-20℃で保存し、PCR試験のために必要な場合に、氷上で解凍されます。 </li></ol> 6.診断のPCRおよびDNAシークエンシング注意：セクション5で調製したゲノムDNAは、すべての診断のPCRのために使用され、クラス1インテグロンのための陽性を確認します。 <ol><li>簡単に20秒間14,000×gでDNAサンプルとパルススピンをボルテックス、氷の上でゲノムDNAを解凍します。分離株は、471塩基対のアンプリコン（3.2節）について陽性であることを確認し、HS463a / HS464を使用して、クラス1インテグロンインテグラーゼ遺伝子（ 表1）のためのPCRを繰り返します。 </li><li>種レベルの陽性培養の同定小サブユニットrRNA遺伝子（16S rDNAの）を分析することによって達成されます。プライマーF27 / r1492（ 表1）を用いて16S遺伝子を増幅します。電気泳動を用いてPCR産物を確認してください。すべての細菌のターゲットは、約1450塩基対の16Sアンプリコンを生成する必要があります。 </li><li>種同一性を決定するためのシーケンス16S rRNA遺伝子アンプリコンが、そこステップ6.2からの複数のPCRポジティブである可能性があり、これらの陽性の多くは、同じ細菌種になるので、我々は最初usin異なる種を区別します16S PCR産物gの制限消化。 <ol><li>制限酵素関数hinf 1と16S PCRの一部を消化。任意の4塩基対切断部位致します認識する酵素が、 関数hinf 1は、16Sのターゲットからの良好な多様性を生成し、信頼性の高い、安価な酵素です。 </li></ol></li><li> 30μlの制限は、滅菌チューブにマスターミックス（ 表2）を消化し ​​、未purfied 16S PCR産物の20μlを添加設定します。 37℃の水浴O / Nでインキュベートします。 2％アガロースゲル上でダイジェストを確認してください。 </li><li> 関数hinf 1によって生成される消化パターンをスコア。同じ16S制限プロフィールと分離株は、同じ種である可能性が高いです。むしろ、すべての16S PCR産物は、各関数hinf 1制限パターンの最も3代表での配列を配列決定するよりも。 </li><li>市販のキットを用いて16S PCR産物を精製します。一本鎖エキソヌクレアーゼキットを使用することができるが、列ベースのまたは沈殿法もuninc除去するためにうまく機能しますプライマーおよび一本鎖DNAをorporated。シーケンスプライマーR910（ 表1）を用いてシークエンシング機能によって指定されたような反応をセットアップ16Sアンプリコン。 </li><li> BLASTN機能（NCBIでのDNAデータベースを調べるために、得られたDNA配列を使用し<a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ）。 97％以上のヌクレオチド同一性は、通常、種のアイデンティティとします。 </li></ol> 7.マッピングとインテグロンとカセット配列の特徴注：人間が支配生態系から発するクラス1インテグロンは、すべてのサンプルの中で最も一般的なインテグロンである可能性が高いです。これらのインテグロンすべては、最近の単一起源を持っているため、高度に保存されたDNA配列5を持っています。 <ol><li>クラスの間に1人のソースから発するインテグロンと行うことにより、環境試料中に天然に存在するものを区別プライマーを用いたPCRはintI1F165 / intI1R476 10（ 表1）を設定します。 注：環境クラス1インテグロンが任意の製品を生成しませんしながら、臨床的または共生細菌からのクラス1インテグロンは、〜300 bpの産物を生成します。 </li><li>プライマーセットHS458 / HS459とカセットの配列を増幅することにより、臨床インテグロンを特徴づけます。このPCRは、ほとんどのカセットの配列の末端にintI1および3 &#39;保存されたセグメント間の領域を増幅します。カセットの数および同一性は可変であるので、PCR産物の大きさも変化するであろう。 </li><li>アンプリコンを精製し、増幅プライマーのそれぞれを用いて、DNAを配列決定します。 BLASTN機能（使用して、DNAデータベースを調べるために配列を使用<a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiを</a> ）。 </li><li>カセットの命名はインテグロン遺伝子カセットのための多くのデータ·堆積するので、標準化された命名法9に従うことを確認Sは矛盾やあいまいな名前を使用します。これらは伝達、病原性や毒性8,21を増加与える遺伝子を含む、新たな表現型をコードすることができるので、新規遺伝子カセットに特に注意を与えます。 注：クラス1インテグロンの前臨床形態は、まだ自然環境に循環します。特に、アクティブテネシー402トランスポゾンにリンクされているものは、ほとんど関心26のものです。これらのインテグロンのカセット配列はプライマーセットHS458 / HS459で増幅されませんが、カセットコンテンツに依存して可変サイズのアンプリコンを生成し、MRG284 / MRG285プライマーセット（ 表1）を用いて増幅することができます。 7.2に概説するようにPCR産物は精製されるべきであり、DNAを配列決定しました。 </li></ol>

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著者らは、開示することは、関連は何もありません。

インテグロンおよびそれらに関連する遺伝子カセットの同定は、潜在的に、新たな日和見病原体の出現を予測する人間の食物連鎖の中に病原体のための経路を追跡し、新たな耐性を特定する際に重要なステップであり、毒性は8,21,26を決定因子。本稿の目的は、そのカセットの配列を特徴付けるし、それらが存在する細菌種を識別し、クラス1インテグロンのためのサンプルをスクリーニングするための効率的なアプローチを説明することでした。プロトコルにおける重要なステップは、良好な微生物学的実践を伴って、偽陽性を生成するPCRの汚染を防止します。 ここで説明するプロトコルは、簡単に、ヒトの病原体で発見されたクラス2およびクラス3インテグロンを含む他の臨床的に関連するインテグロンを検出するように修飾することができます。また、水、バイオフィルム、土壌または堆積物から微生物群集でインテグロンを検出するように修飾することができます。いくつかのlimitatioがあります細菌細胞の培養に依存から生じるこの技術では、ナノ秒。多くの環境細菌は容易に培養可能なものではなく、ここに記載されているプロトコルは、こ...

抗生物質の発見は20 世紀の最も偉大な科学的成果の一つでした。しかし、抗生物質の使用や乱用は、抗生物質耐性菌の急速な進化につながっている、これらは現在、21世紀の公衆衛生に深刻な脅威をもたらします。ほとんどの治療の選択肢に耐性細菌株の上昇は、我々は抗菌薬がもはや1,2に効果的である時代に入っている可能性を高めます。 抗生物質耐性を付与する遺伝子機構は年間3百万のすることによって、ヒトおよび抗生物質選択圧をより以前、古代のシステムです。このようなプラスミド、トランスポゾン、ゲノムの島々 、統合的な接合要素とインテグロンなどのモバイル遺伝的要素は、内および細菌種4との間の両方の抗生物質耐性遺伝子（ARG）を広めることができます。これらのうち、インテグロンはもかかわらず、ARGの普及において中心的な役割を果たしてきました彼らは細菌ゲノム5への動員および挿入するためのプラスミドおよびトランスポゾンに依存しているという事実。インテグロンはインテグロンインテグラーゼを用いた遺伝子カセットをキャプチャして、[エンコードされインテグロンプロモーター6,7（ 図1）を使用して、カセットを発現します。 インテグロン遺伝子カセットは、その製品の抗生物質や消毒剤8に対する抵抗性を付与することができる単一のオープンリーディングフレーム（ORF）からなる小型のモバイル要素です。クラス1インテグロンは、最も一般的に、それらをまとめて130の異なる抗生物質耐性遺伝子カセット9を介して取得した臨床分離株5から回収インテグロンです。 人間関連共生や病原性細菌へのクラス1インテグロンの広がりは、これらの遺伝子エレメント10の多くが含まれている人間の廃棄物の流れを生成します。クラス1インテグロンが含まれている推定10 19細菌が毎年下水汚泥を経てリリースされた私nはイギリス11。これは、抗生物質耐性を付与するクラス1インテグロンは今野生の鳥類、魚類、および他の野生生物の12-14の微生物叢中に検出されていることは驚くべきことではありません。新しい遺伝子カセットなどのモバイル要素と複雑な再配列の取得は、特に下水処理場や他の水域15-18で、引き続き発生するので、戻って環境にインテグロンを解放すると、重大な公衆衛生上の脅威をもたらします。自然環境は、新しい耐性決定と日和見病原体19,20のための肥沃な募集の地面になります。新規インテグロン含有細菌や新しいargsが汚染された水や食物21,22を通じて人間社会に戻って一周することができます。環境ARGSのサーベイランスは、理解と将来23に抗生物質耐性を管理するための重要な戦略です。具体的には、注意が生で食べたりしている食品に支払われるべきですこれらは、新しいモバイル要素と病原体の伝播のための最大の脅威を提示するので軽く、調理。 食品中のクラス1インテグロンおよびそれらに関連する遺伝子カセットが概説されて、検出、同定および特徴づけるためのこのプロトコルでは、効率的なアプローチ（ 図2）。培養およびポリメラーゼ連鎖反応（PCR）の組み合わせを使用して、インテグロンは急速に複雑な細菌群集及び個々の分離株で検出することができます。細菌およびインテグロン関連遺伝子カセットの立体構造と同一の種を同定するための方法が挙げられます。この方法は、植物及び動物の食品の広い範囲に適しており、典型的なワークフローの例は、これらの食品の種類ごとに与えられています。

<table><tbody><tr><td>GoTaq Colourless Mastermix</td><td>Promega</td><td>M7132</td><td>すべてのPCRで使用</td></tr><tr><td>RNAse (ウシ膵臓からのリボヌクレアーゼA)</td> <td>Sigma</td><td>R6513-10MG</td><td>すべてのPCRで使用</td></tr><tr><td>HinFI制限酵素</td><td>Promega</td><td>R6201</td><td>16S rDNA PCRの消化に使用されます。酵素は、最適な緩衝液とBSA</td></tr><tr><td>100 bpのはしご</td><td>GEヘルスケア</td><td>27400701</td><td>が付属しています すべてのアガロースゲル</td></tr><tr><td>GelRedDNAステイン</td><td>ビオチウム</td><td>41003</td>のサイズ標準として使用されます <td>注意:この材料を取り扱うときは、個人用保護具を着用する必要があります</td></tr> チ<tr><td>オシアン酸グアニジニウム</td><td>ライフテクノロジーAM9422</td><td></td><td>注意:この材料を取り扱うときは、個人用保護具を着用する必要があります</td></tr><tr><td>CLS-TC溶液</td><td>MP Biomedicals</td><td>6540409</td><td>ゲノムDNA抽出の開始時に使用される再懸濁液</td></tr><tr><td>Lysing Matrix E FastPrep チューブ</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914500</td><td>細菌細胞壁の機械的破壊に必要なチューブ。このコードは500本のチューブのパックに使用され、少量が利用可能です。</td></tr><tr><td>結合マトリックス</td><td>MP Biomedicals</td><td>116540408</td><td>6 M グアニジニウムチオシアン酸で 1:5 に希釈し、ゲノム DNA 抽出法で使用します。</td></tr><tr><td>Fast Prepマシン</td><td>MP Biomedicals</td><td>利用可能なオプションの数</td><td>MP Biomedicalsは、購入可能なFastPrepマシンを多数ご用意しています。詳細については、<a href="http://www.mpbio.com" target="_blank">http://www.mpbio.com</a> をご覧ください</td></tr></tbody></table>。

クラス1インテグロンおよび遺伝子カセットのための食品のスクリーニング

Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

抗生物質耐性は、21世紀の健康に対する最大の脅威の一つです。遺伝子の横伝播による耐性遺伝子の獲得は、多様な耐性メカニズムが広がる大きな要因です。横方向移動を促進するDNA要素の中で、クラス1インテグロンは、グラム陰性病原体間で抗生物質耐性の決定因子を広める主な役割を担っています。これらのインテグロンは、合計で130種類以上の抗生物質耐性遺伝子を獲得し、播種しています。抗生物質の使用が続くと、クラス1インテグロンは、ヒトとその家畜の共生動物や病原体に遍在するようになりました。その結果、彼らは現在、すべての人間の排泄物の流れで見つけることができ、そこで新しい遺伝子を獲得し続け、食物連鎖を通じて人間に戻る可能性があります。このプロトコルでは、培養とPCRを使用して、食品中のクラス1インテグロンとそれらに関連する耐性遺伝子カセットを検出するための合理化されたアプローチについて詳しく説明します。このプロトコルを使用すると、研究者は次のことができるようになります:濃縮培養物を作成し、クラス1インテグロンをスクリーニングするためのサンプルを収集して準備します。単一の細菌コロニーを分離して、インテグロン陽性分離株を同定します。クラス1インテグロンを含む細菌種を特定します。そして、これらのインテグロンとそれらに関連する遺伝子カセットを特徴付けます。

intI1用混合培養し、細菌分離株のスクリーニングプライマーセットHS463a / HS464 PCRは、クラス1インテグロン、インテグラーゼ遺伝子、intI1（ 図1）の存在を検出することができます。このプライマーセットは、混合培養でintI1を検出するためにうまく機能し、また、拡散板（ 図2）から回収した細菌コロニーをスクリーニングするために使用されます。正の分離株は、このプライマーセット（ 図3A）を用いて、471塩基対で、単一の強いバンドを生成する必要があります。正の分離株の大部分は、ヒトまたはそれらの農業や家畜に由来しているintI1を運ぶでしょう。これらの分離株はまた、311 bpのアンプリコン（ 図1）を生成する必要がある、プライマーF165 / R476を用いたPCRで陽性であることになります。 intI1の環境情報源は、一般的に、この第二のアッセイで陽性になりませ...

このプロトコルは、食品中のクラス1インテグロンとそれらに関連する遺伝子カセットの検出を説明しています。

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

この手順の全般的な目的は、食品からクラス1インテグロンおよびそれに関連する遺伝子カセットを検出するための効率的なアプローチを提供することです。まず、選択した食品から細菌培養物を濃縮し、次にPCRを用いてクラス1インテグロンの存在をスクリーニングし、インテグロン陽性の混合培養物から単一コロニーを分離することでこれを達成します。単一コロニーをスクリーニングしてインテグロンの存在を確認した後、細菌種の識別および遺伝子カセットの検出を行う診断的PCRに向けて、単一コロニーからゲノムDNAを調製します。最終ステップとして、PCR産物を精製し、DNA配列解析に提出します。最終的に、DNA配列解析を用いてクラス1インテグロン内の遺伝子カセットを特性解析し、それらがどの菌種に存在するかを特定します。薬剤耐性は、21世紀の医療における主要な課題の一つです。薬剤耐性を管理する方法の一つとして、ヒトから環境へ、そして環境から再びヒトへと伝播する薬剤耐性遺伝子を環境中で検出し、追跡することが挙げられます。本プロトコルでは、薬剤耐性を検出する方法について説明します。生または最小限の処理で摂取する可能性のある食品中の遺伝子について説明します。本手順は、私の研究室のポストドクターであるLeet Waldronによって実演されます。果物、野菜、貝類など、生または軽く加熱して摂取する食品は、ヒトの健康にとって最も懸念されるものです。ここでは、海産物からの濃縮培養の調製のみを実演します。果物および野菜からの培養調製については、プロトコルの本文を参照してください。海産物から濃縮培養を調製するには、まず滅菌済みのピンセットと鑷子を用いて、海老から消化管を切り出します。解剖した試料を、200 µLのリン酸ナトリウム緩衝液を含む滅菌済みの1.5 mLチューブに入れます。ペッスルを用いてサンプルを摩砕してホモジネートを作成し、ボルテックスします。滅菌済みの5 mLチューブ2本にLBブイヨンを5 mLずつ手早く分注し、それぞれに海産物のホモジネートを接種します。両方のチューブを200 OPMで一晩振盪し、一方のチューブは25 °Cで、もう一方は37 °Cでインキュベートし、翌日に回収します。PCR陽性の混合培養物から単一コロニーを回収するまで、培養物を4 °Cで保存します。まず、1 mLの混合培養物を9 mLのリン酸ナトリウム緩衝液に加え、ボルテックスで混合することで、培養物をリン酸ナトリウム緩衝液で10倍段階希釈します。希釈液1 mLをさらに9 mLのリン酸ナトリウム緩衝液に加え、10⁻⁸の連続希釈に達するまでこれを繰り返します。希釈した培養液のうち、10⁻⁴から10⁻⁸希釈液の100 µLをLB寒天培地に塗布します。2連（デュプリケート）で、初回の混合培養に使用した温度と同じ温度でプレートを一晩インキュベートし、翌日に確認します。段階希釈プレートから単一コロニーを選択できます。DNA調製にあたり、開始前にすべてのプレートとサンプルチューブに明確なラベルを貼付してください。滅菌済み爪楊枝で単一コロニーに触れ、それを100 µLの滅菌水が入ったPCRチューブに転移します。つまようじを指の間で回転させて細胞の一部を水中に分散させ、同じつまようじを使用して、採取した各コロニーをLBプレートに画線接種します。多数のコロニーをラベル付きプレートに保存することが可能です。各画線の長さが約1cmになったら、サンプル間のコンタミネーションを減らすために、すぐに蓋を閉じてください。コロニーのサイズ、形状、および色などの基準を用いて、可能な限り多くの異なるコロニータイプを選択します。LBプレートを、最初の濃縮培養に使用したものと同じ温度で一晩インキュベートします。その後、細菌懸濁液からDNAを調製するまで、培養物を4 °Cで保存することができます。サーモサイクラーを用いてサンプルを99 °Cで10分間加熱し、その後、室温で14,000 ×gにて5分間遠心分離して細胞残渣をペレット化し、氷上に置きます。続いて、プライマーHS 4 63 AおよびHS 4 64を用いたPCRによりDNAをスクリーニングします。プロトコルの本文に記載された手順に従い、PCRを実施する際はDNA汚染の潜在的な原因をすべて排除することが重要です。増幅結果は電気泳動で評価します。各PCR産物 7 µLを、TBEバッファーで作製および電気泳動した2%アガロースゲルにロードし、DNA染色剤で後染色します。UVトランスイルミネーターを用いてDNAを可視化します。クラス1インテグロンを保有する分離株は、471 base pairsに強い単一のバンドを形成します。PCR陽性となった分離株から調製したゲノムDNAを、これらの解析に使用します。ゲノムDNAを氷上で融解し、短時間ボルテックスした後、14,000 ×gで20秒間パルススピンします。診断用PCRに使用したプライマー配列およびPCR条件は、原稿の表1に示されています。まず、クラス1インテグラーゼ遺伝子のPCRを繰り返し、分離株が471 bpのアンプリコンに対して陽性であることを確認します。次に、小サブユニットリボソームRNA遺伝子16S rDNAを増幅させることで、陽性培養物の種レベルの同定を行います。多くの陽性培養液は同一であるため、すべての細菌ターゲットで約1,450 base pairsの16 Sアンプリコンが生成されるはずです。細菌種については、16 SPCR産物の制限酵素消化によって異なる種を区別します。16 sターゲットから良好な多様性を得られ、信頼性が高く安価な酵素である制限酵素HIF oneが推奨されます。滅菌チューブ内で30 µLの制限酵素消化マスターミックスを調製し、未精製の16S PCR産物を20 µL添加します。37 °Cの水槽で一晩インキュベートし、翌日に2%アガロースゲルを用いて消化を確認します。選択した16S PCR産物を市販のキットを用いて精製し、DNAシーケンシング施設へ送付して配列解析を行います。得られたDNA配列を用いて、Blast N機能によりNCBI DNAデータベースを照合します。通常、ヌクレオチド同一性が97%以上であれば、同種であるとみなされます。混合培養された抗菌剤耐性分離株を対象に、PCR法を用いてクラス1インテグラーゼ遺伝子の有無をスクリーニングします。プライマーHS 4 63 AおよびHS 4 64を使用し、陽性コロニーでは471 bpに強いシングルバンドが検出されます。純粋分離株からのゲノムDNAを用いてインターカセットアレイの特性解析を行い、プライマーHS 4 58およびHS 4 59を用いてTN 4 0 2インテグロンからカセットアレイを増幅させると、アレイ内の構成カセットの種類とサイズに応じて、多様な産物サイズが得られます。これらのカセットを同定するにはDNAシーケンシングが必要です。環境クラス1インテグロンは、しばしば細菌の染色体に組み込まれています。それらのコンサバティブ領域は、それぞれ近位および最遠位の組換え部位を標的とするプライマーMG 2 84およびMG 2 85によって増幅できます。このPCRでは、アレイに含まれる構成カセットの正体とサイズに応じて、可変的な産物サイズが得られます。しかしながら、環境アレイ中のカセットが抗生物質耐性をコードしている可能性は低いです。細菌種は、16 S-R-D-N-Aを増幅し、PCR産物を消化してスクリーニングすることによって同定されます。HIFを用いることで、単一の種が特徴的なパターンを生成するため、同種の分離株を容易に識別でき、DNAシーケンシングによって確認することが可能です。このビデオを視聴したことで、日常的な食品からクラス1インテグロンおよびその抗生物質耐性カセットを分離する方法について、十分に理解できたはずです。

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Research

JoVE Journal

Environment

環境

既製のアクセプター株、と呼ばれる着陸パッド株に興味のある外来DNAを統合するための迅速かつ効率的な方法が記載されている。メソッドは、ΦC31インテグラーゼの結合と表現を通して、与えられた菌株の人工着陸パッドの座にDNAカセットの部位特異的に統合することができます。...

サイト固有の細菌染色体工学：ΦC31インテグラーゼを介したカセット取引所（IMCE）

細菌は、その微生物の隣人の生理機能に影響を及ぼす可能性があり、分泌された化合物を製造する。ここでは、固体培地上で枯草菌の蛍光転写レポーター株と土壌微生物を混合することにより、このような化学的に仲介される種間の相互作用の検出を可能にする共培養画面について説明します。...

化学的に媒介種間相互作用を検出するための共培養を使用して

この研究は、理論的には200以上の酵素に適用できる普遍的な遺伝的酵素スクリーニングシステムを使用したハイスループットスクリーニングの方法を提示しています。ここでは、シングルスクリーニングシステムで、使用する基質(p-ニトロフェニルアセテート、p-ニトロフェニル-β-D-セロビオシド、およびフェニルリン酸)を変更するだけで、3つの異なる酵素(リパーゼ、セルラーゼ、アルカリホスファターゼ)を同定します。...

マルチ酵素ハイスループット遺伝的酵素スクリーニングシステムを用いたスクリーニング

サルモネラ赤痢は下痢に起因する一般的な病原体。ここでは、サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォームについて述べる/リアルタイム PCR...

サルモネラ属菌のスクリーニングのための高スループット プラットフォーム/赤痢菌属

ここで他の大腸菌の欠失変異株を作るための基盤として、既存の抗生物質抵抗カセット削除構造の使用のためのプロトコルを提案する.このような欠失変異体を動員し、P1...

物品税課税対象の抗生物質耐性カセット P1 伝達による大腸菌の遺伝子の削除を生産

ループ媒介等温増幅(LAMP)は、病原体検出分野に広く関心を集めている等温核酸増幅試験(iNAAT)です。ここでは、動物性食品中のサルモネラ菌をスクリーニングし、培養分離から推定サルモネラ菌を確認するための迅速で信頼性の高い、堅牢な方法として、マルチラボ検証されたサルモネラLAMPプロトコルを提示します。...

動物性食品中の サルモネラ菌 をスクリーニングし、培養分離から サルモネラ菌 を確認するためのループ媒介等温増幅

このプロトコルは、φC31システムを使用してアノフェレスマラリア蚊のゲノムにおいて部位特異的修飾を達成する方法を記述している。記載される改変には、attP含有ドッキングラインのゲノムにおけるトランスジェニックカセットの統合および交換の両方が含まれる。...

マラリアのアノフェレスベクターにおける部位特異的φC31媒介集積分とカセット交換

カンピロバクター は、世界中の細菌性食品媒介性胃腸炎の主な原因です。施設が施設全体の蔓延を減らすための対策を講じているにもかかわらず、汚染された製品は一貫して消費者に届いています。過去12年間に開発されたこの技術は、生肉から カンピロバクター...

生肉からの カンピロバクター 属菌の検出と分離

排出不全細菌株と単一コピー遺伝子発現システムを用いた アシネトバクター・バウマニの 多剤排出システムの特性評価

この研究は、C-グリコシドを切断できる腸内細菌を効率的にスクリーニングおよび分離するための一連の標準操作手順(SOP)を確立します。...

C-グリコシド切断腸内細菌のスクリーニングと単離

学ぶクラス1インテグロンと抗生物質耐性遺伝子カセットの食品検出法。PCRスクリーニングとDNAシーケンスを用いて、生食用食品から耐性菌を同定し、遺伝子カセットを特性評価する実用的プロトコルです。

クラス1インテグロンおよび遺伝子カセットのための食品のスクリーニング

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