電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）

本実験の全体的な目的は、ナノスケールで二本鎖DNA切断部位周辺のDNA修復タンパク質の分布をマッピングすることです。これにより、電子分光イメージングを用いて、修復過程にある損傷クロマチンの超微細構造を研究します。これは、蛍光タンパク質とmini SOGタグを用いたDNA損傷応答タンパク質の融合タンパク質をコードするDNA発現コンストラクトを作製することで達成されます。

第2ステップとして、トランスフェクションによってコンストラクトを細胞内に導入し、その後、レーザー照射またはガンマ線照射によって細胞に損傷を与えます。次に、照射および固定された細胞に対し、電子顕微鏡での作製工程を行い、mini SOGタグ付き修復タンパク質の分布を電子顕微鏡で可視化できるようにします。得られた電子分光イメージングにより、クロマチンの超微細構造および特定のタンパク質とDNA修復フォーカスとの関係の解析を可能にする詳細な画像が得られます。

ImmunoGold標識などの他の既存技術に対するこの技術の主な利点は、抗体の入手可能性に依存せず、標的構造を高密度に標識できることです。一般的に、この手法に不慣れな方は、光酸化がpH、光強度、および酸素飽和度に非常に敏感であるため、困難に直面します。光酸化、酸素飽和度、および照明のステップは極めてわずかな変化に敏感であるため、この手法を再現するためには、実際の手順を視覚的に提示することが不可欠です。

私の研究室のポストドクターであるHilmar Fadden博士が、培養の手法を実演します。付随するテキストプロトコルに記載されている通り、mini SOGおよびM cherryタグ付きの修復タンパク質を安定発現させたヒト骨肉腫細胞を使用します。10 cmディッシュから細胞を継代した後、コンフルエンシーが80%になるまで細胞を増殖させます。

次に、細胞を蛍光顕微鏡下に置き、滅菌済みのダイヤモンドペンを使用して、異所性タンパク質を発現しマークされた細胞を含む約1平方ミリメートルの小さな領域を囲みます。溶液にherxを添加して最終濃度を0.5 µg/mLにし、細胞を感作させた後、37 °Cのインキュベーターで20分間置きます。その後、共焦点顕微鏡の405 nm固体レーザーを用いて細胞にレーザーマイクロ照射を行い、DNA損傷を誘発します。DNA損傷後、室温で0.1 M 炭酸ナトリウム緩衝液に溶解した4%パラホルムアルデヒド 1 mLを用いて、暗所で30分間細胞を固定します。

pH 7.4の0.1 M sodium Cateバッファー4 mLで細胞を2回洗浄します。次に、固定した細胞に、50 mM glycine、5 mM amino triazole、および10 mM potassium cyanideを含むpH 7.4の溶液2 mLを加え、30分間処理します。その後、バッファーを、付属のテキストプロトコルに従って調製したpH 7.4の光酸化バッファー2 mLに交換します。

次に、溶液に酸素をバブリングして酸素飽和状態を維持しながら、サンプルを氷上で暗所でインキュベートします。続いて、固定細胞が入ったディッシュを、40 x 油浸対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡に慎重にセットし、先に設定した関心領域まで移動させます。緑色蛍光タンパク質用のフィルターキューブを用いて、青色光でmini SOGタグを励起させます。

緑色のmini SOG蛍光が完全に消失した後も、照射を継続します。透過光チャネルで重合したジアミノベンジジンの褐色の光酸化生成物が出現するまで照射してください。その後、pH 7.4の0.1 M sodium Cate緩衝液に溶解した2%グルタルアルデヒド 1 mLを用いて、細胞を30分間後固定します。

次に、pH 7.4の0.1 M sodium Cate緩衝液中にて、0.1〜0.5%四酸化オスミウムを用いて20分間、細胞膜を固定します。固定後、一連のエタノール洗浄によって細胞を脱水させます。その後、100%エタノールとアクリル樹脂を1:1で混合した液中で、シェーカーを用いて4時間、細胞をインキュベートします。

次に、混合物を除去し、サンプルに100%アクリル樹脂をさらに4時間加えます。樹脂を重合させるため、ラベルを貼った2 mLマイクロ遠心チューブの蓋をカミソリで切り落とし、縁にアクリル樹脂促進剤を塗布します。パステアパイプパッドを用いて、チューブの約3分の2までLRホワイトレジンを慎重に充填します。

樹脂がリム上の促進剤に接触しないように注意してください。ディッシュ内のセルに浸入した樹脂を取り除き、ディッシュを逆さまにして直立させたマイクロ遠心チューブの上に置きます。この際、チューブの幅がディッシュウェイトのガラス製観察窓をほぼ完全に覆うように配置します。促進剤がチューブとカバーガラスを密閉するまで1〜2分間待ちます。

次に、チューブを反転させ、チューブ内のレジンが細胞を覆うようにします。チューブを入れたディッシュを60 °Cのオーブンに入れ、12時間硬化させます。ブロックが硬化したら、レジンが充填されたマイクロ遠心チューブが装着されたディッシュをオーブンから取り出し、マイクロ遠心チューブをディッシュから切り離します。

ガラスボトムディッシュを廃棄し、マイクロ遠心チューブをカミソリで慎重に切り開いてブロックを取り出します。カミソリを用いて、ダイヤモンドペンまたはタングステンペンで事前に印を付けた1 mm²の領域のみが残るようにブロックをトリミングします。次に、ブロックを超ミクロトームにセットし、トリミングナイフで細胞が現れるまでトリミングします。

次に、ダイヤモンドナイフに切り替え、細胞を厚さ約 50 nanometers の超薄切片として切断します。これらの切片を透過率の高い 300 mesh グリッドで回収します。その後、グリッドをカーボンコーターに入れ、透過電子顕微鏡の電子ビーム下での安定性を高めるため、切片に約 0.2 から 0.4 nanometers のカーボンをコーティングします。

エネルギーフィルターを備えた透過電子顕微鏡にグリッドをロードします。低倍率の通常透過モードを用いて切片上の細胞を観察し、事前に撮影した蛍光画像と比較します。DNA損傷トラックまたはDNA修復フォーカスを持つ核が見つかったら、エネルギーフィルタリングモードに切り替え、厚さマップとともにサンプルを記録します。

次に、スリット幅 20 electron volts で、エネルギー損失 175 electron volts におけるリンのポストエッジ画像を記録します。また、窒素マップの記録用に、同様にスリット幅 20 electron volts で、エネルギー損失 120 electron volts におけるプリエッジ画像も記録します。さらに、スリット幅 35 electron volts で、447 electron volts のポストエッジ画像および 358 electron volts のプリエッジ画像を記録します。

また、スリット幅を35 electron voltsに設定します。このように、画像処理ソフトで元素比マップを開きます。RGB画像の赤色チャンネルに窒素マップを、緑色チャンネルにリンマップをコピーしてください。

次に、マップを重ね合わせ、アライメントを行います。合成画像をTIFF形式でエクスポートし、レイヤー機能が使用可能な画像処理ソフトウェアで開きます。続いて、画像内の最小値と最大値を8ビットデータセットにリスケーリングすることで、各チャネルのダイナミックレンジを調整します。

次に、レイヤーウィンドウ内で窒素マップからリン含有量を差し引きます。画像をインデックスカラーに変換し、核酸分布を示すマップにはCMYK色空間で黄色のルックアップテーブルを、非クロマチンタンパク質マップにはシアンのルックアップテーブルを作成します。その後、新しい画像を作成し、リンと非クロマチンタンパク質の分布を示すマップをそれぞれ別のレイヤーとしてインポートします。

画面の透過モードを使用して、2つのレイヤーを互いに重ねて表示します。ここでは、RGB色空間で2つの比率マップを重ね合わせた際の、細胞核内部におけるリンと窒素の位置を示す電子分光比率マップが表示されています。このような画像は、本の手順によって得られます。

黄色の構造は、リンと窒素の両方が存在することを示す核タンパク質を表しています。ここでは、電子分光イメージングを用いて、U2 OS細胞におけるガンマ線照射後のフォーカス構造の変化を観察しています。最上段は、M cherryタグ付き修復タンパク質を安定的に発現させ、照射していない細胞の画像です。

2行目は、放射線照射から3時間後に固定した細胞を示しています。3行目は、放射線照射から6時間後に固定した細胞を示しています。電子分光イメージングにより、フォーカスの構造が時間とともに再編成されることが明らかになりました。窒素シグナルで示される53 BP1タンパク質の相対量が増加する一方で、リンシグナルで示されるクロマチンがより周辺部に位置するようになります。

このビデオを視聴することで、電子分光イメージングを用いてDNA修復フォーカスにおけるクロマチンの超微細構造を解析するための、DNA修復タンパク質を発現させた照射細胞の調製方法について十分に理解できるはずです。サクシン酸グルタールアルデヒド緩衝液、シアン化カリウム、および四酸化オスミウムの使用は極めて危険であるため、本手順の実施中は、常にドラフトチャンバー内での作業や手袋の着用などの予防措置を講じることを忘れないでください。