Name: 電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI） (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: 学ぶ、miniSOGタグ付きDNA修復タンパク質の電子分光イメージングによる可視化法。ナノスケールで二重鎖DNA切断周辺のタンパク質分布をマッピングし、損傷クロマチンの超微細構造を解析する技術です。

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私たちは、私たちにminiSOGコンストラクトを提供してくださったDr. Roger Tsienに感謝します。また、TEMの支援をしてくださったDr. Xuejun Sunに感謝します。リサ・レムとクロスがん研究所のピーター・シップルは、酸素を供給してくれました。Hilmar Strickfadenは、アルバータがん財団からポスドクフェローシップを受けており、Bayrische Forschungsallianzの支援を受けています。この研究は、Canadian Institutes of Health ResearchおよびAlberta Cancer Foundationからの助成金によって支援されました。

miniSOG細胞株の1世代<ol><li> 5％CO 2の加湿インキュベーター中、37℃で、10％ウシ胎児血清（FBS）を補充した低グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）の2 mlを含む35 mmディッシュにU2OS（ヒト骨肉腫）細胞を増殖させます雰囲気。 </li><li>彼らはminiSOGとmCherryをのための配列を含むプラスミド構築物をトランスフェクション試薬19の製造業者のプロトコルに従って修復タンパク質をタグ付けされた精製されたトランスフェクションの質（A269 / 280比1.8〜2.0）でリポフェクション80％コンフルエントである場合には細胞をトランスフェクション。 miniSOG発現プラスミドは、ツィン・ラボから注文することができます<a href="http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm">。http://www.tsienlab.ucsd.edu/Samples.htm</a> </li><li>ソート蛍光活性化細胞によってminiSOGとmCherryをタグで組換えタンパク質を発現する細胞は、2日後にトランスフェクションをソートします。細胞を回収20を過剰発現している細胞を回避するために、中間蛍光強度を持ちます。 </li><li>培養10％FBSおよび選択剤G418（ジェネティシン）0.6 / mlのが補充されるDMEM培地10ml中で10cmのディッシュ上の陽性細胞。 </li><li>目に見えるコロニーがプレート上に出現した後、mCherryを陽性コロニーのための画面が倒立蛍光顕微鏡を使用して、恒久的なマーカーで（プレートの底部に）自分の周りの円を描きます。低倍率の空気対物レンズ（例えば、10倍）を使用して、慎重にコロニーを掻き、ゆっくりと滅菌千μlのピペットチップにそれらを吸引することにより、無菌技術を使用してクローンを選択します。 </li><li>選択したコロニーを展開し、10％のジメチルスルホキシドを補っステップ1.1で説明した成長培地を用いて、それらの一部を下に凍結。無菌の18×18 mm 2のカバースリップ上に成長しており、それらを暴露することによってDRF形成のための細胞をテスト放射線の2 Gyの。安定miniSOG mCherryをを発現して照射された細胞は、mCherryをを画像化するためのフィルタが設定され使用して蛍光顕微鏡で可視化したときに修復タンパク質は、DSBは典型的な焦点パターン特性を示さなければならないタグ​​付け。 </li></ol> 2.細胞培養<ol><li>安定miniSOGとmCherryをを表現する文化U2OS細胞は、ステップ1.1に概説された条件の下で修復タンパク質をタグ付け。 2mlのDMEMを含む35ミリメートル直径のガラスボトムディッシュに80％コンフルエントに細胞を増殖させます。プラスチックや使用されるプラスチックにカバースリップを添付接着剤が使用される樹脂の水溶液とアルコール溶液に耐性と耐性であることを確認してください！ </li><li>実験を行う前に、関心領域を識別するために、蛍光顕微鏡を用いて滅菌ダイヤモンドペンを用いてスクラッチすることにより異所性タンパク質を発現する細胞を含む約1mm 2の小領域の輪郭を描きます。あるいは、ガラス底皿tを使用帽子はカバーガラスに内蔵されたプリエッチングされたグリッドシステムとカバーガラスが含まれています。 注：ESIおよび蛍光顕微鏡写真21を組み合わせ 、高品質な相関顕微鏡を使用している場合は、カバーガラスの厚さは、油浸対物レンズとの互換性があることを確認してください。これは、厚さ1.5号（0.16〜0.18ミリメートル）を持っている必要があります。領域は、エッジ付近で発生する可能性がある樹脂の重合の問題を回避するために、TEMで検査するために皿の中央に近いエリアを選択してください（ポイント4.10から4.13を参照）。 </li></ol> 3. DNA損傷誘導<ol><li> 、ガンマ線を用いて細胞を照射放射線様薬剤を使用するか、（18,22または 23に記載されているように、 例えば ）共焦点顕微鏡にレーザーマイクロ照射による損傷を誘発。 </li><li>この例では、405nmのゾルを用いたセシウム137線源またはレーザmicroirradiateでガンマ線照射の2及び6 Gyを用いて細胞を照射します0.5 / mlのヘキストで20分間細胞を感作した後、共焦点顕微鏡のid固体レーザ。 </li></ol> 4.サンプル調製<ol><li> 0.1Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液中または暗所で室温で30分間、0.1 Mリン酸緩衝液pH 7.4中の4％パラホルムアルデヒド注意1mlで細胞を固定してください。 注意：パラホルムアルデヒドとカコジル酸ナトリウムは有毒です！手袋を着用し、適切に有害物質を廃棄してください。 </li><li> 4ミリリットルの0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液pH 7.4のリン酸緩衝液pH 7.4で細胞を2回洗浄します。 </li><li> 2ミリリットルの50mMグリシンで固定した細胞を治療、5 mMのアミノトリアゾールと30分間、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液または0.1 Mリン酸緩衝液（pH 7.4）中の10mMシアン化カリウムの注意（pH値をチェック！）未ブロックするために、アルデヒド基とは、バックグラウンドを増加させることができ、ヘム基によって生成された活性酸素種を抑制する。 注意：シアン化カリウムは非常に有毒です！ W耳の手袋は、ボンネットの下で働くと十分に有害物質を廃棄してください。それはpHが検証され、正確であることが重要であるので、反応は、pHに非常に敏感です。 </li><li>相関顕微鏡法が所望される場合、倒立蛍光顕微鏡上で2Dまたは3Dのステップ2.2で選択された領域を記録します。 </li><li> 2ミリリットルのマイクロチューブに10 mgのジアミノベンジジン塩酸塩錠を配置することによって、1 mg / mlのジアミノベンジジン塩酸注意溶液を調製します。蒸留H濃塩酸（11.65 M）の2 Oおよび20μlの980μlを添加し、溶液が淡褐色半透明になるまで混ぜます。 7.0と7.6の間のpHに水酸化ナトリウムでpHを調整しながらの1mg / mlの最終濃度になるように0.1 Mリン酸または0.1Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液中にこの溶液を希釈液（pH 7.4を推奨）。 注意：ジアミノベンジジンが有毒です！手袋を着用し、適切に有害物質を廃棄してください。 </li><li>光酸化のために、Replace、0.1Mカコジル酸ナトリウム緩衝液またはリン酸緩衝液中1 mg / mlのジアミノベンジジン塩酸溶液2 mlのバッファー。光からこの溶液を保護し、酸素の溶解度を増加させるために4 O Cに氷上で冷却します。 （溶液中に挿入し、酸素ボンベに接続されたホースを使用）溶液に酸素をバブリングすることによって酸素を含む溶液を飽和。再びのpHを確認し、必要に応じて調整してください。 注：これは、pHが7.0およびpH 7.6の間であることを光酸化反応のために非常に重要です。 </li><li>慎重に40倍油浸対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡上に固定された細胞を用いた料理をマウントして、関心のある領域に移動します。 GFPまたはCFPのためのフィルターキューブを使用して青色光とminiSOGタグエキサイト。 MiniSOGは473 nmの10で肩を448 nmで励起最大値を有します。 </li><li>でも緑miniSOG蛍光ヘクタール後に照明を続行完全に消失し、重合ジアミノベンジジンの茶色の光酸化物は、透過光路に出てくるまでです。酸化生成物は、細胞の大部分に表示されている場合には、光酸化を停止するために、蛍光照明をオフにします。 注：光酸化は、対物レンズ、フィルタ透過波長と効率、および照明源に応じて数分かかることがあります。 </li><li> Postfixの0.1 Mカコジル酸ナトリウムのpH7.4の緩衝液または30分間、リン酸緩衝液pH7.4中の2％グルタルアルデヒドの1 mlの細胞。 </li><li> 0.1Mのカコジル酸ナトリウム緩衝液pH 7.4または0.1でMリン酸緩衝液pH 7.4で20分間0.1％-0.5％の四酸化オスミウムを用いて細胞の膜を修正。 注：これは、膜を安定化するために必要な四酸化オスミウムの可能な限り低い濃度を使用することをお勧めします。重合DAB沈殿物はESI、強いによって直接検出することができ、窒素の高い密度を有するためオスミウム染色はminiSOGタグ化タンパク質を識別し、ESIにとって有害で​​あるかもしれない必要はありません。四酸化オスミウムは毒性が非常に強いです！ヒュームフードで作業し、適切に有害廃棄物を処分します。 </li><li> 30％、50％、70％、90％、98％、100％エタノールステップ（各5分）を​​用いて、エタノールシリーズを通して、細胞を脱水します。その後、1で細胞をインキュベートする：100％エタノールおよびアクリル樹脂（LRホワイト）の1ミックス100に少なくともさらに4時間、細胞をインキュベートする前に、細胞への浸透を容易にするために4時間シェーカー上に皿を置き％アクリル樹脂（LRホワイト）。 </li><li>樹脂を重合させるためには、カミソリの刃とコートアクリル樹脂アクセラレータとの縁で標識した2ミリリットルのマイクロチューブの蓋を遮断。アクセラレータだけ縁をカバーし、チューブ内に流れないことを確認してください。その後、慎重にパスツールピペットを用いて、LRホワイト樹脂で約2/3のチューブを埋めます。樹脂が接触ウィットに入らないように注意してくださいHリムの加速器！ </li><li>皿に細胞を浸透させた樹脂を外し、チューブの幅はほぼ完全に皿のガラス覆われた観察窓をいっぱいにするように直立マイクロチューブの上に逆さに皿を置きます。 </li><li>その後、チューブとカバーガラスを密閉チューブ内の樹脂は、現在のセルを覆うようにチューブを反転させる加速器のために1〜2分待ってください。 </li><li> 60℃のオーブンの中にチューブでシャーレを置き、12時間のためにそれを治します。 </li><li>ブロックが硬化されると、オーブンから添付樹脂充填マイクロチューブでシャーレを削除し、皿からマイクロチューブを分離します。液体窒素と熱水中で凍結融解サイクルによる分離を促進します。 </li><li>ガラスボトムディッシュを捨て、慎重にブロックを除去するために、かみそりの刃でマイクロチューブを切断してオープン。 </li><li>永久的なマーカーでブロックにラベルを付けます。 </li><li>トライにカミソリの刃を使用します以前にダイヤモンドやタングステンペンでマークされた領域が含まれています（または目的の細胞の領域が含まれています）1ミリメートル2地域が、何も残らないようにブロックをm個。 </li><li> 、ウルトラミクロトームでブロックをマウントトリミングナイフでブロックをトリミングし、ダイヤモンドナイフを用いて、約50nmの超薄切片を切りました。 </li><li>高透過300メッシュのグリッド上のセクションをピックアップ。これらのグリッドは非常に小さいグリッドバーを持っているので、興味のある領域での少ないセルをカバー。 </li><li>コー​​ト炭素の約0.2〜0.4ナノメートルとグリッド上のセクションでは、TEMの電子ビームの下でそれらの安定化を助けるためにカーボンコーターを用いて。 </li></ol> 5.電子顕微鏡<ol><li>エネルギーフィルタを装備していたTEMにグリッドをロードします。製造者の指示に従って顕微鏡及びエネルギーフィルタをチューニングした後、低倍率モード（通常伝送）のセクション上の細胞を検査し、比較しますそれら（ステップ4.4で得られた）ときに適切なデータを蛍光します。 </li><li>興味深い機能（DNA損傷トラックまたはDNA修復フォーカス）と核が発見されると、エネルギーフィルタリングモードに切り替えて、厚さマップを記録します。 注：この手順は、ゼロ損失とフィルタ処理されていない画像の記録が含まれています。 0.3までの厚さはフリーパス（入射ビームの電子の30％は、試料によって散乱されます）は、良好な元素マップを生成するのに十分薄いことを意味します。 </li><li>使用顕微鏡のエネルギーフィルタを制御するソフトウェアを使用して、要素のリンと窒素のレコード比マップ。また、20 eVでのスリット幅と、120 eVのエネルギー損失で20 eVのプリエッジ画像のスリット幅を175 eVのエネルギー損失でリン地図ポストエッジ画像を記録します。窒素マップ、また、35 eVでのスリット幅を有する358 eVでの35 eVのプリエッジ画像のスリット幅を有する447 eVのに記録後エッジ画像については。 注：画像形成された要素の内容以来（ホスホオルス及び窒素）が（約1％）、より良い信号対雑音比を有する画像を生成するために、「3ウィンドウ法」上の「比画像」（定性元素マップ）（元素マップを定量化）を選択し、相対的に低いです。 </li></ol> 6.画像処理<ol><li> （例えば、デジタル顕微鏡写真）を取得写真のファイル形式を扱うことができる画像処理ソフトウェアに元素比マップを開きます。マップを重ね合わと揃えた後、RGB画像のグリーンチャンネルに赤チャネルへの窒素マップとリンマップをコピーします。 </li><li>タグ付き画像ファイル形式（TIFF）ファイルとして合成画像をエクスポートします。 層 （例えば、フォトショップ）を使用することができ、画像処理ソフトで画像を開きます。 </li><li> 8ビット・データ・セット（0〜255）に画像内の最小値および最大値を再スケーリングすることにより、各チャネルのダイナミックレンジを調整します。 </li><li>使用した窒素マップ（のリン含有量を差し引きますタンパク質の分布を示す定性マップを生成するために「レイヤー」ウィンドウ）。 </li><li> 「インデックスカラー」に、前のステップで作成した核酸（リン）のマップとタンパク質（窒素）を変換した核酸分布を示すマップのCMYK色空間とシアンルックアップテーブルに黄色のルックアップテーブルを作成します非核地図を表示します。色は、二つの要素間の最大コントラストマップを生成するように選択されます。 </li><li>新しいイメージを作成し、異なる層としてリンとタンパク質の分布を示すマップをインポートします。お互いに重畳された両方の層を表示するには「スクリーン」透明度モードを使用してください。 </li><li>ステップ5.2で取得したゼロ損失画像を開きます。この画像は、従来のTEM像のように見えるだけで、試料に衝突することなく、試料を​​透過した電子を含んで記録された領域の画像を表しています。エクスポートTIFF画像としてこの画像。 </li><li>フォトエディタでエクスポートゼロ損失の画像を開き、元素マップを示す画像の最上層にコピーします。 「スクリーン」透明度モードを使用して画像の位置を合わせます。 </li><li>必要に応じて、閾値セグメントにゼロ損失画像miniSOGに由来する信号。上記のように別の層として得られる画像を追加します。 </li></ol>

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著者らは開示するものは何もない。

ESIは、それが具体的にリンが豊富な領域をマッピングすることが可能であるため、核内でクロマチンとリボの異なる状態を調べるための優れたツールとして機能することができます。それは深く、電子顕微鏡によって得ることができる詳細の量を増大し、非特異的な対照的な方法に依存していません。 ESIの1つの欠点は、同じ加速電圧で、従来のTEMより薄いセクションを必要とすることです。これは、連続切片での作業や断層撮影法28を使用することによって克服することができます。 多くの情報は、リンと窒素の分布を見ることによって得ることができるが、それはまた、特定のタンパク質の分布をマッピングできることが重要です。本論文で提示された方法では、ESIは、ジアミノベンジジンの部位特異的重合に基づいている方法と組み合わせることができることを実証しました。この方法は、FUを追加しませんがESIにLLの新色は、それがタンパク質の分布をマッピングすることが明らかに便利です。これは、クロマチンと相互作用するタンパク質に当てはまります。研究は、二つ以上のタンパク質の集団を可視化する必要がある場合は前の光酸...

近年1以上の光学顕微鏡の大幅な進歩にもかかわらず、細胞生物学者は、まだ解像度のギャップに苦しんでいます。これは、巨大分子複合体の協調相互作用を伴う基本的な細胞プロセスにおける構造と機能の関係の理解を制限する（例えば、クロマチンリモデリング、DNA修復、RNA転写およびDNA複製で）。透過電子顕微鏡（TEM）は、必要な分解​​能を提供だが、それはまた、視覚化構造の生化学的組成を決定することができる一方で、特定のタンパク質を標識するために、構造的にできないので、これらのプロセスを定義するために挑戦してきました。核構造を区別するのに役立つ内部の膜が存在しない場合には、核が特に困難となっています。電子分光イメージング（ESI）は、DNA、RNA、およびPROTの同時検出および区別を可能にすることにより、これらの制限のいくつかを解決しますEINベースの核構造2-5。 電子分光イメージング。 電子顕微鏡での高感度と分解能で元素の分布をマッピングするためには、非弾性的に試料6の要素の内殻電子との相互作用を介して散乱された電子を選択画像分光計を使用することができます。エネルギーの要素固有の量が試料中の原子のイオン化の結果として失われるので、これらの電子は、電子顕微鏡に取り付けられた分光計を用いて分離し、可視化することができます。このように、試料と相互作用した電子のスペクトルの分析は、 試料 7の元素組成に関する定性的および定量的情報を明らかにする。試料を通過する際にエネルギーを失わない電子は、電子エネルギー損失の「ゼロ損失ピーク」に見出されますスペクトル。これらの電子の存在量は、試料の質量、密度および厚さに関係し、試料に衝突または試料を通過する間にエネルギーを失うことなく、試料を​​通過する電子から構成されています。この情報は、試料8中に存在する特定の元素の原子数の絶対的な定量化のために有用であり得ます。 生物学的サンプルは不十分TEMの入射ビーム中の電子を偏向する光素子の大部分から構成されているため、重金属塩を使用する染色方法は、試料のコントラストを生成するために適用されなければなりません。これらの造影剤の多くの特異性および特異性が可能な複数の染色を可視化することができないことがないことは、核の研究において、従来の電子顕微鏡の値を制限しています。 ESIは、特に細胞核の構造の研究のために、従来のTEMを超える大きな利点を持っています。これは、タンパク質複合体の核タンパク質複合体を区別するために、および核酸のそれらの濃度に基づいて、種々の核タンパク質複合体を解決するためのDNA-及びRNAを含む高分子複合体のリンが豊富な性質を利用することが可能です。残りの生物学的物質は、窒素の存在量に基づいて画像化することができます。異なる解剖学的構造内のマッピングだけでこの2つの要素とそれらの分布と相対量の分析は、核に関する多くの情報を提供してくれます。例えば、それは、クロマチンとリン存在量を示すマップでリボソームを同定することは容易です。 interchromatin空間、核膜孔複合体、および核小体は、一方で、簡単に窒素マップ画像で検出することができます。 ミニ一重項酸素発生システム（miniSOG） それが取るので、ESIは、 その場でのクロマチン構造で勉強するための強力な技術を表していますリンと窒素の元素組成における特性の比の利点は、元素組成は、通常、タンパク質複合体の異なる集団の間で区別するために使用することができません。ナノメートル範囲の小さな金粒子で標識された抗体は、広く、個々の分子の位置をマッピングするために使用されてきました。金粒子は、通常、二次抗体に結合しているので、一次抗体によって検出されるエピトープの周囲に約20nmの円周内に表示されます。埋め込み後の試料では、抗体は、セクションの表面に露出されるエピトープを検出することができます。それは、抗原の存在を証明し、細胞の特定の解剖学的構造に関連することが可能であるがエピトープの大部分が樹脂によって覆い隠されているので、得られた情報は、不完全です。全体を通して、抗原へのアクセスを許可し、蛍光顕微鏡検査のために使用されるものと同様のプロトコルを使用する技術を、事前に埋め込みサンプルの全体の深さが、典型的には脂質膜の除去を必要とアルデヒドで固定することができない成分を除去する抗体が細胞に侵入することを可能にするために必要とされる透過化のステップ。また、超微細構造の保存のための好適なアルデヒド固定液、グルタルアルデヒドは、一般的にエピトープを破壊し、その結果、パラホルムアルデヒドは、一般的に必要とされます。これは、タンパク質 - タンパク質架橋にあまり効果的です。金ナノ粒子で標識された抗体の別の欠点は、金が弱いコントラストを有するサンプルの興味深い構造の詳細を隠すことができ、強いコントラストを作成し、非常に電子密度の高い材料であることです。 発現したタンパク質タグとして緑色蛍光タンパク質（GFP）の出現は、細胞生物学の質問に答えるために、蛍光顕微鏡の使用を変えてきました。小さ ​​な蛍光ドメインを有するタンパク質をタグ付けすることは、生体内でその分布のマッピングを可能にします</eM&gt;の構造を変更することができる透過性手順を必要とせずに。電子顕微鏡法に細胞内のタンパク質の分布をマッピングするためにタンパク質タグを使用してエレガントな原理を変換するために、システムは、関心のある構造に近い信号を生成し、TEMのコントラストを生成することができることが必要でした。重合したジアミノベンジジンは、しばしば、抗体結合を検出するために、組織学に使用される染色あります。この染色は、通常、二次抗体にコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）を用いて堆積されます。反応は信頼性の高い結果を生成するが、HRPは、 セル 9の細胞質ゾルに触媒活性ではありません。その解像度はナノゴールド法10よりも悪いようにHRPの反応生成物も生成部位から離れて拡散することができます。これらの問題を回避するために、フラッシュ/ ReAsHシステムが11を開発しました。これは、テトラシステインモチーフを保有する組換え融合タンパク質で構成されています。このモチーフは、との結合ができますbiarsenic蛍光団。励起されると、結合したFlashやReAsHは、標識タンパク質の現場ですぐに沈殿するポリマーへの反応性の高い一重項酸素を生成するので、photoconvertジアミノベンジジン（DAB）することができます。 DABポリマーは、電子密度で四酸化オスミウムで染色することができ、TEMでの組換え融合タンパク質の分布をマッピングするために使用することができます。 2011年には、シュウら 10は、蛍光灯や448 nmの青色光で励起されたとき、多くの一重項酸素ラジカルを生成することが可能であるシロイヌナズナのフラビンタンパク質由来の小さな106アミノ酸の融合タグで構成されていminiSOGシステムを発表しました。それらの一重項酸素ラジカルは11免疫標識された抗体よりもかなり近いタグタンパク質の表面に近くポリマーを形成する光酸化ジアミノベンジジンを使用することができます。フラッシュ/ ReAsHシステムは、フルオロをもたらす必要があるがクロムと光変換を行う前に、細胞へのジアミノベンジジン、miniSOGシステムのみジアミノベンジジン、光を必要とし、加えて、ジアミノベンジジンを重合で約2倍の効果があります。ここで、miniSOGはDNA修復フォーカスの超微細構造をマッピングするために、ESIと組み合わせて使用​​されます。 DNA修復巣（DRF） 彼らは転座と遺伝情報の損失につながることができますので、未修復のDNA二本鎖切断は、細胞への深刻な脅威をもたらします。今度は、これが老化、癌、及び細胞死をもたらすことができます。 DNA二本鎖切断修復に関与している多くのタンパク質は、DNA二本鎖切断12-14の周りに組み立てる病巣に蓄積します。それらの機能は不明であるが、それらは、DNA二本鎖切断を含み、DNA二本鎖切断修復の部位である、核内の部位を表します。 DNA修復FOC私（DRF）は、蛍光顕微鏡によって特徴付けられており、それらはDNA損傷12,15のためのバイオマーカーとして役立ちます。これらは、二本鎖切断のサイズに大量の相対的であり、最近の超解像顕微鏡研究は、それぞれ16を集中内の分子のサブ区画のいくつかの証拠を明らかにまで比較的均質と考えられました。これらの部位は組織化されている方法を理解するために、互いに対して基礎となる生物学的構造のすべてを可視化することが必要です。これは、蛍光顕微鏡検査によって達成さが、電子顕微鏡17,18を介して可能であることはできません。ここでは、この方法は、DNA二本鎖切断修復の超微細構造を探索するために、この組み合わせアプローチの可能性を示すためにminiSOG法により電子分光イメージングを組み合わせることが記載されています。

<table><tbody><tr><td>35 mmガラス底皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>グリッド35 mmガラス底皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-2-14-CGRD&nbsp;</td><td>浸漬対物レンズ用には作られていません</td></tr><tr><td>LRホワイト:アクリル樹脂</td><td>emsdiasum</td><td>14381</td><td></td></tr><tr><td>LRホワイトアクセラレータ</td><td>emsdiasum</td><td>14385</td><td></td></tr><tr><td>3,3&prime;-ジアミノベンジジン四塩酸塩10 mg錠</td>シ<td>グマ</td><td>D5905</td><td></td></tr><tr><td>スリムバーグリッド300メッシュ</td><td>SPI</td><td>1161123</td><td></td></tr><tr><td>タングステンポイントラボペン</td><td>emsdiasum</td><td>41148</td><td></td></tr>四<tr><td>酸化オスミウム</td><td>emsdiasum</td><td>19100</td><td></td></tr><tr><td>カーボンコーター 208 カーボン</td><td>クレッシントン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウルトラミクロトーム ライカ EM UC6</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photoshop CS5</td><td>アドビ</td><td></td><td>は古いバージョンでも動作するかもしれません</td></tr><tr><td>デジタルマイクログラフ V.2.30</td><td>ガタン</td><td></td><td>は古いバージョンでも動作するかもしれません</td></tr><tr><td>ヘキスト 33342</td><td>シグマ</td><td>H-1399</td><td></td></tr><tr><td>Effectene</td><td>Quiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniSOG-Constructs</td><td>Tsien-Lab</td><td></td><td><a href="mailto:tsienlab@yahoo.com">tsienlab@yahoo.com</a</td></tr><tr><td>>MDC1 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>53BP1 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rad52 miniSOG mCherry</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>セシウム137放射線源「マーク1」</td><td>&nbsp;(J.L.シェパード&Associated)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ/FiJi</td><td>オープンソース</td><td></td><td>http://fiji.sc/Fiji</td></tr><tr><td>2 ml Eppendorf tubes</td><td>Fisherbrand</td><td>05-408-146</td><td></td></tr><tr><td>Diamond Knife ultra 35&deg;</td><td>ジアトメー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>トリミング ナイフ ウルトラトリム</td><td>ジアトメー</td><td></td><td></td></tr>ム <tr><td>カコジル酸ナトリウム三水和物</td><td>エムスディアム</td><td>12300</td><td>注意 有毒!</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒドEMグレード8%</td><td>エムスジウム</td><td>16020</td><td>注意有毒!</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>エムスジウム</td><td>21180</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性</td><td>エムスディアム</td><td>21190</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>エムスディアス</td><td>ム 19202</td><td></td></tr><tr><td>四酸化オスミウム 4% 溶液</td><td>エムスディアスム</td><td>19150</td><td></td></tr><tr><td>反転蛍光 マイクロスコープ アクシボバート 200M</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>フィッシャーブランド</td><td>A142-212</td><td></td></tr>水<tr><td>酸化ナトリウム溶液10M</td><td>フルーカ</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>酸素</td><td>メディガス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-アミノ-1,2,4-トリアゾール</td><td>シグマ</td><td>A8056</td><td></td></tr>シ<tr><td>アン化カリウム</td><td>シガン</td><td>207810</td><td>注意有毒!</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>emsdiasum</td><td>15058</td><td>注意有毒!</td></tr><tr><td>かみそりの刃、シングルエッジ、炭素鋼</td><td>、emsdiasum</td><td>71960</td><td>、コーション、シャープ!</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D 5546</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Life Technologies</td><td>11811-023</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>透過型電子顕微鏡 200 kV</td><td>JEOL</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>GIF Tridiem 863 エネルギーフィルター</td><td>ガタン</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

電子分光イメージングと組み合わせたminisogタグ付きのdna修復タンパク質の可視化（esi）

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

光学分解能透過型電子顕微鏡における特定のタンパク質の集団を同定する課題には限界が細胞生物学における障害となっています。多くの現象は、簡略化システムインビトロ分析により説明と完全に理解されるために、特に1nmから0.1μmの間の範囲内で、 その場で追加の構造情報を必要とすることはできません。ここで、電子分光イメージング、タンパク質および核酸の分布の同時マッピングを可能にする、透過電子顕微鏡法、および発現タグ、miniSOGは、DNA二本鎖切断修復巣の構造と組織を研究するために組み合わされます。

ESI 従来のTEM像と核（ 図1）のESIの画像を比較すると（例えば、 図7-1）を容易に識別することができる解剖学的構造の劇的な増加を明らかにしています。クロマチンリッジは黄色で表示され、それがマウス細胞中でchromocentersを識別することは非常に簡単です。予め組み立てられたリボソームは既にリンが豊富でRNAに加えて、窒素に富んでいるタンパク質を大量に含むので、核小体が容易に、そのラウンドの構造と異なる色でクロマチンと区別することができます。周辺クロマチンは、核の境界線上に薄い層として存在し、核膜孔は、周辺のクロマチンを中断窒素リッチな構造と見ることができます。多くの場合、ラミナは、周辺クロマチンの外側に非常に薄い青色層と見ることができます。細胞質中のリン缶が豊富で、多くの小さな粒子見られます。これらは、核外にそれらのサイズ、量および位置に基づいてリボソームとして同定することができます。 interchromatin空間は、クロマチ...

電子分光イメージングは、ナノメートルの分解能で核酸とタンパク質を画像化し、区別することができます。miniSOGシステムと組み合わせることで、透過型電子顕微鏡サンプル中のタグ付きタンパク質を特異的に標識することができます。これらの技術の使用を例として、二本鎖断線修復病巣を使用して説明します。

電子分光イメージングと組み合わせたminiSOGタグ付きのDNA修復タンパク質の可視化（ESI）

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

本実験の全体的な目的は、ナノスケールで二本鎖DNA切断部位周辺のDNA修復タンパク質の分布をマッピングすることです。これにより、電子分光イメージングを用いて、修復過程にある損傷クロマチンの超微細構造を研究します。これは、蛍光タンパク質とmini SOGタグを用いたDNA損傷応答タンパク質の融合タンパク質をコードするDNA発現コンストラクトを作製することで達成されます。第2ステップとして、トランスフェクションによってコンストラクトを細胞内に導入し、その後、レーザー照射またはガンマ線照射によって細胞に損傷を与えます。次に、照射および固定された細胞に対し、電子顕微鏡での作製工程を行い、mini SOGタグ付き修復タンパク質の分布を電子顕微鏡で可視化できるようにします。得られた電子分光イメージングにより、クロマチンの超微細構造および特定のタンパク質とDNA修復フォーカスとの関係の解析を可能にする詳細な画像が得られます。ImmunoGold標識などの他の既存技術に対するこの技術の主な利点は、抗体の入手可能性に依存せず、標的構造を高密度に標識できることです。一般的に、この手法に不慣れな方は、光酸化がpH、光強度、および酸素飽和度に非常に敏感であるため、困難に直面します。光酸化、酸素飽和度、および照明のステップは極めてわずかな変化に敏感であるため、この手法を再現するためには、実際の手順を視覚的に提示することが不可欠です。私の研究室のポストドクターであるHilmar Fadden博士が、培養の手法を実演します。付随するテキストプロトコルに記載されている通り、mini SOGおよびM cherryタグ付きの修復タンパク質を安定発現させたヒト骨肉腫細胞を使用します。10 cmディッシュから細胞を継代した後、コンフルエンシーが80%になるまで細胞を増殖させます。次に、細胞を蛍光顕微鏡下に置き、滅菌済みのダイヤモンドペンを使用して、異所性タンパク質を発現しマークされた細胞を含む約1平方ミリメートルの小さな領域を囲みます。溶液にherxを添加して最終濃度を0.5 µg/mLにし、細胞を感作させた後、37 °Cのインキュベーターで20分間置きます。その後、共焦点顕微鏡の405 nm固体レーザーを用いて細胞にレーザーマイクロ照射を行い、DNA損傷を誘発します。DNA損傷後、室温で0.1 M 炭酸ナトリウム緩衝液に溶解した4%パラホルムアルデヒド 1 mLを用いて、暗所で30分間細胞を固定します。pH 7.4の0.1 M sodium Cateバッファー4 mLで細胞を2回洗浄します。次に、固定した細胞に、50 mM glycine、5 mM amino triazole、および10 mM potassium cyanideを含むpH 7.4の溶液2 mLを加え、30分間処理します。その後、バッファーを、付属のテキストプロトコルに従って調製したpH 7.4の光酸化バッファー2 mLに交換します。次に、溶液に酸素をバブリングして酸素飽和状態を維持しながら、サンプルを氷上で暗所でインキュベートします。続いて、固定細胞が入ったディッシュを、40 x 油浸対物レンズを備えた倒立蛍光顕微鏡に慎重にセットし、先に設定した関心領域まで移動させます。緑色蛍光タンパク質用のフィルターキューブを用いて、青色光でmini SOGタグを励起させます。緑色のmini SOG蛍光が完全に消失した後も、照射を継続します。透過光チャネルで重合したジアミノベンジジンの褐色の光酸化生成物が出現するまで照射してください。その後、pH 7.4の0.1 M sodium Cate緩衝液に溶解した2%グルタルアルデヒド 1 mLを用いて、細胞を30分間後固定します。次に、pH 7.4の0.1 M sodium Cate緩衝液中にて、0.1〜0.5%四酸化オスミウムを用いて20分間、細胞膜を固定します。固定後、一連のエタノール洗浄によって細胞を脱水させます。その後、100%エタノールとアクリル樹脂を1:1で混合した液中で、シェーカーを用いて4時間、細胞をインキュベートします。次に、混合物を除去し、サンプルに100%アクリル樹脂をさらに4時間加えます。樹脂を重合させるため、ラベルを貼った2 mLマイクロ遠心チューブの蓋をカミソリで切り落とし、縁にアクリル樹脂促進剤を塗布します。パステアパイプパッドを用いて、チューブの約3分の2までLRホワイトレジンを慎重に充填します。樹脂がリム上の促進剤に接触しないように注意してください。ディッシュ内のセルに浸入した樹脂を取り除き、ディッシュを逆さまにして直立させたマイクロ遠心チューブの上に置きます。この際、チューブの幅がディッシュウェイトのガラス製観察窓をほぼ完全に覆うように配置します。促進剤がチューブとカバーガラスを密閉するまで1〜2分間待ちます。次に、チューブを反転させ、チューブ内のレジンが細胞を覆うようにします。チューブを入れたディッシュを60 °Cのオーブンに入れ、12時間硬化させます。ブロックが硬化したら、レジンが充填されたマイクロ遠心チューブが装着されたディッシュをオーブンから取り出し、マイクロ遠心チューブをディッシュから切り離します。ガラスボトムディッシュを廃棄し、マイクロ遠心チューブをカミソリで慎重に切り開いてブロックを取り出します。カミソリを用いて、ダイヤモンドペンまたはタングステンペンで事前に印を付けた1 mm²の領域のみが残るようにブロックをトリミングします。次に、ブロックを超ミクロトームにセットし、トリミングナイフで細胞が現れるまでトリミングします。次に、ダイヤモンドナイフに切り替え、細胞を厚さ約 50 nanometers の超薄切片として切断します。これらの切片を透過率の高い 300 mesh グリッドで回収します。その後、グリッドをカーボンコーターに入れ、透過電子顕微鏡の電子ビーム下での安定性を高めるため、切片に約 0.2 から 0.4 nanometers のカーボンをコーティングします。エネルギーフィルターを備えた透過電子顕微鏡にグリッドをロードします。低倍率の通常透過モードを用いて切片上の細胞を観察し、事前に撮影した蛍光画像と比較します。DNA損傷トラックまたはDNA修復フォーカスを持つ核が見つかったら、エネルギーフィルタリングモードに切り替え、厚さマップとともにサンプルを記録します。次に、スリット幅 20 electron volts で、エネルギー損失 175 electron volts におけるリンのポストエッジ画像を記録します。また、窒素マップの記録用に、同様にスリット幅 20 electron volts で、エネルギー損失 120 electron volts におけるプリエッジ画像も記録します。さらに、スリット幅 35 electron volts で、447 electron volts のポストエッジ画像および 358 electron volts のプリエッジ画像を記録します。また、スリット幅を35 electron voltsに設定します。このように、画像処理ソフトで元素比マップを開きます。RGB画像の赤色チャンネルに窒素マップを、緑色チャンネルにリンマップをコピーしてください。次に、マップを重ね合わせ、アライメントを行います。合成画像をTIFF形式でエクスポートし、レイヤー機能が使用可能な画像処理ソフトウェアで開きます。続いて、画像内の最小値と最大値を8ビットデータセットにリスケーリングすることで、各チャネルのダイナミックレンジを調整します。次に、レイヤーウィンドウ内で窒素マップからリン含有量を差し引きます。画像をインデックスカラーに変換し、核酸分布を示すマップにはCMYK色空間で黄色のルックアップテーブルを、非クロマチンタンパク質マップにはシアンのルックアップテーブルを作成します。その後、新しい画像を作成し、リンと非クロマチンタンパク質の分布を示すマップをそれぞれ別のレイヤーとしてインポートします。画面の透過モードを使用して、2つのレイヤーを互いに重ねて表示します。ここでは、RGB色空間で2つの比率マップを重ね合わせた際の、細胞核内部におけるリンと窒素の位置を示す電子分光比率マップが表示されています。このような画像は、本の手順によって得られます。黄色の構造は、リンと窒素の両方が存在することを示す核タンパク質を表しています。ここでは、電子分光イメージングを用いて、U2 OS細胞におけるガンマ線照射後のフォーカス構造の変化を観察しています。最上段は、M cherryタグ付き修復タンパク質を安定的に発現させ、照射していない細胞の画像です。2行目は、放射線照射から3時間後に固定した細胞を示しています。3行目は、放射線照射から6時間後に固定した細胞を示しています。電子分光イメージングにより、フォーカスの構造が時間とともに再編成されることが明らかになりました。窒素シグナルで示される53 BP1タンパク質の相対量が増加する一方で、リンシグナルで示されるクロマチンがより周辺部に位置するようになります。このビデオを視聴することで、電子分光イメージングを用いてDNA修復フォーカスにおけるクロマチンの超微細構造を解析するための、DNA修復タンパク質を発現させた照射細胞の調製方法について十分に理解できるはずです。サクシン酸グルタールアルデヒド緩衝液、シアン化カリウム、および四酸化オスミウムの使用は極めて危険であるため、本手順の実施中は、常にドラフトチャンバー内での作業や手袋の着用などの予防措置を講じることを忘れないでください。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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