Name: ヒトアデノウイルス5型に基づく高容量アデノウイルスベクターのクローニングおよび大規模生産 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: 学ぶヒトアデノウイルス5型に基づく高容量アデノウイルスベクターのクローニングおよび大規模生産法。ホミングエンドヌクレアーゼを用いたトランスジェーン挿入とヘルパーウイルスによる増幅により、最大35kbの外来DNAを導入可能な遺伝子治療用ベクターを作製します。

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この作業は、DFG助成金EH 192/5-1 (A.E.)、EU(E-rare-2)プロジェクトTransposmart(A.E.)、UWH Forschungsförderung (E.S. and W.Z.)、およびUniversity Witten/Herdecke(P.B.)の博士課程プログラムによって支援されました。J.L.はChinese Scholarship councilの奨学金によって、T.B.とM.G.はElse Kröner-Fresenius foundation（EKFS）によって支援されました。

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著者は、彼らが競合する金融利害関係を有していないことを宣言します。

ここで紹介するプロトコルは、以前に記載された手順4,12に基づいて、ヒトアデノウイルス5型に基づくHCAdVベクターの精製を可能にします。 pAdFTCプラスミド内HCAdVゲノムは、すべてのアデノウイルス遺伝子を欠いているだけ5&#39;-および3&#39;-のITRおよびパッケージングシグナルを運びます。この戦略では、HV AdNG163R-2 4は、 トランスで 、効率的なウイルス産生に必要なすべての遺伝子を提供します。またはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベースのベクター - これは明らかに第一および第二世代のADVSまたは広く使用されているレンチウイルス（LV）をoutcompetes最大35キロバイトの包装容量を提供しています。特にin vivoでのアプリケーションのためのHCAdVの第2の利点は、第一世代や第二世代のADVSとは対照的に、彼らは、細胞毒性のレベルが低下し、ウイルスタンパク質5-8の発現によって引き起こされる免疫原性の副作用が表示されているという事実です。 ...

遺伝子治療用途のためには、ウイルスタンパク質の発現、トランス遺伝子単独で、または着信ウイルスタンパク質により引き起こされる細胞傷害性および免疫原性の副作用を回避するために非常に重要です。アデノウイルスベクター（ADVが）が広く導入遺伝子発現1,2の影響を調査するために多種多様な細胞に外来DNAを導入するために使用されます。 AdVの最も先進的なバージョンは、3,4、すべてのウイルスコード配列を欠くし、それによって、低免疫原性および低毒性5-8と合わせ35キロバイトまでのパッケージング能力を提供する高容量アデノウイルスベクター（HCAdV）で表されます。その高い包装能力に彼らは、単一のベクター用量を使用して、大規模または複数の導入遺伝子の送達を可能に。したがって、彼らは、研究コミュニティのための貴重なツールを表します。 初段または容易に市販のキットを用いて製造することができる初期遺伝子E1及び/又はE3を欠いている第二世代のAdVとは対照的に、VECTOR HCAdVのゲノム構造とウイルス生産はより複雑です。 HCAdVゲノムを構成するためのシステムは、全てのウイルスコード配列を欠いHCAdVゲノムを有するプラスミドのpAdFTCとシャトルプラスミドpHM5 9-12に基づいています。最大14キロベース（KB）の任意の目的の遺伝子がマルチクローニングサイトは、ホーミングエンドヌクレアーゼ部位を切断/認識によって隣接されたシャトルベクターpHM5にクローニングすることができるSCE IおよびI-CEU IをPI-そのため、目的のクローニングされた遺伝子は、連続したPI-SCE IとI-CEU私によって解除することができ、プラスミドpAdFTCに含まHCAdVのゲノム中に存在する同じ制限部位に後続導か挿入するためのダイジェスト。 pAdFTCではPI-SCE IとI-CEU私切断部位の間に位置する導入遺伝子の挿入部位は、スタッファーDNAと、そのような5 &#39;および3&#39;逆方向末端反復配列（ITR）としてゲノムパッケージングに必要な非コードアデノウイルス配列が隣接しています終了し5&#39;ITRの下流のパッケージングシグナルの両方で。追加のスタッファーDNAは、ウイルス産生の間に効率的なパッケージングを確保するために、27〜36キロバイトの範囲の最終HCAdVゲノムの最適なサイズを提供します。 pAdFTCには、最大45キロバイト（挿入された導入遺伝子のサイズに依存）を持つ大規模なプラスミドであり、比較的長いDNA認識部位とのホーミングエンドヌクレアーゼの使用が強い結合するDNAを示し、いくつかのクリーンアップ手順は、pHM5から導入遺伝子の転写時に必要ですので、 pAdFTCへ。剪断力を避ける慎重な取り扱いが推奨されます。 HCAdVのゲノムのITRは5&#39;ITRの上流に直接的に配置され、3&#39;ITR 12の下流にNot I制限酵素認識部位に隣接されます。したがって、HCAdV わけではありません、私はHCAdVのプロデューサー細胞株へのウイルスゲノムのその後のトランスフェクションのためにダイジェストによって解除することができます。なお、制限酵素の使用はありません私のrelのためのプラスミドpAdFTCからウイルスゲノムの容易さは、挿入された導入遺伝子ではなく、私のDNA認識部位を欠いていることを意味します。 HEK293細胞ベースのプロデューサー細胞（116細胞）を安定的にCreリコンビナーゼを発現します。ウイルス増幅のために116細胞は 、トランス3,4 で複製およびパッケージングに必要なすべてのADV遺伝子を提供するヘルパーウイルス（HV）と同時感染しています。 HVが116 セル 4内で発現Creリコンビナーゼによるウイルス増幅中に除去されるflox化パッキング信号と第一世代のAdVです。これは、完全なパッケージングシグナルを含む主にHCAdVゲノムがキャプシド化されることが保証されます。 HCAdVの前増幅は、組織培養皿内の表面上に成長させた116細胞における連続継代工程を行うことによって行われます。それぞれの継代後、ウイル​​ス粒子は、3つの連続した​​凍結融解工程を行うことにより、感染細胞から放出されます。細胞の数を増加させるあらゆる通路はに感染していると前の通路からの細胞溶解物の1/3。最後に、前増幅ステップが、大規模な増幅のためのスピナーフラスコ中の懸濁液中で増殖させたプロデューサー細胞を感染させるために使用されてから最終的に溶解物。ビリオンは、塩化セシウム密度勾配超遠心分離に4,12を行うことにより、懸濁細胞から精製されます。この手順で空の粒子と完全に組み立てられた粒子は、2つの別個の帯域に分割されています。さらにHCAdVを濃縮し、第2の非段階的な超遠心分離工程が実施される粒子。その後HCAdVを含む得られたバンドを回収し、生理的な緩衝液に対して透析します。最終ベクター調製物は、絶対的なウイルス粒子の感染性粒子およびHVの汚染レベルの数に関して特徴付けられます。絶対的なウイルス粒子は、ウイルス粒子を溶解し、260nmの吸光度を測定することにより、または定量的リアルタイムPCR（定量PCR）12を実行することによって決定することができます。 PURの感染ifiedウイルス粒子は、感染した細胞3時間後、感染中に存在HCAdVゲノムを測定するqPCRにより決定することができます。

<table><tbody><tr><td>I-CeuI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0699S</td><td>restriction digest</td></tr><tr><td>PI-SceI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0696S</td><td>restriction digest</td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>New Engand Biolabs</td><td>M0202S</td><td>ligation</td></tr><tr><td>SwaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0604S</td><td>restriction digest</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td><td>restriction digest</td></tr><tr><td>子牛腸アルカリホスファターゼ(CIP)</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0290S</td><td>消化プラスミドの脱リン酸化</td></tr><tr><td>ハイグロマイシンB</td><td>PAN</td><td>バイオテクノロジーP02-015116</td><td>細胞を発現するCREの選択</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN</td><td>バイオテクノロジーP04-03590&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>Hek293T細胞培養培地</td></tr><tr><td>Minimal Essential Medium (MEM) Eagle</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-08500</td><td>116細胞培養培地&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>ダルベッコ細胞のリン酸塩緩衝液(DPBS)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td>細胞<td>の洗浄、細胞の再懸濁</td></tr>液<tr><td>250ml貯蔵ボトル</td><td>シグマ</td><td>CLS430281-24EA</td><td>懸濁液で成長した116細胞の感染</td></tr><tr><td>500mlPP遠心分離管シ</td><td>グマCLS431123-36EA</td><td></td><td>懸濁液培養スピ</td></tr><tr><td>ナーフラスコ</td><td>Bellco</td><td>1965-61030116</td><td>細胞の成長サスペンション</td></tr><tr><td>ウルトラクリア 超遠心チューブ</td><td>ベックマン・コールター</td><td>344059</td><td>密度勾配遠心分離機</td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>密度勾配遠心分離機</td></tr><tr><td>SW-41ローター</td><td>ベックマン・コールター</td><td></td><td>密度勾配遠心分離機</td></tr><tr><td>スペクトラムラボラトリーズ スペクトラムラボラトリーズ スペクタプレン メンブレン</td><td>VWR</td><td>132129</td><td>透析チューブ</td></tr><tr><td>すぐに使える透析カセット&nbsp;</td><td>Thermo</td><td>66383</td><td>透析</td></tr><tr><td>1 ショット DH10B エレクトロコンピテント E. coli</td><td>invitrogen</td><td>C4040-52</td><td>ライゲーション反応の形質転換</td></tr><tr><td>PureYield プラスミド Midiprep System</td><td>Promega</td><td>A2495</td><td>midiprep</td></tr><tr><td>peqGOLD Tissue DNA Mini Kit&nbsp;</td><td>Peqlab</td><td>12-3396-02</td><td>Isolation of genomic DNA</td></tr><tr><td>SuperFect Transfection Reagent</td><td>Qiagen</td><td>301305</td><td>transfection of 116 cells</td></tr><tr><td>opti MEM (10% FBS)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>transfection of 116 cells</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>&nbsp;170-8882</td><td>q-PCR</td></tr><tr><td>CFX 96 C1000 タッチ&nbsp;</td><td>バイオラッド</td><td></td><td>qPCR 装置</td></tr><tr><td>フェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール&nbsp;</td><td>カールロス</td><td>A156.1DNA</td><td>の精製</td></tr>塩化<tr><td>セシウム</td><td>カールロス</td><td>8627.1</td><td>密度勾配遠心分離</td></tr>酢<tr><td>酸ナトリウム99%</td><td>カールロス</td><td>6773.2DNA</td><td>沈殿</td></tr><tr><td>LB培地&nbsp;</td><td>カール・ロス</td><td>X968.3</td><td>細菌増殖培地</td></tr><tr><td>エタノール&nbsp; 純度99.8%</td>カール<td>・ロス</td><td>9065.5&nbsp;</td><td>DNAの沈殿と洗浄</td></tr><tr><td>SDS 99.5%</td><td>カール・ロス</td><td>2326.2</td><td>溶解&nbsp; バッファー</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>カール・ロス</td><td>8043.2</td><td>溶解&nbsp; バッファー</td></tr><tr><td>Tris-HCl 99%</td><td>カール・ロス</td><td>9090.3</td><td>透析バッファー/溶解&nbsp; バッファー</td></tr><tr><td>グリセロール 99.5%</td><td>カール・ロス</td><td>3783.1</td><td>透析バッファー</td></tr><tr><td>MgCl2 98.5%</td><td>カール・ロス</td><td>KK36.2</td><td>透析バッファー</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>カール・ロス</td><td>3957.1</td><td>オプションの透析バッファー</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>カール・ロス</td><td>3904.2</td><td>オプションの透析バッファー</td></tr><tr><td>スクロース</td><td>カール・ロス</td><td>9286.1</td><td>オプションの透析バッファー</td></tr><tr><td>Na2HPO4x2H2O</td><td>カール・ロス</td><td>4984.2</td><td>オプションの透析バッファー</td></tr><tr><td>1.5 ml チューブ</td><td>SARSTEDT</td><td>72,730,005</td><td>-80 °C でのウイルス調製物の保存;ハ</td></tr></tbody></table>

ヒトアデノウイルス5型に基づく高容量アデノウイルスベクターのクローニングおよび大規模生産

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

すべてのウイルスコード配列を欠いた大容量アデノウイルスベクター(HCAdV)は、その高いパッケージング容量(最大35 kb)、低免疫原性、および低毒性により、最も先進的な遺伝子導入ベクターの1つです。しかし、多くの研究室では、ベクターゲノムの構築とウイルス産生の複雑な手順により、HCAdVの使用が妨げられています。ここでは、HCAdVゲノムを含むプラスミドpAdFTCに基づくHCAdVの効率的なクローニングおよび産生のための詳細なプロトコールについて説明します。HCAdVゲノムの構築は、ホーミングエンドヌクレアーゼ(I-CeuIおよびPI-SceI)を利用したクローニングベクターシステムに基づいています。最大14 kbの目的の遺伝子を、I-CeuIとPI-SceIが隣接する複数のクローニング部位を含むシャトルベクターpHM5にサブクローニングできます。I-CeuIおよびPI-SceIを介したシャトルベクターからの導入遺伝子の放出後、導入遺伝子をHCAdVクローニングベクターpAdFTCに挿入することができます。pAdFTCプラスミドのサイズが大きく、使用済み酵素の認識部位が長いため、DNAの強力な結合に関連するため、クローニングフラグメントの慎重な取り扱いが必要です。ウイルス産生では、NotI消化物によってHCAdVゲノムが放出され、安定的に発現するCreリコンビナーゼを発現するHEK293ベースの産生細胞株にトランスフェクションされます。アデノウイルス増幅のためのすべてのアデノウイルス遺伝子を提供するには、loxP部位に隣接するパッキングシグナルを含むヘルパーウイルスとの同時感染が必要です。ベクターのプレアンプ化は、表面上に増殖した生産者細胞で行い、ベクターの大規模増幅は、懸濁液中で増殖させた生産者細胞を用いてスピナーフラスコで行います。ウイルス精製では、塩化セシウム勾配に基づく2つの超遠心分離ステップとそれに続く透析が行われます。ここでは、このHCAdVベクターシステムを使用して過去数年間に開発されたヒント、コツ、ショートカットを紹介します。

ここでHCAdV製剤のクローニング、増幅および精製のための代表的な例が示されています。酵素制限消化によってクローニング戦略（ 図1）とHCAdVゲノムのクローニングおよび放出のための代表的な例の概要は（ 図2）が設けられています。ダイジェスト私PI-SCE IとI-CEUによってpHM5からGOI-発現カセットおよびそれに続くフェノール-クロロホルム抽出およびエタノール沈殿のリリース後の典型的な制限パターン（ 図2A）に示されている（参照も1.2〜1.5ステップ）。典型的にpHM5プラスミドバックボーンとGOIの発現カセットに対応する第2のバンドに対応する約3 kbのバンドを観察することができます。 GOI発現カセットを含むバンドは、次いで、アガロースゲルから精製されます。精製されたGOI発現カセットを一緒に精製され、脱リン酸化pAdVFTCでアガロースゲル上で分析され、Wこと正確なサイズを確認するために、その後のライゲーション（ <s...

すべてのウイルスコード配列を欠く大容量のアデノウイルスベクターを生成するためのプロトコルが提示されます。ベクターゲノムに含まれる導入遺伝子のクローニングは、ホーミングエンドヌクレアーゼに基づいています。接着細胞として増殖した産生細胞および懸濁細胞におけるウイルス増幅は、トランスでウイルス遺伝子を提供するヘルパーウイルスに依存しています。

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

本手順の全体的な目的は、生細胞または生体内で治療用トランスジェンを導入および発現させるための、遺伝子欠損型の高容量アデノウイルスベクターを作製することです。この手法は、他のウイルスベクターには収まらない大きなトランスジェンを導入することを可能にし、遺伝子治療分野に貢献します。この技術の主な利点は、高容量アデノウイルスにウイルス遺伝子が含まれていないことです。これらのベクターを用いることで、最大35 kbの外来DNAを導入することが可能です。この技術の応用範囲は遺伝性疾患の治療にまで及び、遺伝子矯正や遺伝子追加のための治療用ベクターの導入に寄与します。本手法は、治療用トランスジェンのバイオデリバリーのための高度なツールを提供し、細胞培養および生体内の両方に適用できます。ベクターの増幅および精製には経験が必要であるため、本手法を視覚的に提示することは非常に重要です。ベクターの精製時には、適切な手技が求められます。10倍に希釈した線状化した高キャパシティアデノウイルスゲノム発現プラスミドのアリコートを、ゲル電気泳動で確認してください。pAd-FTCプラスミドバックボーン用の9 kbの断片と、高キャパシティアデノウイルスゲノムおよび目的遺伝子を含む28〜36 kbの2番目のDNA断片が検出されるはずです。次に、標準的な手順に従い、コンフルエンシーが50〜80%のHEK293細胞（60 mmディッシュ）に、線状化した高キャパシティアデノウイルスゲノムを5 µgトランスフェクションします。トランスフェクションから16〜18時間後、培地を注意深く取り除き、3 mLの新鮮な培地を加えます。次に、細胞にヘルパーウイルスAdNG 163R2を、1細胞あたり5トランスデューシングユニット（transducing units）となるように感染させます。37 °C、5 % CO2の組織培養インキュベーター内でインキュベートします。なお、インキュベーションの最初の1時間は、ヘルパーウイルスをすべての細胞に均等に分散させるため、20分ごとにプレートを揺らしてください。感染から48時間後、培地を用いて培養ディッシュから細胞を洗い出し、回収します。ゲノムDNA抽出用に、継代0代の細胞を0.5 mL分取して保存します。その後、継代0代の細胞を2.5 mL分取し、液体窒素に浸漬することで凍結融解を繰り返します。または、細胞を-80°Cのフリーザーに置き、その後37°Cのウォーターバスに移動させる操作を3〜4回繰り返します。2.5 mLの溶解物（ライセート）を1 mLの新鮮な培地と混合し、細胞あたり2 transforming unitsのヘルパーウイルスを添加します。コンフルエンシーが90〜95%に達した60 mmディッシュ内の116細胞から培地を吸引し、ウイルス混合液を細胞に添加します。これまでと同様に、細胞を48時間インキュベートします。その後、細胞を回収し、凍結融解および感染の手順を2回繰り返し、継代1回目および継代2回目のライセートを得ます。継代2回目のライセートが得られた後、2.5 millilitersのライセートを17.5 millilitersの新鮮な培地と混合し、細胞あたり2つの変換単位のヘルパーウイルスを添加します。コンフルエンスが80〜100%に達した150 mmディッシュ内の116細胞から培地を吸引し、ウイルス混合液を感染させます。感染から48時間後、先ほど示した手順を用いてパッセージ3のライセートを回収します。このステップを開始するために、あらかじめ温めておいた培地900 mLを3 Lスピナー培養フラスコに加えます。コンフルエンシーが90〜100%に達した1-1-6細胞を播種した150 mmディッシュを少なくとも10枚用意し、培地を除去します。その後、10 mLの新鮮で予熱済みの培地で細胞を洗い流します。ピペットで数回吸い上げと吐出を繰り返し、均一な細胞懸濁液を作成します。その後、細胞をスピナーフラスコに直接移します。スピナーフラスコを、組織培養インキュベーター内のマグネチックスターラー上で、37°C、5%CO2の条件下で24時間インキュベートします。細胞がガラス表面に付着するのを防ぐため、マグネチックスターラーを70 RPMに調整します。スピナーフラスコでの培養開始から24時間後、新鮮な培地を500 milliliters添加します。さらに24時間後、この操作を再度繰り返します。培養開始から72時間後、フラスコに新鮮な培地を1 liter添加し、細胞懸濁液の総量を3 litersにします。24時間後、室温で500 ×gにて10分間遠心分離し、1 × 10⁶の懸濁細胞を回収します。上清を捨て、ピペッティングを8〜10回ほど行い、ペレットを150 mLの培地で再懸濁します。細胞を、滅菌済みのマグネチックスターラーバーを入れた250 mLの保存ボトルに移します。次に、第3代ライセートと、細胞1個あたり2トランスフォーミングユニットのヘルパーウイルスを細胞に共感染させます。ここでは、総細胞数が約9×10⁸個であるため、1.8×10⁹トランスフォーミングユニットを添加します。細胞とウイルスの混合液を、組織培養インキュベーター内で、マグネチックスターラーを用いて60 RPMで2時間撹拌します。空気循環を可能にするため、保存ボトルを完全に密閉しないようにしてください。感染から2時間後、細胞とウイルスの混合液の全量を3リットルのスピナー培養フラスコに戻します。1850 millilitersの予熱した新鮮な培地を加え、組織培養インキュベーター内で70 RPMで48時間インキュベートします。48時間後、細胞ウイルス懸濁液を500 mL遠心チューブに移します。次に、室温で890 ×gで10分間遠心分離します。培地を除去し、ペレット化した細胞を合計28 mLのDPBSで再懸濁します。ウイルス精製まで、細胞ウイルス懸濁液を-80°Cで保存します。塩化セシウム密度勾配遠心法による精製に向けてウイルスライセートを調製するため、細胞ウイルス懸濁液を4回凍結融解させます。その後、ウイルスライセートを室温にて500 ×gで8分間遠心分離します。次に、高タイターアデノウイルスを含む上清を回収します。塩化セシウム溶液を、1.5 g/cm³溶液を0.5 mL、1.35 g/cm³溶液を3 mL、1.25 g/cm³溶液を3.5 mLの順に、チューブへ注意深くゆっくりとピペッティングして加えます。1.25 g/cm³の層の上に、精製したベクター上清を約4.5 mL重ねます。高容量のアデノウイルスゲノムを含むウイルス粒子を、空粒子および細胞破片から分離するため、スイングアウトローターを備えた超遠心機を用い、12 °Cで226,000 ×gにて少なくとも2時間、密度勾配遠心を行う。遠心後、チューブの上部に細胞破片の拡散したバンドが形成される。その下に、2本の白いバンドが観察される。上層のバンドには空粒子が含まれており、下層のバンドが高容量のアデノウイルスです。細胞デブリと空粒子の層を慎重に取り除きます。その後、各チューブの下層バンドから1 mLずつ回収します。ウイルスを滅菌済みの50 milliliterチューブに移します。回収したウイルス粒子に1.35 grams per cubic centimeterの塩化セシウム溶液を最大24 millilitersまで加え、慎重に混合します。遠心管に1.35 grams per cubic centimeterの塩化セシウムウイルス溶液を満たします。次に、スイングアウトローターを備えた超遠心機を用い、緩やかな加速および減速設定で、12 °C、226,000 ×g で一晩遠心分離します。ピペットを使用して上層を除去します。その後、新しいピペットチップを用いて、下部の顕著なバンドに存在する高力価アデノウイルスを回収します。最後に、バッファー交換のために回収したウイルス粒子を透析します。その後、書面によるプロトコルの詳細な指示に従って、最終調製物のタイターを測定します。このヒストグラムは、単一のベクター調製物について、光学密度で測定したODタイター、感染タイター、およびqPCRで測定したヘルパーウイルス汚染という3つの異なる方法で決定した粒子の絶対数を示しています。qPCRで測定した、総感染性高容量アデノウイルス粒子とヘルパーウイルスの混入レベルの比をここに示します。ベクターに蛍光マーカー遺伝子が含まれている場合は、蛍光顕微鏡観察を行うことで、ベクターの増幅前段階をモニタリングし、最終的なベクター調製物の感染性を評価することができます。このビデオを視聴することで、遺伝子欠損高容量アデノウイルスの作製方法について十分に理解できるはずです。特に、外来遺伝子の挿入方法、およびベクターの増幅と精製方法について。

cloning-large-scale-production-high-capacity-adenoviral-vectors-based

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

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ヒトアデノウイルス5型に基づく高容量アデノウイルスベクターのクローニングおよび大規模生産

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