生物学的液体培地中でスケーラブルな、メタリック高アスペクト比のナノコンポジットの生成

本手順の目的は、銅含有原料とシステインを用いて、線状でアスペクト比の高いマイクロおよびナノ複合体を生成することである。まず、超音波処理した銅ナノ粒子または硫酸銅を、システインおよび水とともに滅菌済みの通気性培養フラスコ内で混合する。次に、混合した成分が入ったフラスコを、37°Cの5%CO2インキュベーター内に少なくとも6時間静置することで合成を行う。

次に、フラスコを目視および白色光顕微鏡で観察します。線形構造の形成度を決定するための最終ステップは、合成フラスコを4 °Cに維持された冷蔵庫に入れることで合成を停止させることです。最終的に、デジタル顕微鏡を用いて合成された構造を特性評価します。電極堆積などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、液体状態での合成を容易にスケールアップでき、かつ生理的条件下でプロセスが進行することにあります。

合成された構造体は細胞によって分解される可能性があるため、この手法の意義は、薬剤を届ける手段を提供することで、がんなどの疾患の治療や診断にまで広がります。私がこの手法を思いついたのは、さまざまなナノ材料の潜在的な毒性を調査する実験を行っていた時でした。最終的な合成ステップの習得は困難な場合があるため、この手法を視覚的に提示することが不可欠です。

手順が不適切であると、構造が集積したり、あるいは構造が全く形成されなかったりすることがあります。銅ナノ粒子またはCMPを用いて自己組織化合成を行うには、2 mg以上のCMPを計量して銅ナノ粒子溶液を調製します。このステップでは、CMPが皮膚に接触するのを防ぐため、使い捨て手袋を着用してください。

ナノ粒子を空の滅菌済み16 mLガラスバイアルに入れ、CMP含有バイアルに移します。2 mg/mLの溶液にするために適切な量の滅菌脱イオン水を加え、合成を開始する前にナノ粒子を分散させるため、溶液を20秒間ボルテックスします。水でバイアルの半分以上を満たさないでください。そうすると阻害されます。

ボルテックスミキサーで混合すると、CMPはすぐにバイアルの底に沈降し、色が暗くなります。合成を開始する前に、CMPを最大限に分散させるため、CNP溶液を室温で17分間超音波処理してください。超音波処理によってCMPが適切に混合されているか定期的に確認してください。超音波処理が適切に行われると、CMPは少なくとも30分間溶液中に懸濁し、溶液の色は暗いままになります。

合成のために7.29 milligramsのシステインを量り取ります。システインは水に直接溶解しないため、量り取ったシステインを帯電防止秤量容器からシステインを含む秤量容器へと移します。システインが完全に溶解し、72.9 milligram per milliliterの溶液になるまで、十分な量の滅菌済み1 molar 水酸化ナトリウムを加えます。

システインを1 Mの水酸化ナトリウム100 µLに完全に溶解させます。次に、溶解させたシステイン7 µLと滅菌水6,643 µLを滅菌合成フラスコ内で混合します。効果的に混合させるため、フラスコのキャップをベントさせた状態で、混合溶液を入れたフラスコをインキュベーターに入れ、37 °Cで30分間静置します。

これがシステイン作業溶液になります。合計合成量7 mLの場合、超音波処理ステップ後にCMPが沈殿しているため、2 mg/mLのCNP溶液を30秒間ボルテックスして再懸濁させます。システイン作業溶液を25 cm²の細胞培養フラスコに移し、再懸濁させたCMP 350 µLを加えます。

フラスコにキャップを取り付け、しっかりと締め付けます。合成に必要なすべての成分を混合した後、フラスコを4〜5回緩やかに回して混ぜ合わせます。フラスコを二酸化炭素インキュベーターに入れ、キャップを少し緩めて通気させることで、フラスコ内外でガス交換が行われるようにします。

合成の間、インキュベーター内で約24時間合成を進行させます。合成中に、顕微鏡および目視によって、高度に線状の複合体が形成される様子を確認できます。このステップは、構造体が形成されていること、および自己組織化プロセスが長時間続きすぎないことを確実にするために不可欠です。

フラスコ内に線状構造が観察された時点でバイオ複合体の合成を終了させます。合成用フラスコをしっかりと密閉し、合成に使用した日付、インキュベーション条件、および終了までの合成時間を合成条件としてフラスコに記載してください。生成された構造がこの形態で少なくとも1年間安定して保持されるため、その後、容器を冷蔵庫で保管してください。あるいは、硫酸銅を用いて自己組織化合成を行う場合は、無菌操作を用いてCMPを硫酸銅塩に置き換えます。2 mg以上の硫酸銅を十分な量の滅菌脱イオン水に溶解させ、2 mg/mL溶液を調製してください。

この濃度では硫酸銅結晶は容易に溶解しますが、必要に応じてバイアルをボルテックスし、硫酸銅の調製後にすべての結晶が溶解していることを目視で確認してください。デモンストレーション通りに合成を行いますが、CMPを硫酸銅に置き換えてください。CMP由来および硫酸銅由来のバイオ複合材料を、白色光顕微鏡および電子顕微鏡を用いて特性評価し、バイオ複合材料のキャラクタリゼーションと検査を行ってください。

白色光顕微鏡によるパラシンセシスの観察には、倒立顕微鏡を使用します。フラスコを水平に置くと、数分以内に複合体がフラスコの底面に沈降し、そこでピントを合わせることができます。バイオ複合体と液体培地のコントラストを最大にするため、顕微鏡は明視野設定で使用してください。CMPおよび硫酸銅由来の複合体はどちらも透明から不透明な色に見えますが、未反応のCNP凝集体は非常に濃い色に見えます。

倒立白光顕微鏡を用いて、特定の実験における合成効率を評価します。例えば、合成過程における未反応のCMPの有無を確認し、記録します。また、インキュベーション時間や超音波処理時間などの異なるパラメータで作成した、CNP由来バイオ複合材を含むフラスコを観察します。

個々のCMPは小さすぎるため光学顕微鏡で観察することはできませんが、未反応のCNP凝集体は円形で暗い物体として現れます。これは、合成に成功したCNP複合体が、高いアスペクト比を持ち、線状で、さまざまな長さであることを示す対照的な結果となります。反応の停止まで合成時間を長くしすぎないようにしてください。合成時間が長すぎると、高度に分岐したウニ状構造が形成され、一度形成されると個々の構造に分散させることが困難になります。

また、硫酸銅を用いた特定の実験において、合成の効率を評価するために倒立白光顕微鏡を使用します。本プロトコルを用いれば、硫酸銅は完全に溶解するため、溶液はCMPを用いた合成後の溶液よりも色が薄く見えます。

停止前の合成時間など、異なる合成条件で作成したフラスコを比較することにより、硫酸銅複合体のサイズと範囲を記録します。まずバイオ複合体を濃縮するため、CNP由来の構造体または硫酸銅由来の構造体のいずれかを6 mL、15 mL遠心チューブに加えます。室温、500 ×gで10分間遠心分離し、少量のサンプルからペレットを形成させます。

溶液中の構造体500 µLを0.6 mLチューブに加え、2000 ×g、室温で10分間以上遠心分離してペレットを形成させます。構造体を滅菌脱イオン水に入れ、10分間以上超音波処理して再懸濁させます。この工程を繰り返すことで、構造体は断片化され、平均長が短くなります。

倒立白色光顕微鏡とデジタルカメラを用いて、超音波処理時間の違いによる複合材料のサイズの変化を記録しました。細胞培養液中におけるバイオ複合材料の発見に関する代表的な結果として、当初はCMPが均一に分散していましたが、82時間かけて微細構造へと凝集することが示されました。時間の経過とともに粒子は消失し、より大きな凝集体が形成されます。最終的に、線状構造を持つ大きな凝集体が現れ、ウニ状の構造を形成します。

CMPから線形バイオ複合材料への変換を示す。CMPを初期状態で均一に分散させた後、システインおよび水と混合した。3時間後に凝集体が微細構造を形成し、6時間までに中間構造が形成される。

高アスペクト比の構造が電子顕微鏡下で形成されます。合成されたバイオ複合材料の特性評価を透過電子顕微鏡で観察すると、CNP出発材料が線状の複合材料を形成していることがわかります。一方で、CMP出発材料は走査電子顕微鏡（SEM）で示されるように球状です。CMPとシステインから形成された複合材料のナノおよびマイクロスケールの特徴がSEMにより示されています。

硫酸銅とシステインから形成された複合体の特徴も、SEMエネルギー分散型X線分光法による元素分析で示されています。出発物質および合成された線状成分の元素分析結果を示します。出発CMPsでは、硫黄は検出されず、顕著な銅のピークが認められます。

CMPおよびシステインから作製したバイオ複合体では、出発物質である硫酸銅およびシステインに由来する硫黄と炭素のピークが出現します。この材料は銅と硫黄のピークを示します。硫酸銅とシステインから作製したバイオ複合体では、システインに由来する炭素のピークが出現します。この手法を習得し、適切に実施すれば、12〜24時間で完了させることができます。

この手順を行う際は、合成された構造体が過度に凝集しないよう、目視と顕微鏡の両方で合成の進行状況を監視することが重要です。本手順に続き、合成構造体が細胞に結合するかどうかなど、さらなる疑問を解消するために、構造体の蛍光標識などの他の手法を実施することができます。このビデオを視聴することで、合成用試薬の調製方法、適切な混合方法、合成進行の監視方法、および合成後の構造体の濃縮と修飾方法について十分に理解できるはずです。