Name: 誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: 学ぶ誘導発現系を用いた細菌病原性因子と細胞内シグナル伝達の干渉解析法。アポトーシス経路におけるタンパク質活性の特定と宿主防御回避メカニズムの解明に応用可能です。

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この作業は、Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) の支援を受け、Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) から A.L. と C.B. へ、また ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L. を通じて支援されました。

目的のタンパク質を発現する安定な細胞株の1世代<ol><li>熱不活性化FCSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを添加することによって、メディアの準備は、市販のダルベッコのグルタマックスI、ピルビン酸、および4.5グラム/ LのD-グルコースを補充したイーグル培地（DMEM）を改変します。 </li><li> 5％CO 2中、37℃で培地中でHEK293細胞を育成。二日おきに細​​胞をサブ養います。メディアを取り出し、そして15mlの新鮮な培地で細胞を懸濁します。新しい75cm 2の細胞培養フラスコにピペット1ミリリットルと14ミリリットルのメディアを追加します。 </li><li>血球計数器を用いて細胞数を分析します。 </li><li>ウェルあたり2×10 5細胞の密度で6ウェルプレート中のHEK293細胞をシードし、24時間インキュベートします。 </li><li>トランスフェクションのためにトランスフェクション試薬の製造業者によって提供されるプロトコルを使用しています。トランスフェクション試薬を使用したpEGFP-C2かのpEGFP-C2-CaeBで細胞をトランスフェクトします。使用前に、トランスフェクションREAGを温めますENTとRTに必要なメディア。 DNAにトランスフェクション試薬の1の比率：3を使用してください。 <ol><li>具体的には、ピペットトランスフェクション試薬1.5μlの直接無血清DMEM培地50μlの中へ。複合体形成のために、トランスフェクション試薬を含有する混合物にDNAをコードするGFPまたはGFP-CaeB0.5μgのピペットを、室温で15分間インキュベートします。 </li><li>滴下様式で、反応混合物を添加することにより細胞をトランスフェクトし、24時間、5％CO 2中、37℃でインキュベートします。 </li></ol></li><li> 1 mgの追加/ 5％CO 2中37℃でGFP陽性クローンの選択のためのゲネチシンミリリットル。 </li><li> 1比：6日後、1媒体及びHEK293上清を保有する96ウェルプレートでのソート、フローサイトメトリーにより単一細胞を単離します。 4966×gで15分間遠心分離し、培養し、コンフルエントHEK293細胞からのHEK293上清を生成します。 </li><li>次の日に、1.5を含む培地で培地を交換し0; mg / mlのジェネティシン。週に一度メディアを変更します。細胞がコンフルエントな単層を形成する場合は、24ウェルプレートに移します。 1.5 mg / mlのジェネティシンを含む培地中で5：1の割合で週二回の細胞をサブ養います。最後に、免疫ブロット分析によってGFP陽性細胞の割合を分析し、フローサイトメトリー。 </li></ol>イムノブロット分析により安定な細胞株の2分析<ol><li>上清を除去し、温かいPBSで一度付着した細胞を洗浄します。 2×Laemmliサンプルバッファー、95℃で5分間加熱し、-20℃で保存100μlの細胞を再懸濁します。 </li><li>負荷12％SDS-PAGEゲル上でサンプル当たり約4×10 4細胞。また、分子量マーカーとして市販のタンパク質ラダーの負荷6μL。 1×レムリランニング緩衝液で45〜60分間、180 Vの定電圧下でのゲル電気泳動システムでゲルを実行します。 </li><li> PVDF膜上にブロットタンパク質（0の細孔サイズ。トランスブロットSDセミドライトランスファーセルを用いて60分間、16 Vの定電圧で45ミクロン）。 </li><li>室温で1時間、PBS / 0.05％のTween 20（MPT）中の5％脱脂粉乳の10ミリリットルのブロック膜。 </li><li> MPTの4mlに抗GFP抗体の4μLを希釈し、4℃で膜をO / Nインキュベート。 </li><li> 10mlのPBS / 0.05％Tween 20で3 10分間の洗浄工程を実行します。 </li><li> MPTの4ミリリットル中に西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を0.8μlの膜をインキュベートします。 </li><li> RTで1時間インキュベートした後、PBS / 0.05％Tween20で膜を3回洗浄する（2.6参照）と製造業者のプロトコルに従って市販のキットを用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を検出します。タンパク質バンドを可視化するためにフィルムの開発のための標準的な装置を適用します。 </li></ol> 3.フローサイトメーターを用いて細胞を分析します。 <ol><li> PBSで細胞を再懸濁します。フォワード皮下調整する陰性対照としてHEK293細胞を使用してatter（FSC）および側方散乱（SSC）は、細胞スケールであることになります。細胞ダブレット、凝集体および細胞破片を除くことにより、生細胞にゲートを描きます。 </li><li>未染色細胞がはるかにFL1チャネル（488 nmのアルゴンレーザー）のヒストグラムの左側にあるように、光電子増倍管（PMT）のゲインを調整します。 </li><li> HEK293-GFP及びHEK293-GFP-CaeB細胞の蛍光強度を分析するためにFL1チャネルのヒストグラムを開き、ゲーテッド集団に10,000事象を獲得します。 </li><li>商業FACS分析ソフトウェアを用いてデータを分析します。 </li></ol>誘導性の発現ベクター系で安定細胞株の4トランスフェクション<ol><li>シードHEK293細胞を安定/ウェルの1×10 5細胞の密度で12ウェルプレート中でGFPまたはGFP-CaeBを発現します。 </li><li> 19時間後播種、レギュレータプラスミドと応答プラスミドエンコードのBaxまたは活性化カスパーゼ3のいずれかで細胞を同時トランスフェクト。 <ol><li>安定したHEK293細胞を共トランスフェクトpWHE125-Pレギュレータプラスミド（ 図2）と応答プラスミドpWHE655-hBaxまたはpWHE655-revCasp3（ 図3）とポリエチレンイミンの0.4μlと100 ngの100 ngのと。 </li><li>のOpti-MEM培地の75μlのDNAおよびポリエチレンイミントランスフェクション試薬をそれぞれ調製し、室温で正確に5分間インキュベートします。複合体形成のために、室温で15分間、両方の混合物を一緒にインキュベートします。 </li></ol></li><li>ポリエチレンイミン/ DNA溶液を滴下細胞を追加し、5％CO 2中、37℃でインキュベートします。 </li></ol>アポトーシスの誘導5。 <ol><li>トランスフェクション後5時間では、培養培地への1 / mlのドキシサイクリンを添加することによって、プロアポトーシスタンパク質の発現を誘導します。 5％CO 2中、37℃で18時間、細胞をインキュベートします。 </li></ol>イムノブロット分析によって宿主細胞のアポトーシスの6分析<ol><li>時間の前に細胞を検査細胞死誘導を確認するために、光学顕微鏡下でarvesting。アポトーシス細胞は死にかけのセルを囲むアポトーシス体の存在によって検出可能です。 </li><li>上清を除去し、温かいPBSで一度付着した細胞を洗浄します。 2×Laemmliサンプルバッファー、95℃で5分間加熱し、-20℃で保存100μlの細胞を再懸濁します。 </li><li>負荷12％SDS-PAGEゲル上でサンプル当たり約4×10 4細胞。また、分子量マーカーとして市販のタンパク質ラダーの負荷6μL。 1×レムリランニング緩衝液で45〜60分間、180 Vの定電圧下でのゲル電気泳動システムでゲルを実行します。 </li><li>トランスブロットSDセミドライトランスファーセルを用いて60分間、16 Vの定電圧でPVDF膜上にブロットタンパク質（孔径0.45μmの）。 </li><li>室温で1時間、PBS / 0.05％のTween 20（MPT）中の5％脱脂粉乳の10ミリリットルのブロック膜。 </li><li> 4μを希釈MPTの4ミリリットル中の抗切断ポリADPリボースポリメラーゼ（PARP）抗体のLと4℃でO / Nインキュベート。 </li><li> 10mlのPBS / 0.05％Tween 20で3 10分間の洗浄工程を実行します。 </li><li> 4ミリリットルMPTで希釈した0.8μ​​lの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体を有する膜をインキュベートします。 </li><li> RTで1時間インキュベートした後、PBS / 0.05％Tween20で膜を3回洗浄する（6.7参照）と製造業者のプロトコルに従って市販のキットを用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を検出します。タンパク質バンドを可視化するためにフィルムの開発のための標準的な装置を適用します。 </li><li> 7ミリリットルウエスタンブロットストリッピング緩衝液で室温で30分間のインキュベーションによって結合した抗体を除去します。 </li><li> PBS / 0.05％のTween 20（6.7を参照）で3回洗浄した後、4℃でMPT O / N 4ml中の抗アクチン抗体4μlので膜をプローブ。 </li><li> MPT（6.7で説明したように）で3回の洗浄工程の後、ホの0.8μlの膜をインキュベートrseradishペルオキシダーゼ結合二次抗体は、MPTの4ミリリットルに希釈しました。 </li><li>室温で1時間インキュベートした後、0.05％/ PBSで膜を6.7に記載されているようにトゥイーン20を（3回洗浄し、製造業者のプロトコルに従って市販のキットを用いて、西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を検出。タンパク質バンドを可視化するためにフィルムの開発のための標準的な装置を適用します。 注：全てのインキュベーションステップは示された時間および温度で、プレートシェーカー上で実施しました。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

多くの病原性細菌は、宿主細胞への細菌のエフェクタータンパク質の分泌または転位する分泌系を保有します。これらのエフェクタータンパク質は、細菌が生存し、それらのそれぞれの細胞内ニッチ内で複製することができ、宿主細胞内でプロセスおよび経路を調節する能力を有します。生化学的活性およびエフェクタータンパク質の分子機構を理解することは、病原性のより良い理解に向けて支援すると病気と闘うための新たな治療ツールを開発するのを助けることができます。また、エフェクタータンパク質は、しばしば、宿主細胞の活性を模倣することによってその機能を発揮するように、それらはまた、真核細胞1の生物学についての詳細を使用することができます。 1）機能的なエフェクタータンパク質間の冗長性、2）エフェクタータンパク質の関与の時間的調節、および3）effecただし、単一のエフェクタータンパク質の生化学的活性を研究することは、いくつかの理由のために複雑であることが証明されていますTORタンパク質は、その機能を妨害する、他のエフェクタータンパク質との関連での作業します。したがって、エフェクタータンパク質の活性は、一般的に過剰発現研究により検討されています。残念なが...

多くのグラム陰性細菌病原体の毒性は、真核生物宿主細胞をハイジャックするための特殊な分泌系に依存します。細菌は細胞および生化学のさまざまな活動を調節するために宿主細胞への細菌の病原性タンパク質（エフェクター）を注入するために、これらの分泌系を使用しています。エフェクタータンパク質の研究では、ホスト/病原体相互作用の基本的な側面にも真核細胞1の基本的な生物学に顕著な洞察を提供しているだけではなく。宿主細胞のアポトーシスの調節は、多くの細胞内病原体のための重要な病原性機構であることが示されており、アポトーシスを調節するエフェクタータンパク質の数は2-9同定されています。しかし、活性のそれらの正確な分子機構は、多くの場合、とらえどころのないままです。 アポトーシス、プログラム細胞死の形態は、感染10に対する免疫応答に重要な役割を果たしています。アポトーシスに導く二つの主要な経路は、持っています特定されて：原形質膜（外因性アポトーシス）で細胞死受容体を介したミトコンドリア（内因性アポトーシス）または信号の直接伝達を標的とします。真性またはミトコンドリア媒介性の細胞死経路は、細胞内シグナルによってトリガーされ、BaxおよびBakの、のBcl-2ファミリーの2プロアポトーシスメンバーの活性化が関与しているされています。このファミリーは、細胞死を制御11-14プロおよび抗アポトーシス調節タンパク質で構成されています。アポトーシスの活性化はBaxおよびBakののオリゴマー化につながる細胞質へのシトクロムCの放出をもたらす、ミトコンドリア外膜のその後の透過処理が続きます。シトクロムcの放出は、アポトソーム15におけるカスパーゼ9の活性化を介してエフェクターカスパーゼ3および7の活性化を開始します。これは、とりわけ、細胞表面16上のホスファチジルセリンの暴露をもたらす、選択された基質のタンパク質分解をもたらし、CHをフラグメント専用のDNアーゼを解放します17,18 romatin。 アポトーシスカスケード内の個々のエフェクタータンパク質が干渉を決定するために、誘導可能な発現系は19を使用しました。導入遺伝子の条件式のための規制システムは、細胞内のタンパク質の機能や組織、器官および生物開発のための重要性だけでなく、開始、進行および疾患20-23のメンテナンス時の解析に貴重なツールとなっています。典型的には、このようなここで使用のTetシステム24と誘導制御システムは、（ 図1参照）人工的な転写単位を形成します。一方の成分は、転写活性化または24,26のサイレンシングを媒介する哺乳動物タンパク質ドメインに細菌転写抑制のTetR 25の融合によって形成されたtTA（テトラサイクリン依存性転写活性化因子）と呼ばれる人工的に操作した転写因子を、あります。第二成分は、ハイブリッドでありますプロモーター、真核生物の最小プロモーターからなる、TRE（テトラサイクリン応答性エレメント）と呼ばれる、少なくともTATAボックスおよび転写開始部位を含む、のTetR、 のtetO 24,25用の同族のDNA結合部位の複数の反復に接合。第三成分がのTetR、テトラサイクリンまたはそのようなアンヒドロやドキシサイクリン25その誘導体、の1の天然リガンドです。培地へのリガンドを添加すると、のTetRはのtetOに対するその親和性を失い、TREから解離します。その結果、標的遺伝子の転写が廃止されています。導入遺伝子の発現は、このように、しっかりと両方の細胞培養および動物20,23,24における時間および用量依存的に制御することができます。 tTAをして、導入遺伝子の発現は、テトラサイクリンの存在を除いて、構成的に発生します。テトラサイクリンは、最初の導入遺伝子の前に、システムから除去されなければならないので、これは細胞毒性または発癌性タンパク質の研究で不利であることができるexpressionが起こると、細胞上の標的タンパク質の効果をモニターすることができます。これは時間がかかり、特にトランスジェニック動物において、常に27完了していないことができます。この制限に対処するために、ドキシサイクリンの存在に逆応答とのTetR変異体は、新しい転写因子を生成するために使用された、rtTAの28（tTAをリバース）。それはTREに結合し、同時に、ドキシサイクリンの存在下で転写を活性化するのみ。残留システムの漏れやすさ、 すなわち 、TRE結合転写因子の非存在下での導入遺伝子の発現は、ゲノム組み込み部位での位置効果から（I）のいずれかを発信し、（ii）のTRE自身29、または（iii）からの非から固有のtTA / rtTAの28の結合、追加の転写サイレンサーを導入することによって対処された、システムに（テトラサイクリン依存性転写サイレンサー）30のtTSと呼ばれます。これは、rtTAの（ 図1参照）と一緒に二重の調節ネットワークを形成します。ドキシサイクリンの非存在下では、TTSはTREに結合し、積極的に残りの転写をシャットダウンします。ドキシサイクリンの存在下では、TTSはTREから解離したrtTAを同時に標的遺伝子の発現を誘導結合します。ストリンジェンシーのこの追加の層は、高活性の細胞毒性タンパク質31〜34を発現することがしばしば必要です。 この厳密に制御デュアルレギュレータ方式を使用して、アポトーシスカスケードは、与えられたエフェクタータンパク質は、アポトーシス誘導を妨害することができるかどうかの分析を可能にする定義された段階で開始することができます。この方法は、細菌のエフェクタータンパク質の抗アポトーシス活性を研究するために使用されるだけでなく、プロアポトーシスまたは毒性タンパク質の誘導性発現のために、または他のシグナル伝達経路との干渉を解剖するためのすることはできません。

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>の生命技術</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>のBiochrom</td><td>S0115</td><td></td></tr><tr><td>ペン/連鎖球菌</td>の<td>生命技術</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>の生命技術</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td>の<td></td>6365752001 <td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Roth</td><td>CP11.3</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレン製ポリ</td><td>シエン</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9891</td><td></td></tr><tr><td>ミニプロティアン テトラセル</td><td>Bio-Rad</td><td>165-8000EDU</td><td></td></tr><tr><td>トランスブロット SD セミドライトランスファーセル</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler 染色済みタンパク質ラダー</td><td>Thermo Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>PVDF メンブレン</td><td>ミリポア</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>反GFP&nbsp;</td><td>life technologies</td><td>A6455</td><td></td></tr><tr><td>切断防止 PARP</td><td>BD Bioscience</td><td>611038</td><td></td></tr><tr><td>抗アクチン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2066</td><td></td></tr><tr><td>マウス IgG (H+L)-HRPO</td><td>Dianova</td><td>111-035-062</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG (H+L)-HRPO</td><td>Dianova</td><td>111-035-045</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>Restore Plus ウェスタンブロットストリッピングバッファー</td><td>Thermo Scientific</td><td>46428</td><td></td></tr></tbody></table>

誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling

ここに提示された技術は、いずれかの標的タンパク質、あるいは小分子ステップれる分析することができ、シグナル伝達経路の構成要素と相互作用します。この方法は、選択されたシグナル伝達カスケードで定義され、所定のステップでシグナル伝達事象を開始するために、一方では、特定のタンパク質の誘導性発現に基づいています。一方、目的の遺伝子の同時発現は、その後発現される標的タンパク質の活性が上流または開始シグナル伝達事象の下流で、得られたシグナル伝達経路の読み出しに依存する場合、治験責任医師が評価することができます。ここでは、アポトーシスカスケードは、プロトコル機能性を実証するために定義されたシグナル伝達経路として選択しました。例えば、 コクシエラバーネッティなどの病原性細菌は、細胞内の細菌の生存を確保するために、それらのを促進するために宿主細胞において、宿主細胞死の誘導を妨害するエフェクタータンパク質を転生物における普​​及。 C.バーネッティエフェクタータンパク質CaeBを効果UV光を伴うまたはスタウロスポリンでのアポトーシスの誘導後に宿主細胞の死を阻害します。 CaeBはアポトーシスシグナルの伝達を妨害するステップで絞り込むには、十分に特徴付けられたプロアポトーシス活性を有する選択されたタンパク質は、ドキシサイクリン誘導性の方法で一時的に発現させました。 CaeBはこれらのタンパク質の上流に作用する場合、アポトーシスが妨害されずに続行されます。 CaeB下流に作用する場合、細胞死が阻害されます。選択した試験タンパク質は、主要な執行プロテアーゼであるミトコンドリアのレベルで作用バックス、およびカスパーゼ3でした。 CaeBはBax発現により誘導される細胞死を妨害ではなく、カスパーゼ3発現による。 CaeBは、したがって、これら2つのタンパク質間のアポトーシスカスケードと相互作用します。

まず、GFP融合タンパク質として安定に関心（CaeB）のタンパク質を発現するHEK293細胞株を樹立しました。対照として、安定的にGFPを発現するHEK293細胞株も作製しました。 GFPおよびGFP-CaeBの発現は、免疫ブロット分析によって確認しました。代表的なイムノブロット（ 図4A）は、GFPおよびGFP-CaeBの安定と明確に検出可能な発現を示しています。しかし、このアッセイは、全ての細胞がGFPまたはGFP-CaeBを発現しているかどうか判断できません。したがって、安定的にトランスフェクトHEK293細胞株は、フローサイトメトリーによって分析しました。 図4Bに示すように、両方の細胞株における細胞の90％がGFPを発現しました。したがって、これらの安定な細胞系は、さらにCaeBの機能を分析するために使用することができます。次のステップでは、CaeBの抗アポトーシス活性は、切断されたPARPに対する抗体を用いたイムノブロット分析により分析しました。核PARPのタンパク質分解切断は、DNA修復活性を不活性化し、TERMIの典型的なマーカーでありますアポトーシスの...

ここで述べられている方法は、抗アポトーシス細菌のエフェクタータンパク質の活性を解剖するために、定義されたステップでアポトーシスシグナル伝達カスケードを誘導するために使用されます。この方法は、アポトーシス促進性または毒性タンパク質の誘導性発現、または他のシグナル伝達経路との干渉の解剖にも使用できます。

The technique presented here allows one to analyze at which step a target protein, or alternatively a small molecule, interacts with the components of a ...

本実験の全体的な目的は、細菌の毒性因子が細胞内シグナリングに及ぼす干渉を研究することです。これは、目的タンパク質を発現する安定した細胞株を樹立することによって達成されます。第2段階として、バルク細胞レベルでその活性を研究するために、ホスト細胞のシグナル伝達カスケードを定義されたステップで活性化できる誘導性発現ベクターシステムを構築します。次に、目的タンパク質がホスト細胞のシグナル伝達カスケードの活性化を阻害できるかを分析し、目的タンパク質の作用点を絞り込みます。ウェスタンブロッティング分析の結果、*Coxiella burnetii*の毒性因子KABは、Baxの下流かつカスパーゼ3活性化の上流のアポトーシスカスケードを阻害することが示されました。この手法は、特定の細菌エフェクタータンパク質が信号伝達カスケードのどの重要な段階で干渉するかを特定するなど、感染生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。これにより、病原性微生物がどのように宿主を操作するかだけでなく、これらの基本的な細胞プロセスがどのように機能しているかについても、より深い理解が得られます。本手法は、アポトーシスによる細胞死を防ぐ細菌の戦略に関する知見を提供できるだけでなく、ネクロトーシスやパイロトーシスなど、細胞死分野の他の信号伝達系や、細胞増殖、遺伝子調節、あるいは免疫系の反応に関与するシグナリングネットワークにも適用可能です。この手順を実演するのは、Mann研究室の大学院生であるStephanie Beslerです。まず、GFPまたはGFP-SAYBを安定的に発現しているHEK 293細胞を、1ウェルあたり100,000細胞の密度で12ウェルプレートに播種します。次に、DNAとポリエチレン平均トランスフェクション試薬を、それぞれ75 µLのOpt-MEM中で個別に調製し、室温で5分間インキュベートして複合体を形成させます。その後、両方の混合物を合わせて室温で15分間インキュベートします。次いで、ポリエチレンDNA溶液を細胞に滴下し、37 °C、5% CO2条件下でインキュベートします。トランスフェクションの5時間後、培養液に1 $\mu\text{g}/\text{mL}$ のドキシサイクリンを添加し、プロアポトーシス蛋白質の発現を誘導します。その後、細胞を37 °C、5% $\text{CO}_2$ の条件下で18時間インキュベートし、光学顕微鏡で観察します。回収前に、細胞死が誘導されているかを確認してください。アポトーシス小体の存在によって検出可能な、誘導されたアポトーシス細胞を観察します。次に、上清を除去し、接着細胞を洗浄します。温めたPBSで1回洗浄した後、2倍濃度のLaemmliサンプルバッファー100 µLで細胞を再懸濁します。その後、95 °Cで5分間加熱し、後で使用するために-20 °Cで保存します。次に、分子量マーカーとして市販のプロテインラダーを6 µLロードします。そして、12% SDS-PAGEゲルにサンプルあたり約40,000個の細胞をロードします。1×ライニングバッファーを用い、ゲル電気泳動システムにて180 Vの定電圧で45〜60分間ゲルを泳動させます。その後、定電圧16 Vで60分間、タンパク質をPVDF膜に転写します。この際、Trans-Blot SDセミドライ転写セルを使用してください。次に、膜を10 mLのMPTで室温にて1時間ブロッキングします。7 µLの抗cleaved PARP抗体を7 mLのMPTで希釈します。PVDFメンブレンをこの抗体溶液中で4 °Cで一晩インキュベートします。抗体溶液を除去し、0.05% Tween 20含有PBSで10分間の洗浄を3回行います。その後、1.4 µLのホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識二次抗体を7 mLのMPTで希釈し、室温で1時間インキュベートします。メンブレンをPBS 0.05%Tween 20で3回洗浄し、市販のキットを用いてメーカーのプロトコルに従いホースラディッシュペルオキシダーゼ活性を検出します。そして、標準的な現像装置を用いてタンパク質バンドを可視化します。その後、PBS 0.05%Tween 20で3回洗浄した後、メンブレンを7 mLのウェスタンブロットストリッピングバッファー中で室温で30分間インキュベートし、結合した抗体を除去します。次に、4 mLのMPTに溶解した4 µLのアンチアクチン抗体を用いて、4 °Cで一晩メンブレンをプローブします。翌日、メンブレンを約10 mLの0.05% Tween 20含有PBSで10分間、3回洗浄します。その後、7 mLのMPTで希釈した1.4 µLのホースラジッシュペルオキシダーゼ接合二次抗体をメンブレンに加え、室温で1時間インキュベートします。メンブレンを0.05% Tween 20含有PBSで3回洗浄し、市販のキットを用いてホースラジッシュペルオキシダーゼ活性を検出し、標準的なフィルム現像装置を用いてタンパク質バンドを可視化します。本実験では、安定発現を確認するため、HEK 2 93 GFPおよびHEK 2 93 GFP sabe細胞の全細胞溶解液を用いてGFPの免疫ブロットを行いました。HEK 2 93 GFP細胞およびHEK 2 93 GFP sabe細胞の代表的なフローサイトメトリー解析により、GFP発現の強度が示されています。HEK 2 93 GFP細胞およびHEK 2 93 GFP sabe細胞に4 µMのスポリンを6時間処理し、内因性アポトーシスを誘導しました。アポトーシスを切断型PARPの免疫ブロット解析により分析したところ、HK 2 93 GFP細胞と比較してHK 2 9 3 GFP SA B細胞ではPARPの切断が減少していることがわかりました。CBはBax誘導性アポトーシスからは保護しますが、caspase 3誘導性アポトーシスからは保護しません。この手順を実施する際は、相互作用のステップを特定しやすくするために、シグナル伝達経路の可能な限り多くの構成要素をプローブすることが重要です。また、選択したエフェクタータンパク質が経路自体を阻害しているのか、あるいは本手順後の活性化ステップを阻害しているのかを判断するため、基底状態と活性化状態の両方で活性化されるタンパク質をテストすることが推奨されます。ノックダウン、ノックアウト、酵母ツーハイブリッド法、プルダウン、翻訳後修飾、またはタンパク質分解安定性アッセイなどの他の手法を用いることで、「これらの微生物エフェクターが宿主細胞の正常な生理機能を操作するために、具体的にどのような分子メカニズムを利用しているか」、「それが病原体の生存と拡散にどのように寄与しているか」といった追加の疑問を明らかにすることができます。

applying-an-inducible-expression-system-to-study-interference

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: ベレンズ、C. ほか。 誘導性発現システムを応用して、細菌病原性因子が細胞内シグナル伝達に干渉する様子を研究すること。 J. Vis. Exp.

細菌エフェクタータンパク質を発現する細胞への誘導性遺伝子発現系のトランスフェクション

Source: Berens, C. et al. Applying an Inducible Expression System to Study Interference of Bacterial Virulence Factors with Intracellular Signaling. J. Vis. Exp. (2015)This video demonstrates the use of immunoblotting to assess apoptosis inhibition by the bacterial effector protein CaeB in human cells. It outlines the steps for detecting apoptotic markers following doxycycline-induced expression of pro-apoptotic proteins in host cells expressing the effector.

Immunoblot Analysis of Apoptosis Inhibition in Host Cells Expressing an Antiapoptotic Bacterial Protein

この動画では、目的の遺伝子を含むプラスミドと制御プラスミドをトランスフェクションして、培養細胞の遺伝子発現を制御する方法を説明しています。このプラスミドの発現は、テトラサイクリンまたはその合成類似体によって制御できるため、このシステムは調節可能な遺伝子発現を研究するための有用なモデルとなっています。...

誘導性Tet-Off制御システム:テトラサイクリンオフシステムを使用して培養細胞における遺伝子発現を調節するIn vitro法

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部位特異的架橋法を用いた分泌細菌病原性因子の集合体のモニタリング

細菌性病原体とそれらのホスト間の相互作用を調査することは、生物学的研究の重要な領域です。ここでは、BLAM基板を用いたsiRNAの遺伝子サイレンシング中にQ熱リケッチアによってエフェクター転座を測定するために必要な技術を記載しています。...

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記載された水耕共培養システムは、金属メッシュスクリーンを有する完全な植物を支持し、それらを細菌と共培養する。植物組織、細菌、および分泌された分子は、下流の分析のために別々に採取することができ、同時に植物宿主および相互作用する微生物または微生物の両方の分子応答を調べることができる。...

植物/微生物の分子相互作用およびシグナル伝達の同時および系統的分析のための水耕栽培共生システム

細菌の本質的なプロセスの機能を理解することは困難です。ターゲット固有の染料を蛍光顕微鏡は、微生物細胞の成長そして細胞周期の進行に重要な洞察を提供できます。ここでは、アグロバクテリウムは不可欠なプロセスの特性評価のための生きているセルイメージ投射のための方法を強調するモデル菌として使用されます。...

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ここで説明は、動物組織細胞レベルでの細菌の遺伝子発現解析の方法です。このメソッドは、組織環境への応答で感染症に細菌の人口の内で発生する表現型の多様性を研究するためのリソースを提供します。...

感染した組織の細菌の遺伝子の規則を勉強する蛍光ベースのメソッド

学ぶ誘導発現系を用いた細菌病原性因子と細胞内シグナル伝達の干渉解析法。アポトーシス経路におけるタンパク質活性の特定と宿主防御回避メカニズムの解明に応用可能です。

誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

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