誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

本実験の全体的な目的は、細菌の毒性因子が細胞内シグナリングに及ぼす干渉を研究することです。これは、目的タンパク質を発現する安定した細胞株を樹立することによって達成されます。第2段階として、バルク細胞レベルでその活性を研究するために、ホスト細胞のシグナル伝達カスケードを定義されたステップで活性化できる誘導性発現ベクターシステムを構築します。次に、目的タンパク質がホスト細胞のシグナル伝達カスケードの活性化を阻害できるかを分析し、目的タンパク質の作用点を絞り込みます。ウェスタンブロッティング分析の結果、*Coxiella burnetii*の毒性因子KABは、Baxの下流かつカスパーゼ3活性化の上流のアポトーシスカスケードを阻害することが示されました。

この手法は、特定の細菌エフェクタータンパク質が信号伝達カスケードのどの重要な段階で干渉するかを特定するなど、感染生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。これにより、病原性微生物がどのように宿主を操作するかだけでなく、これらの基本的な細胞プロセスがどのように機能しているかについても、より深い理解が得られます。本手法は、アポトーシスによる細胞死を防ぐ細菌の戦略に関する知見を提供できるだけでなく、ネクロトーシスやパイロトーシスなど、細胞死分野の他の信号伝達系や、細胞増殖、遺伝子調節、あるいは免疫系の反応に関与するシグナリングネットワークにも適用可能です。

この手順を実演するのは、Mann研究室の大学院生であるStephanie Beslerです。まず、GFPまたはGFP-SAYBを安定的に発現しているHEK 293細胞を、1ウェルあたり100,000細胞の密度で12ウェルプレートに播種します。

次に、DNAとポリエチレン平均トランスフェクション試薬を、それぞれ75 µLのOpt-MEM中で個別に調製し、室温で5分間インキュベートして複合体を形成させます。その後、両方の混合物を合わせて室温で15分間インキュベートします。次いで、ポリエチレンDNA溶液を細胞に滴下し、37 °C、5% CO2条件下でインキュベートします。

トランスフェクションの5時間後、培養液に1 $\mu\text{g}/\text{mL}$ のドキシサイクリンを添加し、プロアポトーシス蛋白質の発現を誘導します。その後、細胞を37 °C、5% $\text{CO}_2$ の条件下で18時間インキュベートし、光学顕微鏡で観察します。回収前に、細胞死が誘導されているかを確認してください。

アポトーシス小体の存在によって検出可能な、誘導されたアポトーシス細胞を観察します。次に、上清を除去し、接着細胞を洗浄します。温めたPBSで1回洗浄した後、2倍濃度のLaemmliサンプルバッファー100 µLで細胞を再懸濁します。

その後、95 °Cで5分間加熱し、後で使用するために-20 °Cで保存します。次に、分子量マーカーとして市販のプロテインラダーを6 µLロードします。そして、12% SDS-PAGEゲルにサンプルあたり約40,000個の細胞をロードします。

1×ライニングバッファーを用い、ゲル電気泳動システムにて180 Vの定電圧で45〜60分間ゲルを泳動させます。その後、定電圧16 Vで60分間、タンパク質をPVDF膜に転写します。この際、Trans-Blot SDセミドライ転写セルを使用してください。次に、膜を10 mLのMPTで室温にて1時間ブロッキングします。

7 µLの抗cleaved PARP抗体を7 mLのMPTで希釈します。PVDFメンブレンをこの抗体溶液中で4 °Cで一晩インキュベートします。抗体溶液を除去し、0.05% Tween 20含有PBSで10分間の洗浄を3回行います。その後、1.4 µLのホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）標識二次抗体を7 mLのMPTで希釈し、室温で1時間インキュベートします。

メンブレンをPBS 0.05%Tween 20で3回洗浄し、市販のキットを用いてメーカーのプロトコルに従いホースラディッシュペルオキシダーゼ活性を検出します。そして、標準的な現像装置を用いてタンパク質バンドを可視化します。その後、PBS 0.05%Tween 20で3回洗浄した後、メンブレンを7 mLのウェスタンブロットストリッピングバッファー中で室温で30分間インキュベートし、結合した抗体を除去します。次に、4 mLのMPTに溶解した4 µLのアンチアクチン抗体を用いて、4 °Cで一晩メンブレンをプローブします。

翌日、メンブレンを約10 mLの0.05% Tween 20含有PBSで10分間、3回洗浄します。その後、7 mLのMPTで希釈した1.4 µLのホースラジッシュペルオキシダーゼ接合二次抗体をメンブレンに加え、室温で1時間インキュベートします。メンブレンを0.05% Tween 20含有PBSで3回洗浄し、市販のキットを用いてホースラジッシュペルオキシダーゼ活性を検出し、標準的なフィルム現像装置を用いてタンパク質バンドを可視化します。本実験では、安定発現を確認するため、HEK 2 93 GFPおよびHEK 2 93 GFP sabe細胞の全細胞溶解液を用いてGFPの免疫ブロットを行いました。

HEK 2 93 GFP細胞およびHEK 2 93 GFP sabe細胞の代表的なフローサイトメトリー解析により、GFP発現の強度が示されています。HEK 2 93 GFP細胞およびHEK 2 93 GFP sabe細胞に4 µMのスポリンを6時間処理し、内因性アポトーシスを誘導しました。アポトーシスを切断型PARPの免疫ブロット解析により分析したところ、HK 2 93 GFP細胞と比較してHK 2 9 3 GFP SA B細胞ではPARPの切断が減少していることがわかりました。

CBはBax誘導性アポトーシスからは保護しますが、caspase 3誘導性アポトーシスからは保護しません。この手順を実施する際は、相互作用のステップを特定しやすくするために、シグナル伝達経路の可能な限り多くの構成要素をプローブすることが重要です。また、選択したエフェクタータンパク質が経路自体を阻害しているのか、あるいは本手順後の活性化ステップを阻害しているのかを判断するため、基底状態と活性化状態の両方で活性化されるタンパク質をテストすることが推奨されます。

ノックダウン、ノックアウト、酵母ツーハイブリッド法、プルダウン、翻訳後修飾、またはタンパク質分解安定性アッセイなどの他の手法を用いることで、「これらの微生物エフェクターが宿主細胞の正常な生理機能を操作するために、具体的にどのような分子メカニズムを利用しているか」、「それが病原体の生存と拡散にどのように寄与しているか」といった追加の疑問を明らかにすることができます。