誘導発現系を適用すると、細胞内シグナル伝達と細菌の病原性因子の干渉を研究するために、

次の実験の全体的な目標は、細菌の病原性因子と細胞内シグナル伝達との干渉を研究することです。これは、安定した細胞株を確立し、目的のタンパク質を発現することによって達成されます 第2のステップとして、バルク細胞レベルでその活性を研究するために、誘導可能な発現ベクターシステムが作成され、これにより、宿主細胞シグナル伝達カスケードを所定のステップで活性化することができます。次に、目的タンパク質が宿主細胞シグナル伝達カスケードの活性化を妨害できるかどうかを解析し、目的タンパク質の活動点を絞り込むために、居心地の良い黄色のバーネット病原性因子KA Bがバックの下流およびカスケード3の活性化上流のアポトーシスカスケードを妨害することを示すウェスタンブロッティング解析に基づく。

この方法は、特定の細菌エフェクタータンパク質が干渉するシグナル伝達カスケードの主要なステップを特定するなど、感染生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。これは、病原性微生物が宿主をどのように操作するかだけでなく、これらの基本的な細胞プロセスがどのように機能するかをよりよく理解するのに役立ちます。この方法は、アポトーシス細胞死の発生を防ぐための細菌戦略に関する洞察を提供しますが、ONSやパイロプトーシスなど、細胞死分野の他のシグナル伝達システムや、細胞増殖、遺伝子調節、免疫系による反応に関与するシグナル伝達ネットワークにも適用できます。

この手順を実演するのは、Mannの研究室の大学院生であるStephanie Beslerです。この手順は、GFPまたはGFPを安定して発現するHEK 2 93細胞、例えばBを12に播種することから始めます。ウェルプレートは、ウェルあたり100, 000細胞の密度でプレートします。

次に、75 μLのopt培地にDNAとポリエチレン平均トランスフェクション試薬を別々に調製し、室温で5分間インキュベートして複合体を形成します。両方の混合物を室温で15分間インキュベートします。その後、ポリエチレンDNA溶液を細胞に滴下し、5%二酸化炭素中で摂氏37度でインキュベー

トランスフェクションの5時間後に、ドキシサイクリン1ミリリットルあたり1マイクログラムを培地に添加することにより、プロアポトーシスタンパク質の発現を誘導します。次に、光学顕微鏡下で細胞を摂氏37度で5%二酸化炭素中で18時間インキュベートします。回収前に細胞死誘導について細胞を検査します。

アポトーシス体の存在によって検出可能な誘導されたアポトーシス細胞を調べます。次に、上清液を取り除き、付着した細胞を洗います。温かいPBSを使用したら、細胞を100マイクロリットルの2×ランビーサンプルバッファーに再懸濁します。

その後、95°Cで5分間加熱し、その後の使用のためにマイナス20°Cで保存します。その後、分子量マーカーとして市販のタンパク質ラダーを6マイクロリットルロードします。次に、サンプルあたり約40, 000個の細胞を12%SDSページゲルにロードします。

ゲル電気泳動システムで、1 x lalyランニングバッファーを使用して、180ボルトの定電圧で45〜60分間ゲルを泳動します。その後、タンパク質をPVDFメンブレン上に16ボルトの定電圧で60分間BLOします。トランスブロットSDセミドライトランスファーセルを使用し、メンブレンを10ミリリットルのMPTで室温で1時間ブロックします。

7マイクロリットルの抗切断PARP抗体を7ミリリットルのMPTに希釈します。PVDFメンブレンを抗体溶液と4°Cで一晩インキュベートします。抗体溶液を取り出し、PBS 0.05%Tween 20で10分間の洗浄を3回行い、インキュベーション後、7ミリリットルのMPTで希釈した1.4マイクロリットルの西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体とメンブレンをインキュベートします。

PBS 0.05%Tween 20で膜を3回洗浄し、メーカーのプロトコルに従って市販のキットで西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を検出します。また、フィルム現像用の標準装備を適用し、タンパク質バンドを可視化します。次に、PBS 0.05%Tween 20で3回洗浄した後、7ミリリットルのウェスタンブロットストリッピングバッファーでメンブレンを室温で30分間インキュベートすることにより、結合した抗体を除去し、4マイクロリットルの抗アクチン抗体で4マイクロリットルの抗アクチン抗体でメンブレンを4ミリリットルのMPTで摂氏4度で一晩プローブします。

翌日、約10ミリリットルのPBS 0.05%Tween 20でメンブレン上で3回の10分間の洗浄ステップを行い、次に7ミリリットルのMPTで希釈した1.4マイクロリットルのホースラディッシュペルオキシダーゼ標識二次抗体でメンブレンをインキュベートします室温で1時間のインキュベーション後。PBS 0.05%Tween 20でメンブレンを3回洗浄し、市販のキットで西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を検出し、フィルム現像用の標準装備を適用してタンパク質禁止を可視化します。この実験では、HEK 2 93 GFPおよびHEK 2 93 GFP sabe細胞の全細胞ライセートをGFPに対して免疫血し、安定した発現を示しました。

HEK 2 93 GFPおよびHEK 2 93 GFP sabe細胞の代表的なフローサイトメトリー解析では、GFP発現の強度が示されています。HEK 2 93 GFPおよびHEK 2 93 GFP sabe細胞を4マイクロモルスポリンで6時間処理し、内因性アポトーシスを誘導した。アポトーシスは、切断されたPARP免疫ブロット分析によって分析され、PARP切断はHK 2 93 GFP細胞と比較してHK 2 9 3 GFP SA B細胞で減少することがわかりました。

CBはバックス誘導性アポトーシスから保護しますが、カスパーゼ3誘導性アポトーシスからは保護しません。この手順を実施する際には、相互作用ステップを特定するために、シグナル伝達経路のできるだけ多くの成分を調査することが重要です。また、基底状態と活性化状態の両方で活性化されるタンパク質を試験して、選択したエフェクタータンパク質が経路自体に干渉するかどうか、またはこの手順に続く活性化ステップに干渉するかどうかを判断することも良いでしょう。

ノックダウン、ノックアウト酵母、2つのハイブリッドプルダウン、翻訳後修飾、またはタンパク質分解安定性アッセイなどの他の方法を実行して、これらの微生物エフェクターが正常な宿主細胞生理機能を操作するために採用する正確な分子メカニズムは何か、などの追加の質問に答えることができますか?そして、これは病原体の生存と播種にどのように役立つのでしょうか。