Name: ランゲンドルフ灌流ラット心臓における虚血再灌流傷害の誘導と評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学ぶランゲンドルフ灌流法によるラット心臓の虚血再灌流傷害モデル。バッファー流停止と再開で虚血を誘導し、心室圧測定で心筋機能を評価する。心臓生理学研究に有用な手法です。

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この刊行物は、サウスカロライナ医科大学の学術家、NIH / NCATS認可番号UL1 TR000062と、サウスカロライナ州臨床およびトランスレーショナルリサーチ（SCTR）研究所によってサポートされていました。さらにサポートがDRMにVAのメリット賞BX002327-01によって提供されました。 DJHは、NIH / NCATS認可番号TL1 TR000061によっておよびNIH認可番号T32 GM008716によってサポートされていました。 SEAは、NIHグラント番号T32 HL07260によってサポートされていました。

ここに記載されたすべての手順は、サウスカロライナ医科大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されています。ここに記載した実験は、急性、非生存実験です。このように、そこに眼軟膏のない使用はありませんし、無菌手術室は必要ありません。安楽死は、心臓の収穫時に放血することによって達成されます。 1。実験の準備<ol><li>一定圧力または一定流量、ランゲンドルフ灌流装置4のいずれかを設定します。 </li><li> （：112のNaCl、5 KClを、1.2 硫酸マグネシウム、1 K 2 HPO 4、1.25のCaCl 2、25のNaHCO 3、11 D-グルコース、0.2オクタン酸、pH値= 7.4ミリモル）に変更されたクレブスヘンゼライト緩衝液の4 Lを準備します。 <ol><li> 10×ストックバッファを作成します。 <ol><li> 3 Lの超純水に塩化ナトリウム、塩化カリウム、 硫酸マグネシウム、及びK 2 HPO 4を溶解します。 </li><li> 500ミリリットル超純水のwiでのCaCl 2を溶解1 N HClを40mlの目。 </li><li>ゆっくり1.2.1.1で行われたバッファへのCaCl 2溶液を加えます。 4 L.合計するのに十分な超純水を追加し、0.8ミクロンフィルターを通して濾過する前に、1時間攪拌します。 4℃で保存します。 </li><li> 4 Lの超純水に炭酸水素ナトリウムを溶解します。 0.8μmのフィルターで通して濾過する前に1時間攪拌します。 4°Cで保存</li></ol></li><li> 400ミリリットル10倍クレブスヘンゼライト緩衝液を400mlの10倍のNaHCO 3緩衝液で結合します。攪拌しながら、グルコースおよびオクタン酸を溶かし4 L.合計するのに十分な超純水を追加します。 0.8μmのフィルターを通して濾過します。 </li></ol></li><li>心のためのシステムを準備します。 <ol><li> 4 Lボトルにろ過し、バッファの2 Lを追加大動脈カニューレに取り付けられたコック上記に38を置きました。これは推奨灌流圧4である心臓に70〜80 mmHgでの灌流圧をお届けします。 </li><li>ボトル内のバッファにガス分散バブラーを挿入します。 </li><li>チューブの内部から気泡を除去するようにしてくださいされ、システムを介してバッファを実行します。 </li><li>心臓の前に少なくとも30分（95％O 2/5％CO 2）ガスをオンにすると、システム上に配置されることになります。酸素飽和度を確認するために、ガス流プローブおよび血液ガス分析装置を使用します。 </li></ol></li><li>外科的供給とバルーンを準備します。 <ol><li>心の収穫については、6.75「手術用はさみ、4.5の1対」ハサミ、止血の二対、caramalt鉗子の二組、27 G針を持つ2つのシリンジ、0 - ゲージ絹縫合糸の2個（約15の1組を準備長さはセンチ）、1 1/16インチ有刺カニューレ、1気管カニューレ。 </li><li>気管カニューレを組み立てるには、Yコネクタに1/16インチ径のプラスチック管の短い断片を接着。 </li><li>バルーン装置を組み立てるには：1/16インチチューブの片に強制経口投与針を取り付け、その後、圧力変換器ハウジングにチューブを接続します。圧力TRの反対側に取り付けられた小型の注射器ansducerハウジングは、バルーンの膨張および収縮が可能になります。 <ol><li>中心部の強制経口投与針のプラスチックラップと場所先端の正方形をカットします。経管栄養針の周りにラップを包みます。 </li><li>生理食塩水でバルーンを記入し、2本の縫合糸で縛ります。漏れがないことを確認するためにバルーンを膨らませます。膨張したバルーン内の生理食塩水の量​​は、およそ200μLであるべきであるが、ラットの大きさに依存して変化し得ます。 </li><li>あるいは、プラスチックラップの代わりにラテックス指サックを使用しています。指サックの中に強制経口投与針を置き、生理食塩水で満たし、縛ります。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.収穫の心<ol><li> decapiconeまたは他の手動の拘束装置を使用して、スプラーグドーリーラットを抑制する。ラットを計量。 </li><li>ラットを麻酔するために腹腔内注射を介して、ケタミン/キシラジン混合物（0.85ミリグラム/ kgのケタミンおよび0.15ミリグラム/ kgのキシラジン）を管理します。麻酔薬のこの用量は、のために十分な麻酔を提供します20〜40分が、麻酔が確認された後の手順では、可能な限り迅速に完了する必要があります。 </li><li>つま先ピンチ反射をテストすることによって、麻酔の適切度を確認してください。 </li><li>気管切開<ol><li>切開を作るために毛皮やはさみを上昇させるために止血剤を使用して、顎のベースに半ば前足から毛皮を削除します。一つは毛皮に沿って切断し、それを削除することができ、基礎となる筋肉からそれを分離するために上昇した毛皮を保管してください。 </li><li>止血剤を使用して、腺組織を持ち上げ、腺組織に筋膜の横切開が悪くなります。ニックにない頸静脈を注意しながら、オープン切開部を広げるために止血剤を使用してください。 </li><li> 、止血剤を使用してピンチの筋肉の気管の上にあるし、使用してハサミだけで止血の先端下の筋肉に横切開を行います。止血鉗子を使用して、気管を明らかに離れて組織を広げます。 </li><li>静かに止血を前進および後退させることによって進行しながら、筋膜をクリアし、気管の下に止血剤を慎重に挿入します。 </li><li>止血剤が正常気管の後ろに配置されると、止血剤で0-0絹縫合糸をつまんではさみの小さな、鋭いペアで気管を二等分します。 </li><li>二等分気管に気管カニューレを挿入し、気管の後ろに縫合糸を引っ張ると、カニューレを挿入し、気管の周りに縫合糸を結ぶ、外科医の結び目とカニューレのY-鼠径部に縫合糸を固定します。 </li><li> 27 G針を使用して、頸静脈に千U / kgのヘパリンを注入し、30秒間を循環させています。 </li></ol></li><li>開胸<ol><li>止血剤でピンチとハサミで切断することにより、ミッド前足領域に半ば腹部から毛皮を削除します。 </li><li>ちょうどダイヤフラムの下に、腹部の筋肉壁に¾インチ横切開を加えます。 </li><li>胸骨に沿って切断し、腹壁と胸の壁まで縦切開を行います。 </li><li>左右のバックダイアフラムをカットし、それが普及のまま確保するために止血剤と心を明らかにするために胸郭、クランプ胸郭を広げます。 </li&gt; <li>止血剤を使用して、静かに上行大動脈を露出し、胸腺を削除します。 </li><li>進退止血剤を、ゆっくりと止血の先端を介してできるように筋膜を広げ、大動脈ループを介して止血をいじめます。 </li><li> 、上行大動脈の後ろに0-0絹縫合糸を引っ張る緩い半正方形の結び目に縫合糸を結ぶために止血剤を使用してください。 </li><li>灌流バッファ、二等分する大動脈の流れを開始し、すぐに大動脈内腔にカニューレを挿入するためにコックを回します。急速半正方形の結び目を締める、徹底的に締め、結び目を完了します。 </li><li> 、離れて大血管から心臓を解剖胸から心臓を除去し、灌流列に接続するはさみを使用してください。 </li><li>過剰な肺組織を切り取ると、心臓がバルーンの挿入前に約15分間カラムに平衡化することができます。 10〜20ミリリットル/分の中心部を介してバッファの通常の流量を使用してください。 </li></ol></li></ol> 3.ランゲンドルフ灌流と虚血再灌流障害<ol><li> LV前の配置ssureバルーン<ol><li>円錐状に回転させながらバルーンを収縮し、バルーンが収縮したまま確保するためにコックを回します。 </li><li>消費税​​は、僧帽弁へのアクセスを露出するようにはさみの小さなペアで心房を残しました。 </li><li>左心房と左心室に僧帽弁を介してバルーンを挿入します。 </li><li>圧力監視ソフトウェアを起動します（LabChartプロ）。 </li><li>コックを開け、ゆっくりとマイクロマノメーターから拡張期圧の読みがゼロを超えるまでバルーンに生理食塩水の量​​を増加させることにより、バルーンを膨らませます。 </li><li>ゆっくりと収縮、長さ張力応答を確認75 mmHgでの拡張期圧にゆっくりバルーンを膨張させるために、一回繰り返します。 </li><li>バルーンに生理食塩水の量​​を調節することによって、10 mmHgでの拡張期圧を設定します。インフレのこのレベルでバルーンをシールし、LVのバルーンと圧力変換器との間の閉鎖圧力システムを維持するためにコックを回します。 </li><li>プラスチックと加熱室とカバー室内への低い心。 </li></ol></li><li>広告虚血再灌流障害の奉仕<ol><li>加熱室の底部を接続し、チャンバが流出し、バッファを充填することを可能にします。 </li><li>バッファが心を沈めたときに、全体的虚血を誘導する、心臓にバッファの流れを止めるためにストップコックを回します。虚血時間は、実験の目的に依存して変化し得ます。 </li><li>虚血の30分後、再灌流を開始し、心臓にバッファの流れを回復するためにコックを回します。 </li><li>実験を終了する前に1時間、心臓の再灌流を可能にします。実験の目的に応じて、変数の再灌流時間を使用してください。 </li></ol></li><li>実験の終了および組織の収穫<ol><li>栓の側面ポートを使用して、心臓を停止させるために10ml /分の速度で心臓に4℃でリン酸緩衝生理食塩水を10mlを投与。 </li><li>残りの心房組織を切り取る、潅流カラムから心臓を取り出します。 </li><li>ペンシルベニア州で覆い、ステンレス鋼の組織スライスマトリックスに心を置きます8分間、または心臓まで-80℃でrafilm、および場所は、マシュマロのような一貫性を持っています。 </li><li>冷凍庫からブロックを削除し、2mmのスライスに心をスライスする行列をスライスにrazorbladesを挿入します。組織ブロックは2ミリメートル以外のスライスサイズで購入することができます。 </li><li>スライスを一度に1つを削除して、生化学的研究のための凍結をフラッシュする液体窒素の中にドロップします。梗塞染色のための頂点から第三脳室のスライスを保持します。 </li><li>生化学実験に使用するまで-80℃で液体窒素とストアから組織を削除します。 </li></ol></li><li>梗塞染色<ol><li> 37℃で15分間/ Vの塩化トリフェニルテトラゾリウム（TTC）の1％w 10mlに第心室切片をインキュベートします。 注：TTCでのインキュベーションは、有効15変化なしで15または30分間行うことができます。 </li><li> 10％緩衝ホルマリンにTTCから組織切片を移し、室温で一晩インキュベートすることができます。最適な結果を得るために、聞きますTSは、ホルマリンから取り出し、24時間以内に4画像化されるべきです。 </li><li>写真はスライスを染色し、製造業者のプロトコルに従って梗塞の大きさを推定するために、このようなImageJのようなソフトウェアを使用しています。色素が時間をかけてフェードインしますように、固定後できるだけ早く写真を撮ります。 </li></ol></li></ol>

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

単離された灌流ラット心臓が正常虚血再灌流傷害9心臓プレコンディショニングにおける薬理学的介入の効果を研究するために使用することができます。しかし、再現可能な結果を​​保証するために標準化されなければならない手順をいくつかの重要なステップがあります。システム内で37.4℃の温度を維持することはあっても軽度の低体温と高体温が心臓プレコンディショニング10,11の原因となりますので、非常に重要です。ケタミンへの長時間の暴露が、心臓のプレコンディショニング12を妨げる可能性の心臓の切除に麻酔薬の注射からの経過時間全体を最小限に抑える必要があります。 その場での大動脈のタイムリーな挿管は、心臓切除の前に心臓や動物の放血内の低酸素症の発症を予防するために不可欠です。全体的に、最初の切開からの心臓の除去に時間がもう6-8分以内とします。左心室のBAlloonは、各実験の前に漏れがないかチェックし、必要に応じて交換する必要があります。システムは、細心の注意を払って、各実行後に蒸留水で装置全体をフラッシュするとチューブの内部の漏れや汚染を防止するために、必要に応じて使い古...

虚血および再灌流の両方に対する心臓応答の基礎となる事象の解明は、心筋梗塞1および大動脈クロスクランプ2を必要とする心臓の外科手術の治療の向上に不可欠です。虚血再灌流障害のin vivoモデルは、非常に有用なエンドポイント解析を可能にするが、それらはリアルタイムで急性虚血再灌流障害の機能的効果を研究するように有効ではありません。さらに、 インビボでの虚血再灌流モデルは、一般的に梗塞サイズで有意な変動を生成し、再灌流時の心臓への薬剤の直接送達は、困難です。虚血再灌流障害を研究するためのランゲンドルフ単離心臓システムの利用は薬理学的治療、梗塞組織の均一な領域と、直接心筋への薬物の瞬間デリバリーのリアルタイム機能評価を可能にします。 最初のBを記載1895年3中のyオスカーランゲンドルフ、ランゲンドルフ単離された心臓は、過去40年間4,5のために、虚血再灌流研究に用いられている、虚血再灌流障害を研究するための堅牢なモデルです。ここでは、いくつかの変更は、機能解析のために、単離された心臓を最適化するために行われる。大動脈のその場挿管で心臓が鼓動を心臓が虚血再灌流試験6の結果を変化させる虚血プレコンディショニングを、経験していないことが保証されています。これを容易にするために、気管切開は、換気を可能にし、手術中、ラットの生理学的安定性を確保することが行われます。心臓は、その後、クレブスヘンゼライト緩衝液を大動脈に直接逆行性灌流を介して配信され、それを通してガラスウォータージャケットスパイラルカラムに取り付けられています。生理食塩水で満たされたバルーンを左心室に挿入し、心室AN内からの圧力の実時間測定を可能にする圧力トランスデューサーに取り付けられています。複数の機能パラメータのd計算。実験の終了時に、心臓が収縮し、DNA、RNAおよびタンパク質レベルのダウンストリーム解析を可能にするために、液体窒素中で急速冷凍を逮捕するために、冷生理食塩水でフラッシュされます。このように変更され、ランゲンドルフ灌流心臓は虚血再灌流障害の間に急性任意の時点での薬理学的介入の生理的効果を直接監視するための効果的なシステムとして機能します。

<table><tbody><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Σ Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Σ Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Σ Aldrich</td><td>203726</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム二塩基</td><td>性 Σ Aldrich</td><td>RES20765-A7</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Σ Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム重炭酸</td><td>塩 Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>オクタン酸</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2875</td><td></td></tr><tr><td>2,3,5-トリフェニルテトラゾリウムクロリド Sigma</td><td>Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>医療用圧力トランスデューサ</td><td>MEMSCAP</td><td>SP844</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex 蠕動ポンプ</td><td>コールパーマー</td><td>EW-07521-40</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex Easy Load Pump Head</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>加熱循環水浴</td><td>Lauda</td><td>M3</td><td></td></tr><tr><td>チューブ フロー モジュール</td><td>Transonic</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>モジュラー リサーチ コンソール</td><td>Transonic</td><td>T402</td><td></td></tr><tr><td>インライン フロー センサー</td><td>Transonic</td><td>ME2PXN</td><td></td></tr><tr><td>PowerLabデータ集録デバイス</td><td>ADインスツルメンツ</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>LabChart データ集録ソフトウェア</td><td>アドインスツルメンツ</td><td>MLU60/8</td><td></td></tr></tbody></table>

ランゲンドルフ灌流ラット心臓における虚血再灌流傷害の誘導と評価

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

急性期における虚血再灌流障害を取り巻く生化学的事象は、心筋梗塞および胸部手術の心臓合併症に対する新たな治療選択肢を促進するために非常に重要です。虚血再灌流障害に対して心筋をプレコンディショニングする特定の薬剤の能力は、複数の臨床試験につながっていますが、ほとんど成功していません。単離された心臓モデルにより、虚血再灌流障害の任意の時点前または虚血再灌流障害ウィンドウ内の任意の時点で投与されたさまざまな薬理学的介入の影響を含む、虚血再灌流障害の機能的影響をリアルタイムで急性に観察できます。短期間の虚血は虚血性損傷に対して心臓を前置する可能性があるため、非前処理された心筋の機能評価を可能にするために、in situ大動脈カニューレ挿入が行われます。生理食塩水で満たされたバルーンを左心室に配置して、圧力発生のリアルタイム測定を可能にします。虚血性損傷は、灌流バッファーの流れの停止とそれに続く再灌流によってシミュレートされます。虚血と再灌流の両方の持続時間を調節して、任意の時点での生化学的事象を調べることができます。ランゲンドルフの単離心臓モデルでは、虚血や再灌流に影響を与える全身事象を考慮することはできませんが、虚血再灌流障害のウィンドウ内の急性の機能的および生化学的事象や、心臓のプレコンディショニングとポストコンディショニングに対する薬理学的介入の影響を調べるための優れたモデルです。このプロトコルの目標は、ランゲンドルフ モデルで in situ 大動脈カニューレ挿入と心臓切除とそれに続く虚血/再灌流損傷を実行する方法を実証することです。

左心室のバルーン装置は、左心室収縮（ 図1）によって開発された圧力のリアルタイムモニタリングを可能にします。先に7に説明したように、この圧力トレースは、心室機能のパラメータの多くを計算することができます。これらの計算は、ベースライン期と同様に再灌流段階で行うことができ、各グループ内で複数のトレース上で平均し、我々は以前に9を行っているような薬理学的介入は、心臓のプレコンディショニングをもたらしたかどうかを決定するために比較しました。そのようなパラメータは、収縮期血圧と拡張末期圧との差として計算し発生する圧力です。通常の灌流ラット心臓における開発の圧力は70〜130 mmHgの（ 図1A）の範囲とすることができます。虚血性傷害後、発生圧力が減少し、拡張末期圧が上昇（ 図1B）されます。ラットがある場合このようなクラスIおよび18は、心臓を切除する前に、先進の圧力の低下や虚血再灌流障害に関連した拡張末期圧の上昇が減衰しているのIIb HDAC阻害剤SAHA（ボリノスタット）（...

孤立したラットの心臓は、虚血再灌流障害の永続的なモデルです。ここでは、ラットからin situ大動脈カニューレ挿入、心臓のランゲンドルフ灌流、模擬虚血再灌流障害、および虚血性傷害の程度を確認するための梗塞染色を介して鼓動する心臓を採取するプロセスについて説明します。

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

この手順の全体的な目的は、虚血再灌流障害をex vivoでモデル化することです。まず、ラットを麻酔し、胸部を開いてC2で大動脈にカニュレーションを行うことで、心筋の虚血プレコンディショニングを防止します。次に、心臓を摘出してalanor灌流装置に接続します。最終ステップは、バッファーの流れを一定時間停止させ、その後再開させることで、虚血再灌流障害を誘発することです。最終的に、心室圧の生成を用いて、虚血再灌流障害が心筋機能に及ぼす影響を示します。この手法は、虚血再灌流障害のダイナミックな最初の数時間にどのような分子イベントが発生するかなど、心虚血再灌流分野における重要な疑問への回答に役立てることができます。まず、ラットが確実に麻酔状態にあることを確認した後、必要な麻酔量を算出します。気管切開を開始するため、まず前肢の中点から顎の付け根まで皮膚を切開します。止血鉗子を使用して皮膚を脇に寄せ、筋肉組織を露出させます。次に、止血鉗子で腺組織を持ち上げ、鋏を用いて筋膜に下方向への切開を加えます。露出した組織を別の止血鉗子で広げます。この際、頸静脈を傷つけないように注意してください。次に、止血鉗子を用いて、気管上の筋肉をハサミで横方向に切開します。その後、止血鉗子を用いて気管を露出させ、その際、筋膜を除去しながら慎重に止血鉗子を気管の下に配置します。次に、気管の後方で0.0シルク縫合糸を止血鉗子で挟みます。次に、ハサミを用いて切開します。気管を気管に沿って dissections します。気管カニューレを挿入し、カニューレのY字型分岐部に縫合糸で固定します。次に、27ゲージの針を装着したシリンジを用いて、ヘパリンを1kgあたり1000 units、頸静脈に注射します。開胸術に進む前に30秒間待ちます。止血鉗子とハサミを使用して、腹部中央から前肢の中央までの皮膚を除去し、開胸術を開始します。次に、横隔膜の直下の腹壁に0.75インチの切開を加えます。胸骨に沿って垂直に切開を続けます。その後、横隔膜を両側から切断し、肋骨を露出させます。次に、肋骨を広げ、止血鉗子で横に固定して心臓を露出させます。大動脈へのカニュレーションは、本手順において最も重要なステップです。心臓に短時間の虚血が生じると、その後の虚血再灌流の結果に影響を与えるため、カニューレを正確に挿入し、迅速に結紮する必要があります。止血鉗子を用いて実験を行います。上行大動脈にアクセスするため、慎重に胸腺を除去します。筋膜を介して、大動脈ループに止血鉗子を操作して挿入します。次に、00番のシルク縫合糸を開口部に通し、緩いオーバーハンドノットで結びます。ここで、カニューレから灌流バッファーの注入を開始します。続いて、大動脈を剥離し、直ちに大動脈腔内にカニューレを挿入します。結び目を締め、スクエアノット（本結び）にしてカニューレを固定します。ハサミを用いて、心臓を大血管から剥離します。心臓が離れたら取り出し、灌流カラムに取り付けます。過剰な肺組織を切り取り、取り除きます。約15分後には、心臓が10〜20 mL/minの通常のバッファー流量で平衡状態になります。心臓がカラムと平衡状態になったところで、バルーンを挿入します。まず、バルーンを円錐形に丸めながら、空気を抜きます。バルーンの脱気後、フローを固定します。次に、心臓の左心房を切除して、僧帽弁にアクセスします。次に、僧帽弁を介してバルーンを左心室に挿入します。LabChart Proソフトウェアを使用して収縮期および拡張期の圧力をモニタリングし始め、圧力が0より大きくなるまでバルーンを膨らませます。その後、長さ-張力応答を確認します。圧力が75 mmHgに達するまで、ゆっくりとバルーンを膨らませます。その後、ゆっくりと空気を抜き、この操作を繰り返します。バルーン内の生理食塩水の量を調整して、圧力を10 mmHgまで下げてください。次に、この圧力でバルーンを固定し、バルーンとトランスデューサーの間を密閉した加圧系に維持します。最後に、心臓を加温チャンバー内に下げ、プラスチックラップで密閉します。チャンバーは、融合バッファーで満たされるように栓をしてください。心臓を浸したところで、バッファーの送液を停止します。これにより、必要な時間だけ全心虚血を誘発します。本例では30分間とします。30分後、心臓へのバッファーの流れを再開させ、チャンバーの栓を抜いて虚血を停止させます。再灌流を任意の時間まで行い、その後、実験を終了します（本例では、ストップコックのサイドポートから再灌流を開始して1時間後となります）。1分間で10 mLの氷冷PBSを投与します。これにより心停止が起こります。次に、心臓をカラムから取り出し、残っている心房組織を切り除きます。心臓の水分を吸い取って拭き、スライシングマトリクスに移してperfilで覆います。心臓を-80°Cで8分間、またはマシュマロのような硬さになるまで凍結させます。カミソリを用いて心臓を2 mmの厚さに切断するか、または好みに応じて各スライスを個別に切り出し、液体窒素で凍結させます。生化学的解析を行う場合は、凍結したスライスを-80°Cで保存してください。梗塞部位の染色のために、1枚のスライスを液体窒素で凍結させずに保持します。上述のプロトコルにおいて、左室バルーン装置を用いることで、収縮する左室によって発生する圧力をリアルタイムでモニタリングすることが可能です。正常な心臓では、発生圧は70から130 mmHgの範囲になります。虚血性障害後、動物に投与した際、発生圧は低下し、心拡張末期圧は上昇します。摘出前に、クラスIおよびIIB HDAC阻害剤であるsahaのようなプレコンディショニング剤を投与すると、ベースライン圧は変動する可能性がありますが、虚血再灌流傷害の影響は軽減されます。左室機能に関するその他の指標も、ソフトウェアの出力から直接的に取得または算出することができます。代謝活性のある組織を赤色に染色するTTCを用いて損傷した心臓を調べたところ、虚血再灌流傷害を受けた心臓は代謝活性が著しく低く、この処置後に梗塞組織が含まれていることが明らかになりました。リアルタイム定量PCR、ウェスタンブロッティング、質量分析などの手法を用いることで、虚血、再灌流傷害、および薬物治療が心臓にどのような生化学的および遺伝学的影響を及ぼすかといった疑問に対する答えを得ることができます。

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本研究は、生存症例の左ミニ開胸術または非生存症例の正中胸骨切開術を使用したウサギの急性局所心筋虚血および再灌流損傷の再現性の高い動物モデルを示しています。...

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中大脳動脈閉塞再灌流のための修正モデル調製

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正常体温心停止と心肺蘇生法：虚血再灌流障害のマウスモデル

学ぶランゲンドルフ灌流法によるラット心臓の虚血再灌流傷害モデル。バッファー流停止と再開で虚血を誘導し、心室圧測定で心筋機能を評価する。心臓生理学研究に有用な手法です。

ランゲンドルフ灌流ラット心臓における虚血再灌流傷害の誘導と評価

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