Name: ヒト多能性幹細胞における転写因子の過剰発現によって、造血内皮と血液の直接誘導 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 学ぶ ヒト多能性幹細胞から転写因子の過剰発現により造血内皮と血液細胞を効率的に誘導する方法。内皮から造血への遷移を観察し、血球発生の分子メカニズムを解明するための信頼性の高い実験系を構築できます。

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編集の協力をしてくれたMatt Raymondに感謝します。この研究は、国立衛生研究所(U01HL099773、R01HL116221、P51 RR000167)とシャーロット・ガイヤー財団からの資金提供を受けました。

1.ウイルス調製物および転写因子の組み合わせ<ol><li> ETV2、GATA1、GATA2、TAL1およびLMO2のためのタンパク質をコードするDNA（ 表1）を含む PSIN-EF1αレンチウイルス発現プラスミドを含む溶液を準備します。 </li><li> 230ナノメートル、260ナノメートル、および280 nmで分光光度計を用いてUV吸収を記録することにより、レンチウイルス産生のために用いられたプラスミド調製物の濃度および純度を測定します。注：1.8よりも大きなDNA調製実証A260 / 280およびA260 / 230の値は、一般的に良い品質と考えられています。下部A260 / 230の値は、フェノールのような塩またはいくつかの溶媒を用いて不純物を示しながら、低いA260 / 280の値は、タンパク質汚染を示すことができます。推奨プラスミド濃度は、1〜3μgの/μlです。 </li><li>以前に発表されたプロトコル11で説明したように形質導入のためのレンチウイルスを生成します。汎骨髄可能性を秘めたHEの誘導はETV2およびGATA1、またはETV2およびGATA2の共発現を必要とします。赤血球および巨核球ポテンシャルのHEの誘導はGATA2およびTAL1が必要です。 LMO2の添加は大幅にGATA2とTAL1 10の存在下でhPSCsからエリスロ巨核球細胞の歩留まりを向上させることができます。 </li></ol> 2. hPSCs培養プロトコル<ol><li>継代培養前に70〜80％の密集度にシャープなエッジとの緊密なコロニーで多能性幹細胞を増殖させます。マークと削除は、自発的に細胞を継代する前にコロニーを分化しました。 </li><li>使用前に4℃で、または少なくとも1時間37℃で一晩、製造者の指示及び被覆6ウェルプレートによれば（ 表2参照 ）は、市販の細胞外マトリックスゲルを希釈します。細胞を継代する前に、行列を吸引、新鮮な商業完全culturemediumの2ミリリットルを追加します（ 表2を参照）、37でプレートを保ちます ℃、5％CO 2の細胞が播種のための準備が整うまで。 </li><li>パッセージhPSCs <ol><li> ASPIRAテhPSCsで6ウェルプレートの1コンフルエントウェルから培地および（0.22μmのフィルターで濾過滅菌したDMEM / F12中2 mg / mlの）予め温めておいたディスパーゼII溶液1.5mlを追加します。コロニーの縁部が表面から持ち上げ始めるまで37℃、5％CO 2で5~7分間インキュベートします。 </li><li>吸引しディスパーゼII溶液を、注意深く追加し、新鮮なDMEM / F12培地2mlを吸引することにより、二回コロニーを洗います。次いで、5 mlの血清ガラスピペットを使用して、細胞懸濁液を上下に数回ピペッティングすることにより（ 表2参照）新鮮な商業完全培地3mLでhPSCsを解離させます。 </li><li> （ 表2参照 ）は、市販の完全培地1.5 mlを含有する6ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液を0.5mlを加えます。インキュベーターにプレートを位置づける際に均一な細胞分布を確保するために、前後および左右に数回にプレートを攪拌。 1 37℃、5％CO 2で細胞を維持します8-24時間。 </li><li>新鮮な商業完全培養培地への次の日変化媒体（ 表2を参照）、hPSCs形態を調べます。 HPSCの形態を保持し、小さな、よく付着したコロニーで成功継代結果。 hPSCsは、日常的によくミリリットルfreshmediumあたり2.5〜3で供給され、これ以上の70〜80％以下のコンフルエンスで4-5日毎に継代する必要があります。 注：hiPSCsは、マウス胚性線維芽細胞（MEF）で維持した場合は、無フィーダー条件に転送する必要があり、効率的な分化を確実にするために導入する前に2〜3回継代しました。 </li></ol></li></ol> hPSCsからHematoendothelial Pprecursorsの3誘導（0日目、hPSCsの形質導入） <ol><li>反応媒体は、市販の完全無血清培地の1.3ミリリットルを組み合わせる調製するためには、ウイルス、ポリブレン、およびY27632 ROCK阻害剤（ 表1）（表2参照 ）：最終concentraに1.3 mlの培地に10mMのROCK阻害剤の1.3μlを添加します10μMの化、および最終濃度6 / mlのポリブレンへ。 <ol><li>細胞当たり各ウイルスの0.5〜1.0 MOI（感染の多重度）の最終濃度でウイルスの濃縮物（複数可）の適切な量を加えます。単一細胞懸濁液の準備ができるまで氷上または4℃で反応媒体を保管してください。 注：GATA1 / ETV2、GATA2 / TAL1の各ウイルスにMOIの同じ量、およびGATA2 / TAL1 / LMO2反応混合物は、分化の誘導に最適です。しかし、ETV2に対する相対GATA2のためにMOIを倍増ETV2 / GATA2形質導入された培養液で、差別化を強化します。したがって、これらの培養のために、比1：ETV2のMOIとGATA2の1 MOIのための2を推奨します（例えば、ウイルス濃縮物は、約6.8×10 7粒子/ mlと推定されている場合にETV210μlのとGATA2ウイルス濃縮物の20μlを添加6ウェルプレートの35mmのウェル中の1 ETV2 / GATA2の反応当たり0.68×10 6細胞 ）。 </li></ol></li><li>単一細胞SUSPにhPSCsを準備ension。 <ol><li> 4日目のセクション2で説明したように最後の通路以下の無フィーダー条件でhPSCsを育て、倒立顕微鏡下で細胞密度および形態を観察します。 hPSCsは、自発的な分化とシャープなエッジとの緊密なコロニーに成長し、伝達の日に〜60〜70％の密集度に到達する必要があります。 </li><li>培地を吸引、ウェルあたり市販の細胞解離試薬（ 表1）の1.5〜2ミリリットルを追加し、5-7分間、5％CO 2で37℃でインキュベートします。 </li><li>商業完全培地の等容量に細胞を収集し、細胞をカウントし、生存率を測定、ROCK阻害剤の10μMと（ 表2参照）。その後、ペレット5分間200×gで遠心分離によって細胞とは、1mlあたり3.4から5×10 6細胞の濃度にROCK阻害剤の10μMと商業完全培地中で細胞を再懸濁します。 注：細胞の生存率は、成功したウイルス形質導入およびその後の分化に重要です。一般的に、導入前の細胞の生存率は90％を超えている必要があります。 </li></ol></li><li> 3.1で調製した反応媒体の1.3ミリリットルに、0.68から1×10 6個の細胞を含む、200μlの細胞懸濁液を追加します。 </li><li> 、2.2で調製した一晩コーティングした6ウェルプレートのマトリックス溶液を吸引し、6ウェルプレートの1ウェルに、反応混合物を転送し、細胞を均一に分配します。 24時間、5％CO 2で37℃でインキュベートします。 24時間後、細胞の少なくとも80％がマトリックスに付着する必要があります。 </li></ol> hPSCsからHematoendothelial前駆体の4誘導（日1-7） <ol><li> 24時間の形質導入後、ウイルス含有培地を除去し、商用の不完全な細胞培養培地で付着した細胞を洗浄した（表1を参照）、造血サイトカインを含有する市販の不完全な細胞培養培地のウェルあたり3 mlを加え：SCF 100ng / mlの、TPOを50 ng / mlで、bFGFを（以下、3F媒体と呼ぶ）20 ng / mlで。 </li><li>死細胞および破片を除去するために、日2、3、4日目に新鮮な3F-培地で培地全体を交換してください。浮動造血細胞が出現しているときに4 mlの総容量を維持しつつ、4日後、一日おきに3F-培地の半分を交換してください。 注：PSIN-EF1αレンチウイルス発現プラスミドにより形質導入された細胞の正の選択を可能にピューロマイシン耐性遺伝子を組み込んでいます。ピューロマイシンを1μg/ mlの任意の残留未分化hPSCsを除去するために、分化の最初の1~2日の間に培地に添加することができます。 </li><li>倒立顕微鏡下で4日目の細胞形態を守ってください。典型的な内皮形態を有する細胞のタイトなクラスタが現れ始める（ 図2A、3A）。一部の地域ではhPSCsの形態を保持することができる一方でラウンド血液細胞は、分化の7日目に、5日目から表示されます。以下に説明するように、彼と造血分化を分析します。 注：成功hematoendothelial異なりますiationは緩く、基礎となるフラット内皮細胞に付着したとして屈折丸い細胞を表示された血液細胞の産生をもたらします。これらの細胞は、積極的に小さな凝集体を形成し増殖し、最終的に切り離し、フロート（ 図2Aおよび3A）。生血液細胞は、光を反射し、培養条件に拡張する能力に基づいて、死んだと死細胞から視覚的に区別することができます。 </li></ol> 5.分化の造血内皮（HE）ステージの分析。 <ol><li>内皮形態を有する細胞の顕微鏡観察により分化の3日目と4の間にHEの形成を検出します。分化のこの段階での文化には、浮遊血球はありません。 HEの存在は、免疫染色によって確認し、VE-カドヘリン、CD73、CD226、およびCD43抗体を用いたフローサイトメトリー分析することができます。 <ol><li> 3日目にフローサイトメトリー分析用細胞によるHE形成を評価するために一つの実験から4日目。 37℃で5〜10分間（ 表1参照）の商業的細胞解離試薬と培養液をインキュベートすることによって細胞を集め、5％CO 2、次いで（に記載の染色手順フローサイトメトリー染色反応あたり1×10 5個の細胞まで使用12）。 注：VEカドヘリン+ HE細胞は初期造血マーカーCD226の発現を獲得するが、CD73とCD43 6の発現を欠きます。対照的に、非HE細胞は、CD73（ 図2B、3B）を発現します 。 </li></ol></li><li> HPSC由来のHEのための免疫蛍光染色。 <ol><li>リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で細胞の付着した単層を洗浄した後、室温で30〜60分間の4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定します。 </li><li> PBSで再び細胞を洗浄し、次いで、室温で20分間PBS中0.1％トリトンX-100を用いて透過性。 </li><li> 3回、PBS 2で細胞を洗浄し、その後でインキュベート30〜120分間、10％ウシ胎児血清（FBS）を含むPBSからなるブロッキング緩衝液。 </li><li>一次抗体の両方を含む、染色溶液を調製する（1：1,000希釈）、マウス抗ヒトCD43およびウサギ抗ヒトVE-カドヘリンをPBS中の5％FBS、（ 表1）を用いて。 </li><li>細胞からブロッキング緩衝液を吸引除去して、コメントを追加一次抗体で染色バッファーのウェルあたり1ミリリットルを追加します。室温で3時間、または一晩4℃でインキュベートします。 </li><li> 5％FBSを含む2mlのPBSを加えることによって、細胞を3回洗浄します。 </li><li> 5％FBSを含むPBS中で500倍に希釈：ロバ緑色蛍光色素と結合した抗ウサギ、および赤色蛍光色素（ 表1）と結合した抗マウス1で二次抗体を含有する、第二の染色緩衝液を準備します。二次染色バッファーウェルあたり1 mlを加え、室温で1時間インキュベートします。 </li><li>血清を含まないPBSで3回洗浄します。 dHで300 nmのDAPI作業溶液で染色細胞10〜15分間2 O。 </li><li> PBSで2回細胞を洗浄し、染色された細胞をウェルにPBSを2〜3mlのを追加します。緑、赤、青の顕微鏡フィルターで蛍光を観察します。 </li></ol></li></ol>誘導性造血前駆細胞の6分析<ol><li> 3.1で説明したように、浮遊細胞は、3F-培地の半分を変更し、10〜14日まで、大幅に拡大されるまで2日ごとに、分化培養を維持します。 </li><li> 37℃で5〜10分間（ 表1参照）解離および商業細胞解離試薬で細胞を処理することにより、細胞の単層を分化収集 °C、5％CO 2。 </li><li>文化12で造血を評価するために、抗VEカドヘリン、CD43およびCD45抗体を用いたフローサイトメトリーを実行します。アップETV2とGATA2形質導入した細胞の40％への細胞の大部分は、同時発現するが、VE-CADこととCD43に注意してください。以下の抗体は、E以下の特定の細胞系統を検出するために使用され得ますxpansionまたは誘導された血液前駆細胞の分化：CD235a（赤血球細胞）、CD41a（巨核球）、CD32（骨髄細胞のすべてのタイプ）、CD66b（好中球）およびCD163（マクロファージ）。 </li><li>製造業者の指示に従ってコマーシャルクローン原性培地（ 表1）を用いて、CFCアッセイを行います。 <ol><li>商業クローン原性培地3ml中に1〜2×10 4個の細胞を移すコロニー形成細胞及び造血コロニーの種類の数を評価する（ 表3参照）。最適な播種密度は、互いに別々に成長し、重複しない単一コロニーの同定および単離を可能にします。播種密度は、分化効率に応じて実験間で異なるが、商業クローン原性培地1mlあたり1×10 4個の細胞を超えてはなりません。 </li><li>穏やかにボルテックスにより商業クローン原性培地中の細胞を混合し、2つの35ミリメートルの超低接着ディッシュにサスペンションの3ミリリットルを転送CFCアッセイのため、各皿にサスペンションの1.5ミリリットル。均一媒体を配布し、14日間、37℃、5％CO 2でインキュベートします。料理を邪魔しないでください。 7日目、アッセイの10日目にコロニー形成を観察します。 </li><li> 14日目に、その形態に応じて、造血コロニーを同定し、カウントします。 </li></ol></li></ol>

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Cynataのための創立株主およびコンサルタントです。

TFの過剰発現によるhPSCsの造血分化のための上記の方法、それによってより最大30万血液細胞の産生を可能にする、ヒトES細胞やiPS細胞から彼と骨髄とerytho-magakaryocytic前駆細胞の生成のための迅速かつ効率的なアプローチを表し、 1個の百万多能性幹細胞10。この方法は、複数のhESCと性IPSCライン10で一貫性のある分化を示しました。 ETV2とGATA2、GATA1の要因だけでなく、GATA2およびTAL1因子による分化の間に、細胞はHE、血液産生内皮を形成し、造血遷移に内皮を受けます。 HEの形成は、通常、3日目および分化の4との間に観察されます。 HEステージが著しく、契約になっている間LMO2、TAL1の転写補助因子の添加は、GATA2およびTAL1の組み合わせに、大きく、分化のロバスト性を増加させました。 有向差異の成功転写因子によるhPSCsの化は、主に、（ⅰ）の細胞への核酸の効果的な送達、遺伝子操作以下の（ii）の細胞生存率、および細胞内の外因性転写物の（iii）の効果的な翻訳に依存。 <p...

自己再生および血液を含む三胚葉の細胞に分化するために、造血開発の機構研究のためにそれらの貴重なツールを作る、血液疾患のモデリング、薬物スクリーニングにヒト多能性幹細胞（hPSCs）のユニークな能力、毒性試験、および細胞の治療法の開発。内皮造血移行1,2を通じて造血内皮（HE）から胚進行中の血液形成するので、培養液中で彼の世代は、造血移行および造血仕様に内皮を制御する分子メカニズムを研究するために不可欠であろう。 HEの研究のための現在の方法は、造血サイトカイン3-5、および造血支持する間質細胞6,7または細胞外の2次元文化のあるhPSCsの共培養を加えた集合体でhematoendothelial分化（したEB）の誘導に基づいています行列やCytokines 8,9。これらの古典的な分化方法は、細胞表面で作用し、最終的にhematoendothelial発展を導く転写プログラムの活性化につながる分子経路のカスケードを開始する外部信号の導入に基づいています。したがって、これらのシステムでhPSCsの分化の効率は、それらの信号の効果的な誘導、核へのシグナル伝達、および特定の転写調節因子の結果として生じる活性化に依存しています。また、従来の分化培養では、彼の研究は、細胞選別を使用して、HE細胞を単離する追加の工程を必要とします。ここでは、造血転写因子の過剰発現によるHEと血液の直接誘導するための単純なプロトコルを記述します。この方法は、面倒なセルソーティングの手順を使用して、HEを単離を必要とせずに、皿および造血への遷移内皮の直接観察では、彼を効率的に誘導することができます。ヒト多能性幹細胞からのHE及び血液の形成を効率的にわずか数の転写因子（TFS）を過剰発現させることによって誘導することができます。 hPSCsから堅牢な汎骨髄造血を誘導することができるTFの最適な組み合わせは、ETV2およびGATA1またはGATA2が含まれています。対照的に、GATA2およびTAL1の組み合わせがerythromegakaryocytopoiesis 10を誘導します 。 CD73 - -徐々に初期造血マーカーCD43 7の式で定義された造血表現型を獲得HE細胞これらの因子の過剰発現を通じてhPSCsのプログラミングは、インクルードは+ CD43-CAD VEに直接hPSCsを区別します。ヒト多能性幹細胞法の直接のプログラミングのためのこのレンチウイルスベースの方法は、機構研究、造血への遷移内皮の研究、および造血開発と仕様の転写調節のために、彼と血液細胞の生成に適用されます。 Cが、urrentプロトコルは、導入遺伝子の構成的発現を使用して、血液の生産を記載し、同様の結果が変更されたmRNAの10を使用して得ることができました。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Table 1. 転写因子によるhPSCsの誘導と血行性内皮および血液細胞の分析.</p</td>></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61061</td><td>レンチウイルスベクター</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61063</td><td>レンチウイルスベクター</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61062</td><td>レンチウイルスベクター</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61062</td><td>レンチウイルスベクター</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61064</td><td>レンチウイルスベクター</td></tr><tr><td>臭化ヘキサジメトリン (ポリブレン)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>感染効率を高めるために使用される陽イオン性ポリマー</td></tr><tr><td>Y-27632 (二塩酸塩) ROCK阻害剤</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td>RHO/ROCK経路阻害剤 ROCK</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>A11105-01</td><td>細胞解離試薬</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>不完全(成長因子フリー)培地&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;mTeSR1 カスタム処方&nbsp;</td><td>WiCell研究所(ウィスコンシン州マディソン)</td><td>MCF</td><td><a name="RANGE!d12">血清を含まないmTeSR1培地(bFGFおよびTGFbなし)&nbsp;</a></td></tr><tr><td>ヒト</td><td>SCF Peprotech</td><td>300-07</td><td>プレミアムグレード</td></tr><tr><td>ヒト TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td>研究グレード</td></tr><tr><td>ヒト FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>プレミアムグレード</td></tr><tr><td>CD144 (VE-cad) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>560411</td><td>内皮マーカー (FACS)</td></tr><tr><td>CD226 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>338305</td><td>造血 (FACS)</td></tr><tr><td>CD43 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560199</td><td>造血(FACS)</td></tr><tr><td>CD73 APC</td><td>R&D Systems</td><td>FAB5795A</td><td>Endothelial Marker (FACS)</td></tr><tr><td>CD45 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>555485</td><td>Hematopoietic (FACS)</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Life Technologies</td><td>A1310</td><td>Live/Dead assay (FACS)</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>細胞固定&nbsp;</td></tr><tr><td>トリトンX-100&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>T9284-500ML&nbsp;</td><td>透過化&nbsp;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003</td><td>ウシ胎児血清</td></tr><tr><td>マウス抗ヒト CD43</td><td>BD Biosciences</td><td>551457</td><td>Pure, Primary antibody for Immunofluorescence (IF) staining</td></tr><tr><td>Rabbit anti-human VE-cadherin</td><td>BenderMedSystem</td><td>BMS158</td><td>Primary (IF)</td></tr><tr><td>Anti-rabbit Alexa Fluor 488-conjugated</td><td>JacksonResearch</td><td>715-486-152</td><td>Secondary (IF)</td></tr><tr><td>抗マウス Alexa Fluor 594-conjugated</td><td>JacksonResearch</td><td>715-516-150&nbsp;</td><td>セカンダリ (IF)</td></tr><tr><td>DAPI核酸染色</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>D1306&nbsp;</td><td>ライブ/デッドアッセイ(IF)</td></tr><tr><td>クローン培地 MethoCult H4435 濃縮</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>4435</td><td>CFC アッセイ</td></tr><tr><td>ライト染色液</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>32857</td><td>染色サイトスピン</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Table 2. hPSCs culture.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Pluripotent Stem Cells (hPSCs)&nbsp;</td><td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td><td>hESCs (WA01, WA09) human Embryonic Stem cells; iPSCs (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) 導入遺伝子フリー誘導多能性幹細胞</td><td>hPSCは自己複製し、3つの胚葉の細胞に分化することができる</td></tr><tr><td>hPSCsの培養のための完全な無血清培地&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;mTeSR1メディア&nbsp;&nbsp;</td><td>WiCell研究所(ウィスコンシン州マディソン)</td><td>M500&nbsp;</td><td>ESC/iPS細胞のフィーダーフリー培養のための成長因子を含む無血清培地&nbsp</td></tr><tr><td>マトリゲル</td><td>BDバイオサイエンス/コーニング&nbsp;</td><td></td><td>ヒトESC/iPS細胞</td></tr><tr><td>DMEM/F-12、粉末</td>のメンテナンスのための356234マトリックス&nbsp;<td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>12500-062</td><td>基礎媒体&nbsp;</td></tr><tr><td>HyClone DulbeccoのPBSの粉</td><td>Fisher Scientific</td><td>dSH30013.04</td><td>PBS</td></tr><tr><td>のDispase II、powder</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>17105-041</td><td>中立プロテアーゼ、細胞解離</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Table 3. Primers for detection of virus genomic integration.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer's Name</td><td><ストロング>フォワード(FWD)&nbsp;5フィート●>3'</td><td>リバース(回転)5 '-->3 '</td><td>Discription&nbsp;</td></tr><tr><td>pSIN EF1a Fwd</td><td>TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA</td><td>--</td><td>EF1a プロモーターシーケンス</td></tr><tr><td>GATA1 Rev</td><td>--</td><td>TCC CTG タグ GCC AGT GC&</td><td>NBSP;コーディング地域&nbsp;</td></tr><tr><td>GATA2 Rev</td><td>--</td><td>GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG</td><td>&nbsp;コーディング地域&nbsp;</td></tr><tr><td>TAL1 Rev</td><td>--</td><td>AGG CGG AGG ATC TCA TTC TT</td><td>&nbsp;コーディング地域&nbsp;</td></tr><tr><td>LMO2 Rev</td><td>--</td><td>GGC CCA GTT TGT AGT AGA GGC</td><td>&nbsp;コーディング地域&nbsp;</td></tr><tr><td>ETV2 Rev</td><td>--</td><td>GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC&nbsp;</td><td>&nbsp;コーディング地域&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ヒト多能性幹細胞における転写因子の過剰発現によって、造血内皮と血液の直接誘導

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

開発中に、造血細胞は、内皮細胞、造血内皮（HE）の専門サブセットから生じます。 in vitroでのモデルHE開発は、内皮、造血転移の機構研究および造血仕様のために不可欠です。ここでは、転写因子の異なるセットの過剰発現を介して、ヒト多能性幹細胞（hPSCs）から彼を効率的に誘導するための方法を説明します。 GATA2およびTAL1転写因子の組み合わせは赤血球と巨核球電位とHEの製造を可能にしながらETV2 GATA1およびGATA2またはTFの組み合わせが、汎骨髄電位HEを誘導するために使用されます。 GATA2およびTAL1の組み合わせにLMO2の添加は、実質的に分化を促進し、赤血球および巨核球細胞の生産を増加させます。この方法では、hPSCsからHE誘導の効率的かつ迅速な手段を提供し、内皮hematopoietiの観察を可能にします培養皿のC推移。プロトコルはhPSCsの導入手順およびHEの形質導入後の分析や血液前駆細胞を含んでいます。

転写因子の過剰発現によってhPSCsからHE及び血液誘導の概略図は、GATA1またはGATA2組合せで、図1 ETV2に示されている、TAL1 +/- LMO2の組み合わせは主にエリスロ-巨核球造血を誘導GATA2ながら、汎骨髄造血を誘導します。どちらのTFの組み合わせは直接、その後造血分化の明確なスペクトルと血液前駆細胞に変換HE細胞を誘導しました。血液への多能性状態からhPSCsの分化は、彼は平均4日かかり生産します。ラウンド血液細胞は、最初の分化の5日目まで出てきます。その後、数々の浮遊血球が表示され、培養で展開します。フローティング血液細胞の数を最大化するために、形質導入後の培養物は、10〜14日に延長することができます。所望の細胞系統は、造血サイトカインの適切な組み合わせで、低付着条件に拡張することができます。2 DEM 図ETV2およびGATA1またはGATA2のTFを使用してhPSCsからの血液の誘導をonstrates。 ETV2とGATA2を用いた形質導入後、細胞は分化の4日目までに典型的な内皮形態を獲得し、最終的には...

このプロトコルは、転写因子の強制発現を通じて、ヒト多能性幹細胞からの血行性内皮および多能性造血前駆細胞の効率的な誘導について説明しています。

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

この手順の全体的な目的は、転写因子の強制発現により、ヒト多能性幹細胞から赤血球系および骨髄系の血球細胞を生成することです。本手法は、内皮から造血への転換、ならびに造血の発達と分化の転写調節に関する研究のための、血球細胞における均質な内皮細胞の生成に適用可能です。この技術の主な利点は、ヒト多能性幹細胞から均質な内皮細胞を誘導するための効率的かつ迅速な手段を提供し、細胞培養皿内で内皮から造血への転換を観察できることです。Lin博士の研究室のリサーチアシスタントであるBruske博士が、本手順を実演します。開始前に、メーカーの指示に従ってMatrigelなどの細胞外マトリックスを希釈し、ウェルに分注して6ウェルプレートをコートしてください。プレートを37 °Cで30～60分間インキュベートし、導入培地を準備します。まず、ウイルスと細胞の推定感染多重度（MOI）が細胞1個あたりウイルス1個となるように、各導入セット用のレンチウイルス分注液を調製し、4 °Cで保持します。次に、各トランスダクションセットに対し、最終濃度が6 µg/mLとなるようにComplete Serum Free Medium for hPSC Viruses Poly Brainと、最終濃度が10 µMとなるようにROCK阻害剤 Y-27632を加え、合計容量を1.3 mLとして混合し、細胞の準備が整うまで氷上に置いておきます。最終継代から約4日後、コンフルエンスが70%に達した健康な多能性幹細胞株を使用してください。ヒト多能性幹細胞をマトリゲル（Matrigel）で維持していた場合は、トランスダクション実験の2〜3継代前にフィーダーフリー条件に移行させ、健康な多能性幹細胞培養状態であることを確認してください。自然分化が起こっていないことを確認します。HPSC培地を吸引し、6ウェルプレートの1ウェルあたりにAccutaneなどの塩濃度による剥離溶液を2 mL加え、37 °C、5% carbon dioxideで5〜7分間インキュベートします。その後、10 µMのROCKインヒビターを含む完全培地を2 mL加え、剥離した細胞を回収します。均質な細胞懸濁液を調製した後、少量を分注し、トリパンブルー排除法によって生存細胞数を計測します。次に、細胞を200 ×gで5分間遠心分離し、ペレットを10 µMのROCK阻害剤を含む完全培地で、最終濃度が3.4 × 10⁶ cells/mLとなるように再懸濁します。その後、0.68 × 10⁶ cellsを含む細胞懸濁液200 µLを、あらかじめ調製しておいた1.3 mLの導入培地それぞれに加えます。マトリックスでコーティングした6ウェルプレートを37°Cから取り出します。次に、マトリックス溶液を吸引し、各トランスダクションミックスを各ウェルに移して、プレートを揺らし、細胞をウェル内に均等に分散させます。24時間放置します。導入後、顕微鏡下でウェルを観察し、細胞の少なくとも80%が接着していることを確認します。ウイルス溶液を除去し、成長因子を含まない不完全培地で接着細胞を洗浄します。次に、3F培地と呼ばれるサイトカイン添加培地を3 mL、細胞に加えます。翌日に細胞を一晩インキュベートします。その後、1 µg/mLのピューロマイシンを含む新しいThree F mediumに培地を交換します。これにより、形質導入されなかった残存細胞を除去します。死細胞を除去するため、この培地を24時間ごとに交換します。処理開始から48時間後、ピューマイシンを中止し、4日目には新鮮なthree F mediumのみを使用します。形質導入後、顕微鏡下で細胞を観察し、内皮細胞様形態を持つ細胞のクラスターが出現したことをもって、血管内皮細胞の形成を確認します。まず、培養開始から3〜4日目の培養皿内の細胞を細胞剥離液で処理します。剥離した細胞を完全培地で回収して遠心分離し、室温でmax bufferに再懸濁してヘモサイトメーターで細胞数をカウントします。次に、染色反応1回あたり1×10⁵個の細胞を、v catrin、CD 2 26、CD 73、およびCD 43などの細胞表面マーカー検出用の適切な抗体とともにインキュベートします。フローサイトメトリーの実施方法は、4日目以降のテキストプロトコルに記載されています。導入後、各ウェルの培地の半分を48時間ごとに交換し、細胞の分化を継続させます。5日から7日の間に、円形の細胞が緩く凝集し、内皮細胞層の上に浮遊して現れます。浮遊細胞が大幅に増殖するまで、最大14日間培養を維持してください。ETV2、GATA1、およびETV2のフローサイトメトリー解析。Gata2導入細胞では、分化3〜4日目にCD226の発現とCD73の発現欠如によって同定される、terin陽性の血液内皮細胞の形成が認められます。ETV2、GATA1、およびETV2のフローサイトメトリー解析。Gata2導入細胞では、7日目にCD43を発現する血球細胞の誘導が認められます。導入後、導入から14日目のgata 2、TAL 1、LMO 2誘導細胞をフローサイトメトリーで解析したところ、CD 235 AおよびCD 41 Aを発現する血球細胞の形成が認められました。gata 2、TAL 1、LMO 2により誘導された造血細胞の染色細胞標本をコロニー形成細胞アッセイで確認したところ、赤血球系、マクロファージ系、および巨核球系の細胞形態が示されました。ヒト多能性幹細胞の導入は、導入操作の実施を含めて1時間未満で行うことが可能です。幹細胞の生存率を考慮し、反応混合液に常にROCK阻害剤を含めること、および導入後の最初の3日間は細胞あたりのウイルス量を最適化して使用することが重要です。導入後、分化効率や誘導された血液疾患のタイプに関する疑問を解消するために、免疫染色、コロニー形成アッセイ、フローサイトメトリーなどの手法を実施することができます。このビデオを視聴することで、ヒト多能性幹細胞の調整および感染方法について、また、分化培養の開始から7〜10日目までに期待される変化について、十分な理解を得ることができます。転写因子がヒト多能性幹細胞に正常に導入されると、細胞は多能性を失い、徐々に造血系へと分化します。これにより、研究者は内皮細胞から造血細胞への転換（endothelial to hematopoietic transition）の分子メカニズムを研究するための便利なin vitroモデルを利用できるようになります。レンチウイルスを含む試薬の取り扱いは極めて危険であるため、本手順を実施する際は、個人用保護具の着用やウイルス含有試薬の適切な廃棄など、常に十分な予防措置を講じてください。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

ここでは、単一のレンチウイルスベクターを用いたプログラミング末梢血の3-4...

STEMCCAレンチウイルスベクターを用いた末梢血からのヒト人工多能性幹細胞の生成

この方法は、直接末梢血細胞から濃縮造血前駆細胞からのヒト神経幹細胞を誘導するために開発された。...

末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

ここで説明するプロトコルは、転写因子の最小セットの過剰発現によるマウス胚性線維芽細胞における造血プログラムの誘導を詳述しています。この技術は、造血、血液疾患、造血幹細胞移植の将来の研究のためのプラットフォームを提供するために、人間のシステムに変換される可能性があります。...

転写因子との再プログラミングマウス胚線維芽細胞造血プログラムを誘導するために

末梢血単核細胞(PBMC)を人工多能性幹細胞(iPSC)に再プログラミングするためのプロトコルを提案します。形質導入した血液細胞をマトリックスコーティングプレートに遠心分離で播種することにより、浮遊細胞からiPS細胞を成功裏に誘導します。この技術は、PBMCやCBMCなどの細胞に対するシンプルで効果的なリプログラミングプロトコルを示唆しています。...

センダイウイルスや遠心分離を用いて血液細胞から誘導多能性幹細胞の生成

このプロトコルは、ヒトの成人末梢血細胞から統合フリーのiPS細胞を効率的に生成するための詳細な方法を説明しています。4つのoriP/EBNAベースのエピソームベクターを使用してリプログラミング因子(KLF4、MYC、BCL-XL、またはOCT4およびSOX2)を発現させることで、1...

エピソームベクトルを用いたヒト末梢血単核細胞からの統合フリー人工多能性幹細胞の生成

ここで、提示ひと多能性幹細胞 (hPSC) 培養のプロトコル、CD34 に hPSCs を区別するために使用される+造血前駆細胞。このメソッドは、排他的に決定的なまたは原始的な造血プログラムのいずれかのセルを指定するカノニカル WNT...

ひと多能性幹細胞からプリミティブかつ決定的な造血前駆細胞の分化を監督

ここで、フィーダーおよびキセノフリー状態でヒト多能性幹細胞から血原性内皮を正確に形成するプロトコルを提示する。この方法は、疾患のモデリングと治療化合物のスクリーニングに幅広い応用を持つことになります。...

フィーダーとゼノフリーの定義条件におけるヒト多能性幹細胞からの血原性内皮分化

このプロトコルは、血球性幹および前駆細胞を生成する転写因子GATA2、GFI1BおよびFOSの強制発現によるヒト皮膚線維芽細胞における血球形成プログラムの誘導を示す。...

転写因子の強制発現によるヒト線維芽細胞のヘモジェニックリプログラミング

ここに提示されるのは、約1週間でヒト多能性幹細胞から血原性内皮細胞を指向的に分化させるための簡単なプロトコルです。...

ヒト多能性幹細胞からの血原性内皮細胞の指向性分化

このプロトコルは、ヒト多能性および人工多能性幹細胞からの自己組織化血管の生成を記載する。これらの血管ネットワークは、周皮細胞、平滑筋アクチン、および連続した基底膜に囲まれた広範で接続された内皮ネットワークを示します。...

多能性幹細胞からのヒト血管オルガノイドの作製

ここでは、内皮細胞をヒト多能性幹細胞から分化させる簡単なワークフローと、それに続く機械的刺激の詳細なプロトコルについて説明します。これにより、内皮細胞の発生メカノバイオロジーの研究が可能になります。このアプローチは、機械的刺激後に培養チップから回収された生細胞のダウンストリームアッセイに適合します。...

イン・ビトロ 発生メカノバイオロジー研究のための胎児血管オンチップモデル

学ぶ ヒト多能性幹細胞から転写因子の過剰発現により造血内皮と血液細胞を効率的に誘導する方法。内皮から造血への遷移を観察し、血球発生の分子メカニズムを解明するための信頼性の高い実験系を構築できます。

ヒト多能性幹細胞における転写因子の過剰発現によって、造血内皮と血液の直接誘導

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