哺乳動物細胞におけるヒトグランザイムの高収量およびコスト効率の高い発現システム

この手順の全体的な目標は、ヒト胚性腎臓2 93 T細胞において、葉のグリコシル化および酵素活性なグランザイムを高収量で生成することです。これは、まず適切な組織培養皿でHEC 2 93 T細胞を増殖させることによって達成されます。拡大後の通常の準備サイズは、20〜25の培養皿で構成されています。

第2のステップは、効率的なリン酸カルシウム法を用いて、拡大した細胞にグランザイム発現プラスミドを一過性にトランスフェクションすることです。次に、細胞スーパーナトを回収し、分泌されたグランド酵素を固定化金属アフィニティークロマトグラフィーで精製します。最後のステップは、Enter Kinase処理によってグランド酵素を活性化し、陽イオン交換クロマトグラフィーを介してプロテアーゼをさらに精製することです。

最終的には、酵素活性は、十分な量の活性プロテアーゼの利用可能性がグランザイム研究の制限要因であるため、迅速で信頼性の高いコレメトリックアッセイを使用してテストされます。この方法は、さまざまな生物における新しい細胞死経路の特性評価や、全プロテオームアプローチにおける新規プロテアーゼ基質の同定など、この分野での重要な質問に答えるのに役立ちます。まず、20ミリリットルの培地でHEC 2 93 T細胞を増殖させ、150 x 25ミリメートルの組織培養皿を使用して、細胞を80%Coで分割し、流暢な細胞がゆるく付着しますが、プレートを厳密にピペッティングすることでトリプシンなしで機械的に取り外すことができます。

トランスフェクションの前夜の細胞は、トランスフェクションの日に60〜70%coの流暢さを与えます。通常の調理サイズは、20〜25の培養皿で構成されています。トランスフェクションの1時間前に、標準培地を20ミリリットルのトランスフェクション培地に変更し、1時間のインキュベーションステップの終わり近くで、トランスフェクションの1〜2分前に、400マイクログラムの血漿DNAを10.95ミリリットルの二重蒸留水と1.55ミリリットルの2モル塩化カルシウムを50ミリリットルのチューブに混合しました。

12.5ミリリットルの2つのxヒープで、30秒間インキュベートする前に、チューブの反転によって混合されたDNAカルシウム溶液の12.5ミリリットルに生理食塩水を緩衝した。室温で、この混合物を皿あたり5ミリリットルで細胞に直接滴下し、全領域に均等に振りかけ、培地をわずかにオレンジ色に変えます。培養皿を組織培養インキュベーターで7〜11時間インキュベートします。

インキュベーション後、細かい沈殿物が見えます。トランスフェクション培地を取り出します。予熱PBSで慎重にすすぎ、20ミリリットルの無血清培地を加えてから、組織培養インキュベーターで72時間インキュベートし、SDSページで細胞上清のサンプルを流し、kumasiで染色することにより、トランスフェクションと発現効率を分析します。

鮮やかなブルー。グランザイムバンドを視覚化する。インキュベーションデカント後、細胞培養上清を250ミリリットルのチューブに分離し、遠心分離により透明化します。

分離した細胞から培地をクリアする最初のスピンを実行します。上清を新鮮な250ミリリットルのチューブに移し、摂氏4度で30分間4, 000Gで回転させて、残っている細胞の破片を取り除きます。次に、5ミリリットルの塩化ナトリウム、6.25ミリリットルのトリスベース、1ミリリットルの硫酸ニッケル、さらに250ミリリットルの透明な上澄み液を追加します。

500ミリリットルの真空フィルターユニットを使用して上清をろ過します。ニッケル固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィーカラムを彼の結合バッファーと平衡化します。A 適切なFPLCシステムを使用しています。

次に、清澄化した上清を平衡化したカラムに、摂氏4度で毎分0.5ミリリットルの流量で塗布します。上清を塗布した後、紫外線または紫外線吸収性のベースラインに達するまで、カラムを結合バッファーで洗浄します。線形の20ミリリットルのILEグラジエントで、毎分0.5ミリリットルの流量でグランザイムを溶出し、2ミリリットルのフラクションを収集します。

SDSページとkumasi染色によりelucianフラクションを解析します。ぼんやりとしたチューブにフラクションが入ったグランドザイムを引き抜きます。少量のサンプルを摂氏マイナス20度で保存し、プレエンテロキナーゼコントロールとして保存します。

初期上清50ミリリットルあたり0.02単位のエンテロキナーゼを透析チューブ内のプール画分に直接追加し、エンテロキナーゼ緩衝液で室温で一晩透析します。翌日、SDSページとkumasiブルー染色により、プレエンターキナーゼコントロールと比較して、グランドに処理したキナーゼを分析します。エンド端末処理が完了したとき。

透析バッファーをSバッファーAに変更し、室温でさらに4時間透析してから、DIALATE eightをろ過します。次に、SカラムをSバッファーで平衡化します。A.サンプルロード後、4°Cで毎分0.5ミリリットルの流量でサンプルをカラムにロードします。

UV吸収剤のベースラインに達するまで、カラムをSバッファーAで洗浄します。30ミリリットルの直鎖状塩化ナトリウムグラジエントでグランザイムを溶出させると、グランザイムAは約650ミリモルの塩化ナトリウム、グランザイムBは約700ミリモルの塩化ナトリウムナトリウム、グランザイムMは約750ミリモルの塩化ナトリウムで溶出します。グランザイムを含む画分をプールし、スピンフィルターで約100マイクロモルに濃縮し、濃縮されたグランザイム製剤を分注し、摂氏マイナス80度で保存します。

次に、SDSページとchole metric assaysによりelucian画分を解析し、ellucian画分または濃縮ストックからsmall granzyme samplesを96に分配するchole metric assaysを実行します。ウェルフラットボトムプレートには、ポジティブコントロールとネガティブコントロールがあります。それぞれに100マイクロリットルのアッセイバッファーを加えます。

プレートを摂氏37度で10分間よくインキュベートします。最後に、マイクロプレートリーダーで405ナノメートルの光学密度を測定します。このプロトコルは、SカラムからのグランザイムBEを示すこの代表的なkumasi染色SDSページゲルで示されているように、純粋なグランザイムを高収率で生成します。

組換えグランザイムは、組換えグランザイムB活性を比較するこのカラーメトリックアッセイで示されているように、未変性プロテアーゼ調製物と同様の活性を示します。重要なことに、endo H治療は、HEC 2 93 T細胞で産生されたグランザイムが完全にグリコシル化されていることを示しています。組換え大酵素は、この代表的なグランザイム、細菌タンパク質基質およびUOCDを用いた切断アッセイで示されているように、高分子タンパク質基質を切断することができる。

ここでは、切断されたN-O-U-C-Dを表すバンドは、グランザイム濃度の増加とともにゆっくりと消えます。このビデオを見れば、HK 2 93 T細胞で高収率で完全グリコシル化およびプロアクティブグランド酵素を産生する方法を十分に理解できるはずです。