Name: 哺乳動物細胞におけるヒトグランザイムの高収量およびコスト効率の高い発現システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: 学ぶ HEK293T細胞を用いたヒトグランザイムの高収量・低コスト発現システム。完全糖鎖修飾と酵素活性を持つプロテアーゼを効率的に産生し、免疫応答研究や治薬開発への応用が可能です。

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この作業は、ノバルティス医学生物学研究財団およびフリブール大学の研究プールからの助成金によって支援されました（MWへ。技術サポートをいただいたLi Zhao氏、Zhan Xu氏、Solange Kharoubi Hess氏、pHLsecプラスミドを提供してくださったRadu Aricescu氏、英国オックスフォード大学、Thomas Schürpf氏(ハーバード大学医学部)に感謝します。

発現プラスミドpHLsec-Gzm 1.生産<ol><li>適切なRNA単離法を用いて、ヒトNK細胞（一次細胞は、すべての5人のGzmsを発現するNK-92 26またはNK細胞株のように調製した）からの総RNAを調製し、第一鎖cDNAを合成しキットを用いての逆転写反応、manufacturer`以下の提言。 23（ラドゥAricescuとイヴォンヌ·ジョーンズの種類のギフト、オックスフォード、英国の大学）に記載されているように（ 図1）をAgeI及びKpnI部位を使用してpHLsecにPCRおよびクローンを使用してGzm cDNAを増幅。 注： 表1に示し、以下のプライマーを使用してください。 </li><li>配列決定によって正しい挿入を確認してください。 DH5α細胞中で発現プラスミドを展開し、エンドトキシンフリープラスミド単離キットを用いて精製し、製造者の指示に従ってください。 </li><li>を2mg / mlの濃度でエンドトキシンフリー滅菌水で精製したプラスミドを再懸濁し、店で-20°C untiL使用。 </li></ol> HEK293T細胞におけるGzmsの2式<ol><li>試薬の調製<ol><li>標準的な培養培地を準備します。ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を含有する高グルコース（25ミリモル）、グルタマックス（4ミリモル）に、ピルビン酸ナトリウム（1mM）を（標準のウシ胎児血清（FCS）、ペニシリン（100単位/ ml）、ストレプトマイシンの10％を加えます100μg/ mlの）。 </li><li>トランスフェクション培地を準備します。ペニシリン - ストレプトマイシンを含まない培地に25 / mlのクロロキン（-20℃で保存し、PBSで1,000倍の株式、からトランスフェクションの日に、新たに追加）を追加します。 </li><li>無血清培地を準備します。無血清培地にHEK293細胞は、グルタミン（4 mM）の、ペニシリン（100単位/ ml）、ストレプトマイシン（100μg/ mlの）、および2.5mgの/ LのアンホテリシンBを追加するため</li><li> 表2に記載されたソリューションを用意し、使用前に0.45μmのフィルターでフィルター： </li></ol></li><li> HEK293T細胞を拡大<ol><li> 20ミリリットルカルトにHEK293T細胞を成長させます150×25 mm組織培養皿を用いてURE媒体。 </li><li> 80％の密集度で分割細胞（1のスプリット比：4、通常3日毎）。細胞が緩く取り付け、それらは機械的に厳密に上下にピペッティングによりトリプシン処理せずに取り外すことができます。 </li><li>プレートの細胞は、トランスフェクション前日に、トランスフェクション（播種密度約2×10 5細胞/ ml）の日に60〜70％の集密度を得ました。通常の準備のサイズは20〜25培養皿で構成されています。 </li></ol></li><li>リン酸カルシウムトランスフェクション<ol><li>トランスフェクションの1時間前には、20ミリリットルのトランスフェクション培地に標準的な培養培地を変更します。この1時間のインキュベーション工程の終わり近く、10.95ミリリットルののddH 2 0〜50 mlチューブ中2MのCaCl 2の1.55ミリリットル（1チューブ/ 5皿）でプラスミドDNA400μgのを混ぜます。 </li><li>トランスフェクションの前に1〜2分、DNA-カルシウム溶液12.5 mlに2×HBS 12.5ミリリットルを加え、チューブの反転により混合し、室温で30秒間インキュベートします。 </li><li>目を追加します。Eの混合物を滴下培地中に、細胞（皿当たり5ミリリットル）に直接2.3.2に用意しました。ややオレンジ色に培地を回し、全領域に均等に振りかけます。 </li><li>組織培養インキュベーター（37℃、加湿空気中5％CO 2）で7から11時間、培養皿をインキュベートします。インキュベーション後、微細な沈殿物が見えます。予め温めておいたPBSで丁寧に洗い流し、トランスフェクション培地を除去し、2.1.3で調製した20ミリリットルの無血清培地を追加します。組織培養インキュベーター中で72時間インキュベートします。 </li><li> SDS-PAGE上での細胞の上清のサンプル（〜20μl）を実行し、グランザイムバンドを可視化するために、クマシーブリリアントブルーで染色することにより、トランスフェクション及び発現効率を分析します。 </li></ol></li><li>ニッケルIMACにより培養上清からのGzmsの精製<ol><li>インキュベーション後、250ミリリットルチューブに細胞培養上清をデカントし、遠心分離により明確。最初のスピンを行う（400×gで、10分間、4°剥離した細胞からの培地をクリアしますC）。残りの細胞破片を除去し、4℃で4,000×gで、30分で新鮮な250ミリリットルチューブとスピンで上清を転送します。 </li><li> 5 M NaClを5mlの、透明な上清の250ミリリットル当たり0.25 MのNiSO 4の6.25 2 M Tris塩基（pHは8）のミリリットルと1ミリリットルを追加します。 500ミリリットル真空フィルターユニット（0.45 mm）を用いて上清をフィルタリングします。 </li><li>適切なFPLCシステムを使用して彼の結合緩衝液A（10カラム体積、CV）とニッケルIMACカラムを平衡化します。 </li><li> 4℃で0.5ml /分の流速で平衡化したカラムに透明な上清を適用します。 </li><li>上清を適用した後、UV吸光度がベースラインに達するまで、（通常、10 CV）のHis結合バッファーでカラムを洗浄します。 </li><li> 0.5ml /分の流速で20ミリリットルの線形勾配（0~250 mMイミダゾール）で溶出Gzms 2ミリリットル画分を収集しました。 SDS-PAGEおよびクーマシー染色により溶出画分を分析します。 </li></ol></li><li>エンテロキナーゼ（EK）治療および陽イオン交換クロマトグラフィーによる最終クリーンアップ<ol><li> ≤10MWCOに透析チューブ内の画分を含むプールGzm。前EK制御などの-20℃での少量のサンプルを保管してください。 </li><li>透析チューブに直接にプール画分に0.02単位/初期上清を50 mlのEKを追加して、O / N EK-バッファーで室温、（少なくとも16時間）（4 L、一度変更バッファ）を透析。 </li><li>次の日、EKは、SDS-PAGEおよびクマシー染色による事前EKコントロールと比較してGzmsを処理し分析します。 </li><li> N末端の処理が完了すると、SバッファーA（4 L）に透析緩衝液を変更して、室温でさらに4時間透析します。フィルター透析液（0.45ミクロン）。 </li><li> 4℃で0.5ml /分の流速でカラムにサンプルをロードS緩衝液AでS-カラムを平衡化します。 </li><li> UV吸光度のベースラインに達するまで、試料ローディングの後、（約10 CV）S緩衝液Aでカラムを洗浄します。 30ミリリットルの直線勾配（150〜1000 mMのNaCl）でGzmsを溶出。 GZMA E〜750mMのNaClで〜700mMのNaClおよびGzmMで〜650のNaCl、GZMBでリュート。 </li><li> SDS-PAGEおよび比色アッセイ（下記参照）による溶出画分を分析します。 Gzmsおよび濃縮物を含むプール画分（約30倍、約100μMの濃度に）スピンフィルターで（15ミリリットル、10 MWCO）。 -80℃で濃縮さGzm製剤およびストアを等分。 </li></ol></li></ol> 3.テストGzm活動<ol><li>試薬の調製<ol><li> 50mMのトリス塩基、pHは7：比色アッセイ緩​​衝液を準備します。 <ol><li> GZMAの測定のために、0.2mMの及び5,5&#39;-ジチオ - ビス（2-ニトロ安息香酸）の最終濃度までアッセイ緩​​衝液へのNa-CBZ-L-リジンをチオベンジルエステル（S-Bzlの）（BLT）を追加0.22 mMの濃度に（DTNB）。 GZMBについては、0.2 mMののBoc-ALA-ALA-ASP-S-Bzlの（AAD）および0.22 mMのDTNBを含みます。 GzmMについては、0.2 mMのあるSuc-ALA-ALA-PRO-Leuの-p-ニトロアニリド（PNA）（AAPL）が挙げられます。合成ペプチドは、DMSO中で（適切なストック溶液から追加され、STORアッセイの前に、新たにバッファに）-20°Cで編。 </li></ol></li><li>切断アッセイバッファーを準備します。100mMのNaCl、50mMのトリス塩基、pHは7.5 </li></ol></li><li>比色アッセイ<ol><li> 96ウェル平底プレート中の溶出画分または濃縮されたストックから小さなGzmサンプル（&lt;5μl）を配布します。ポジティブコントロール（試験したGzm製剤または粗製のNK細胞溶解物）および陰性コントロール（緩衝液のみ）も含めます。 </li><li> （マルチチャンネルピペットを使用して）各ウエルに、アッセイ緩​​衝液100μlを加えます。 37℃で10分間インキュベートします。マイクロプレートリーダーで405nmでODを測定します。 </li></ol></li><li>切断アッセイ<ol><li>精製された基板を使用して切断アッセイのために、タンパク質基質を共インキュベート（天然または組換え、100から400 nMの、効率的なGzm基板のいくつかの例は、このセクションの最後に結果の項でノートに示されている）の連続希釈でGzmの様々な時間のためにアッセイ緩​​衝液で（400nmで開始します）。SDS-PAGEおよびクーマシーまたは銀染色によって分析します。または特異的抗体を用いたウェスタンブロッティングによって。 </li><li>細胞溶解物を使用して切断アッセイのために、37℃で三回でエタノール/ドライアイス浴融解に凍結することによってアッセイ緩衝液と溶解1ml中10 6のHeLa細胞（または任意の利用可能な腫瘍細胞株）をサスペンド。 （4°Cで10分間15,000×gで）を、遠心分離によって細胞破片を除去。 </li><li>上記のように様々な濃度と時間でGzmsでクリアした溶解物を共インキュベートします。切断は、適切な抗体を用いたイムノブロッティングによって検出されます。 注：市販の抗体が利用可能な善意の基板のいくつかの例：GZMB 27,28によって切断入札（BH3相互作用ドメイン死アゴニスト）およびカスパーゼ3; GZMA 29によって切断され、複数の異種核リボ（hnRNPA1、A2およびU）; GzmM 30によるサイトメガロウイルスリンタンパク質71。 </li></ol></li></ol>

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<li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B-induced+mitochondrial+ROS+are+required+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+and+differentiation%22%5BJournal%5D)">Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis.</a> Cell death and differentiation. , (2014).</li>
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<li>Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+assay+that+specifically+measures+Granzyme+B+proteolytic+activity%3A+hydrolysis+of+Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419(2014).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

GZMAとGZMBの古典と広範囲に研究の役割は、孔形成タンパク質PFN 1によるそれらのサイトゾル送達後、哺乳動物細胞におけるアポトーシスの誘導です。最近、Gzmsの細胞傷害性スペクトルは、細菌9,10、ならびに特定の寄生虫11に、哺乳動物細胞から大幅に広がりました。また、GZMAとGZMBの非古典的、細胞外の機能だけでなく、様々な孤児Gzmsの生物学的意義は依然として不明瞭です。したがって、Gzmsの堅牢時間とコスト効率の高い発現および精製システムは、このプロトコルによって提供されるよう、これらの将来の研究のための大きな助けとなります。 この方法の強みは、特に、このシステムで使用される発現ベクターpHLsec 23に基づいています。このプラスミドは、 大腸菌における高コピー数を有しています大腸菌は 、効率的なDNAの生産を可能にします。そのエンハンサー/プロモーターエレメントが提供します種々の細胞株24で最も強い活性を示します。これは...

Gzmsは、CTLおよびNK細胞1の専門リソソームに局在高度に相同性セリンプロテアーゼのファミリーです。これらのキラー細胞の細胞傷害性顆粒はまた、排除2,3宛の標的細胞の認識にGzmsと同時にリリースされる膜破壊するタンパク質PFNとGNLYが含まれています。 （ - G、K、MおよびN GZMA）ヒトにおける5 Gzms（GZMA、B、H、KおよびM）、およびマウスでの10 Gzmsがあります。 GZMAとGZMBは最も豊富で広くヒトおよびマウス1で研究されています。しかし、最近の研究は、細胞死経路、ならびに健康と病気4の他、いわゆるオーファンGzmsによって媒介される追加の生物学的効果を検討し始めています。 PFN 5,6によって標的細胞に送達されたときGzmsの最もよく知られている機能は、GZMAおよびGZMBの、特に哺乳動物細胞におけるプログラム細胞死の誘導です。しかしながら、より最近の研究はまた、PFN 7,8によって独立細胞質ゾルデリバリーの、免疫調節および炎症に計り知れない影響を与えGzmsの細胞外効果を実証しました。 Gzmsの細胞質ゾルのエントリの後に効率的に殺された細胞のスペクトルはまた、最近、細菌9,10、さらには特定の寄生虫11に、哺乳動物細胞から広がりました。これらの最近の発見は、Gzmの研究者のための全く新しい分野を開きました。そのため、コスト効率、高収量哺乳動物発現系は、かなりのもの、将来の研究のための方法を容易にします。 天然ヒト、マウス、ラットGzmsが正常にCTLおよびNK細胞株12-14の顆粒画分から精製されています。しかし、我々の手で、このような精製技術の収量は0.1mg / L未満の細胞培養物（未発表の観察及び12）の範囲内です。また、パーソナルプラグインによる汚染のない単一Gzmのクロマトグラフィー分割R Gzmsおよび/ ​​または顆粒中にも存在するタンパク質は、（未発表データと12,14）に挑戦されています。組換えGzms 16は、酵母、昆虫細胞は17とでさえ、このようなHEK 293 18,19などの哺乳動物細胞において、細菌15で製造しました。のみが哺乳動物発現系は、天然の細胞毒性タンパク質と同じ翻訳後修飾を有する組換え酵素を産生する可能性を負います。翻訳後修飾は、エンドサイトーシスによる特異的な取り込みおよび標的細胞20-22内のプロテアーゼの細胞内局在に関与しています。したがって、Gzm発現のためのプラスミド骨格としてpHLsec 23（ラドゥAricescuとイヴォンヌ·ジョーンズの寄贈、オックスフォード、英国の大学）を使用することにより、我々は、高収量のタンパク質産生のための簡単な、時間とコスト効率の高いシステムを構築しましたHEK293T細胞。 pHLsecは、ニワトリΒアクチンプロモーターとCMVエンハンサーを組み合わせました。一緒に、これらの要素はdemonstraテッド種々の細胞株24最強のプロモーター活性。また、プラスミドは、ウサギΒグロビンイントロン、最適化されたKozakおよび分泌シグナル、Lysの-の6xHisタグおよびポリAシグナルが含まれています。インサートは分泌シグナル、適切なN末端 ​​ドメインを欠くタンパク質の最適な発現および分泌の効率を確保するのLys-の6xHisタグ（ 図1）との間で簡便にクローニングすることができます。 EK処理が分泌Gzmsを活性化（アクティブGzmsは、N末端で始まるようにGzmsの発現のために、我々は、エンテロキナーゼ（EK）のサイト（DDDDK）、続いて、ベクターが提供する分泌シグナルと内因性の分泌シグナル配列を置換しアミノ酸配列IIGG 25）。さらに、この方法のために有利なように、HEK293T細胞は、ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）で、低価格媒体中で急速に成長し、コスト効率の高いカルシウムリン酸トランスフェクション法に適しています。

<table><tbody><tr><td>TRIzol 試薬</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Total RNA isolation kit</td></tr><tr><td>SuperScript II Reverse Transcriptase</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>EX-CELL 293 HEK 293 Cells</td><td>Sigma</td><td>14571C用無血清培地</td><td></td></tr><tr><td>DMEM、高グルコース、GlutaMAXサプリメント、ピルビン酸</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin透析チューブ、10K MWCO</td><td>Thermo Scientific</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>Enterokinase from usvine intestine</td><td>Sigma</td><td>E4906</td><td>recombinant、&ge;20&nbsp;単位/mg タンパク質</td></tr><tr><td>HisTrap Excel 5 ml カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>17-3712-06&nbsp;</td><td>ニッケルIMAC</td></tr><tr><td>HiTrap SP HP 5 ml カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1152-01&nbsp;</td><td>Sカラム</td></tr><tr><td>N-&α;-Cbz-L-リジンチオベンジルエステル(BLT)</td><td>シグマ</td><td>C3647</td><td>GzmA基質</td></tr><tr><td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)</td><td>MP Biomedicals</td><td>2193608 _10mg</td><td>GzmB基質</td></tr><tr><td>Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-ニトロアニリド (AAPL)</td><td>Bachem</td><td></td><td>GzmM基質</td></tr><tr><td>5,5&prime;-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸) (DTNB)</td><td>Sigma</td><td>D8130</td><td>エルマン試薬</td></tr></tbody></table>

哺乳動物細胞におけるヒトグランザイムの高収量およびコスト効率の高い発現システム

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

細胞傷害性Tリンパ球(CTL)またはナチュラルキラー(NK)細胞が腫瘍細胞または細胞内病原体に感染した細胞を認識すると、標的細胞と細胞内病原体を排除するために細胞傷害性顆粒含有量を放出します。宿主細胞および細胞内病原体の死滅は、細孔形成タンパク質パーフォリン(PFN)によって宿主細胞のサイトゾルに送達され、原核生物膜破壊タンパク質グラニュリーシン(GNLY)によって細菌性病原体に送達される顆粒セリンプロテアーゼ、グランザイム(Gzms)によって引き起こされます。実験的なinvitro環境でGzmsによって媒介される標的細胞死の分子メカニズムを調べるには、活性酵素を大量に生産するタンパク質発現および精製システムが必要です。哺乳類の分泌タンパク質発現系は、グリコシル化などの翻訳後修飾を持つ、正しく折りたたまれた完全に機能するタンパク質を産生する可能性を示唆しています。したがって、ヒトGzmsを発現プラスミドpHLsecにクローニングしたHEK293T細胞の一過性トランスフェクションには、費用対効果の高いカルシウム沈殿法を使用しました。 培養上清からのGzm精製は、ベクターによって提供されるC末端ポリヒスチジンタグを使用した固定化ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって達成されました。タンパク質のN末端にエンテロキナーゼ部位を挿入することで、活性プロテアーゼの生成が可能になり、最終的に陽イオン交換クロマトグラフィーによって精製されました。このシステムは、高レベルの細胞傷害性ヒトGzm A、B、およびMを産生することによってテストされており、人体内のほぼすべての酵素を高収率で産生できるはずです。

次のセクションでは、この方法を照明するGZMA準備の完全なドキュメントを紹介します。また、正常に精製効率および活性に関して同様の結果を生成する、GZMBとGzmMを精製しました。しかし、それらの後に調製物から、我々は、データの選択したいくつかの作品が表示されます。現在のプロトコルに従って293T細胞からGZMB調製物は、様々な生物学的ア ​​ッセイ系9,29,31-34でそれらの活性を強調し、いくつかの公表された研究に使用しました。 典型的GZMA精製は、図2Aに示されています。 GZMAの下で〜34分の60キロダルトン、72時間は、還元条件下で培養上清GZMBとGzmM用（〜37 kDaでさらに濃縮することなく、クーマシー染色SDS-PAGEゲル上で検出可能Gzmバンドで表示した後の効率的なトランスフェクションおよび発現非還元/）の条件を減らします。 IMAC精製の後、サンプルは、入力を処理しましたokinase（EK）。 EKの可視シフト前EK対照と比較したサンプル（ポストEK）で処理が観察されました。クーマシー染色タンパ...

ここでは、HEK293T細胞を使用した費用対効果の高いグランザイム発現システムについて説明し、高収量の純粋で完全にグリコシル化され、酵素活性のあるプロテアーゼを生成します。

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

この手順の全体的な目的は、ヒト胚性腎臓 2 93 T細胞において、葉酸グリコシル化され、かつ酵素的に活性なグランザイムを高収量で産生することである。これは、まず適切な組織培養ディッシュでHEC 2 93 T細胞を拡大培養することで達成される。拡大後の通常の調製規模は、20から25枚の培養ディッシュで構成される。第2のステップは、効率的なリン酸カルシウム法を用いて、拡大培養した細胞にグランザイム発現プラスミドを一過性にトランスフェクトすることです。次に、細胞上清を回収し、分泌されたグランザイムを固定化金属アフィニティークロマトグラフィーによって精製します。最終ステップでは、エンテロキナーゼ処理によりグランザイムを活性化させ、その後、陽イオン交換クロマトグラフィーを用いてプロテアーゼをさらに精製します。最終的に、酵素活性は迅速かつ信頼性の高いコロリメトリックアッセイを用いて試験されます。十分な量の活性プロテアーゼの確保がグランザイム研究における制限要因となるためです。この手法は、異なる生物における新しい細胞死経路の特性評価や、ホールプロテオームアプローチによる新規プロテアーゼ基質の同定など、この分野における重要な疑問への回答に役立ちます。グランザイムを発現させるには、まずHEC 2 93 T細胞を150 × 25 mmの組織培養ディッシュを用い、20 mLの培地で培養します。細胞が80%コンフルエントに達した時点で継代します。細胞は緩く付着していますが、トリプシンを用いず、ピペッティングで激しく上下に混ぜることで機械的に剥離させることができます。トランスフェクション当日に60〜70%のコンフルエンスになるよう、前夜に細胞を播種します。通常の準備規模は、培養皿20〜25枚分です。トランスフェクションの1時間前に、標準的な培養培地を20 mLのトランスフェクション用培地に交換します。1時間のインキュベーションステップの終了近くに、400 µgのプラスミドDNAを10.95 mLの2回蒸留水および1.55 mLの2 M塩化カルシウムと50 mLチューブ内で混合します。この操作はトランスフェクションの1〜2分前に行います。2x HEPES緩衝生理食塩水 12.5 mLをDNAカルシウム溶液 12.5 mLに加え、チューブを転倒混和した後、30秒間静置します。室温で、この混合液を1ディッシュあたり5 mLずつ細胞に直接滴下し、培地がわずかにオレンジ色になるまで全体に均一に散布します。その後、培養ディッシュを組織培養インキュベーター内で7〜11時間インキュベートします。インキュベーション後、微細な沈殿が確認できます。トランスフェクション培地を除去します。あらかじめ温めておいたPBSで丁寧に洗浄し、20 millilitersの無血清培養培地を加えて、組織培養インキュベーターで72時間インキュベートします。その後、細胞上清のサンプルをSDS pageに供し、クマシーで染色することで、トランスフェクション効率および発現効率を解析します。ブリリアントブルー。グランザイムのバンドを可視化するために使用します。インキュベーション後、細胞培養上清を250 mLチューブに分注し、遠心分離によって清澄化します。まず、遠心分離を行い、遊離した細胞から培地を除去します。上清を新しい250 mLチューブに移し、4°Cで30分間、4,000 Gsで遠心分離して、残存する細胞残渣を除去します。次に、塩化ナトリウム5 mL、Tris base 6.25 mL、および硫酸ニッケル1 mLを、精製した上清250 mLに加えます。500 mLの真空フィルターユニットを用いて上清をろ過します。適切なFPLCシステムを使用し、ニッケル固定化金属親和性クロマトグラフィーカラムをhis結合バッファーで平衡化します。次に、清澄化した上清を、4 °Cで0.5 milliliters per minuteの流速で平衡化したカラムに適用します。上清の適用後、紫外線（UV）吸収のベースラインに達するまで、his binding bufferでカラムを洗浄します。2 milliliterずつ分画しながら、0.5 milliliters per minuteの流速で、20 milliliterの線形ILEグラジエントを用いてグランザイムを溶出させます。SDS-PAGEおよびクマシー染色により溶出画分を分析します。グランザイムを含む画分を遠心チューブに回収してください。プレエンテロキナーゼコントロールとして、少量のサンプルを-20 °Cで保存します。透析チューブ内のプールした分画に、初期上清50 millilitersあたり0.02 unitsのエンテロキナーゼを直接加え、エンテロキナーゼバッファー中で室温にて一晩透析する。翌日、SDS-PAGEおよびクマシーブルー染色により、キナーゼ処理したサンプルをエンテロキナーゼ処理前のコントロールと比較分析する。これにより、C末端のプロセシングが完了する。透析バッファーをSバッファーAに変更し、室温でさらに4時間透析した後、透析液をろ過します。次に、SカラムをSバッファーAで平衡化します。サンプル充填後、4°Cで0.5 mL/minの流速でサンプルをカラムにロードします。UV吸収のベースラインに達するまで、カラムをSバッファーAで洗浄します。30 mLの塩化ナトリウム線形勾配を用いてグランザイムを溶出させます。グランザイムAは約650 mMの塩化ナトリウムで、グランザイムBは約700 mMの塩化ナトリウムで、そしてグランザイムMは約750 mMの塩化ナトリウムで溶出します。グランザイムを含む画分を回収し、スピンフィルターを用いて約100 µMまで濃縮します。濃縮したグランザイム調製液を分注し、-80 °Cで保存します。次に、溶出分画をSDS-PAGEおよびコロリメトリーアッセイで分析します。コロリメトリーアッセイを行うには、溶出分画または濃縮ストックから少量のグランザイム試料を96ウェル平底プレートに分注します。陽性対照と陰性対照も含めてください。それぞれに100 µLのアッセイバッファーを加えます。プレートを37 °Cで10分間インキュベートします。最後に、マイクロプレートリーダーを用いて405 nmにおける吸光度を測定します。このプロトコルにより、純度の高いグランザイムを高収量で得ることができ、それはSカラムのgranzyme BEを示すこの代表的なクマシ染色のSDS-PAGEゲルで実証されています。リコンビナントグランザイムは、リコンビナントおよび天然のグランザイムBの活性を比較したこの比色アッセイに示されるように、天然のプロテアーゼ調製物と同様の活性を示します。重要な点として、Endo H処理により、HEC 2 93 T細胞で産生されたグランザイムが完全に糖鎖付加されていることが示されました。リコンビナントグランザイムは、細菌タンパク質基質およびUOCDを用いたこの代表的なグランザイムA切断アッセイで実証されているように、高分子タンパク質基質を切断する能力を備えています。ここでは、granzymeの濃度が高くなるにつれて、切断されたN-O-U-C-Dを示すバンドが徐々に消失していきます。このビデオを視聴することで、HEK 293T細胞において、完全な糖鎖付加を受けたプロ活性型granzymeを高収率で産生する方法を十分に理解できるはずです。

a-high-yield-cost-efficient-expression-system-human-granzymes

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ポストヒトゲノム時代において、ネイティブコンフォメーションにおける組換えタンパク質の可用性は、構造、機能および治療の研究開発に不可欠である。ここでは、テストと組換えタンパク質のさまざまなを生成するために使用することができるヒト胚性腎臓293T細胞における大規模タンパク質発現系を記述します。...

ヒト細胞から分泌タンパク質の生産のための便利で一般式プラットフォーム

哺乳類システムによる組換えタンパク質の発現は、構造生物学のためのタンパク質複合体を生成するための魅力的な方法になりつつあります。ここでは、浮遊増殖した哺乳類細胞を使用して構造研究のためのタンパク質複合体を精製する、シンプルでありながら高効率な発現システムを紹介します。...

HEK 293F懸濁細胞における構造生物学のための組換えタンパク質の発現：小説とアクセアプローチ

ヒト、マウス、またはラットのグランザイムB（GzmB）のタンパク質分解活性を特異的に測定する、単純で定量的な比色分析法について説明します。このプロトコールは、適切な認識配列を持つ他の合成ペプチド基質の加水分解により、他の顆粒セリンプロテアーゼのプロテアーゼ活性を測定するために容易に適合させることができます。...

のBoc-ALA-ALA-Aspを-S-Bzlのの加水分解：具体的にグランザイムBタンパク質分解活性を測定する比色アッセイ

この研究では、異なる生産プラットフォームにおける標的ヒト組換えタンパク質の発現が比較されました。私たちは、従来の発酵槽ベースの培養物と植物に焦点を当て、各システムのセットアップを説明し、報告された結果に基づいて、各プラットフォームに固有の制限と利点を強調しました。...

細菌、昆虫細胞およびプラントシステムズ：異なるバイオファクトリーでの組換えタンパク質発現の比較分析

セルベースの​​システムにおけるマラリアのタンパク質の発現は、依然として厳しいです。我々は、HeLa細胞からマラリアrhoptry組換えタンパク質を発現するための2つのステップと、一段階IVT（ インビトロ翻訳 ）無細胞発現系を示します。我々はrhoptryタンパク質を精製するのNi-樹脂親和性に基づく精製システムを使用しています。...

の発現のためのHeLaベースの無細胞発現系<em&gt;マラリア原虫</em&gt; Rhoptryタンパク質

これは、分泌されたグリコシル化された哺乳類タンパク質の生産と、その後のX線結晶構造解析やその他の生物物理学的研究のための十分な収量の均質なタンパク質のシングルステップ精製のための迅速で費用対効果の高いプロトコルです。...

効率的な哺乳動物細胞発現および結晶化のための細胞外糖タンパク質のシングルステップの精製

適切な翻訳後修飾を伴う真核生物タンパク質の実験室規模での生産は、大きな障壁を表しています。ここでは、哺乳類の発現システムを使用したタンパク質発現の迅速な確立とターンアラウンドを実現する堅牢なプロトコールをご紹介します。このシステムは、選択的アミノ酸、タンパク質の選択的標識、および糖鎖組成の低分子モジュレーターをサポートします。...

懸濁液中のHEK293細胞の一過性トランスフェクションによる組換えヒトタンパ​​ク質のハイ・イールド式

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哺乳類 Bestrophin イオン チャネルの発現と精製

HEK293細胞における完全長ヒトハンチンチンタンパク質変異体のコンストラクトデザイン、一過性トランスフェクション、発現および精製をカバーするスケーラブルなプロトコルを提供しています。...

一過性発現システムを用いた哺乳類細胞における完全長ヒトハンチンチン変異体の効率的かつスケーラブルな生産

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アフィニティークロマトグラフィーを用いたヒトマトリックスメタロプロテイナーゼ-3の細菌発現と精製

ヒト膜トランスポーターの構造的および生化学的研究には、安定で無傷の均質なタンパク質がミリグラム単位で必要です。ここでは、コドン最適化遺伝子を用いてヒト溶質キャリアトランスポーターをスクリーニング、発現、精製するためのスケーラブルな方法について説明します。...

構造および生化学的研究のためのヒト溶質担体のハイスループット発現および精製(英語)

学ぶ HEK293T細胞を用いたヒトグランザイムの高収量・低コスト発現システム。完全糖鎖修飾と酵素活性を持つプロテアーゼを効率的に産生し、免疫応答研究や治薬開発への応用が可能です。

哺乳動物細胞におけるヒトグランザイムの高収量およびコスト効率の高い発現システム

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