具体的な感覚細胞の相関共焦点と3次元電子顕微鏡

この手順の全体的な目標は、天然の腸組織の他の上皮細胞に散在する特定の腸感覚細胞の完全な超構造を文書化することです。これは、最初に腸から300×50ミクロンの組織セグメントを得ることによって達成されます。次に、共焦点顕微鏡を使用してセグメントの光学Zスタックが得られます。

次に、共焦点データは、シリアルブロックフェイス走査型電子顕微鏡またはSBEMを使用して組織を処理およびイメージングするためのガイドとして機能します。最後に、SBEMデータをセグメント化して、特定の腸センサーセルの超構造を3Dでレンダリングします。最終的には、相関共焦点顕微鏡法とシリアルブロックフェイススキャン。

電子顕微鏡は、特定の細胞をその天然組織に示し、その超構造を3Dで明らかにするために使用されます。この方法は、光学顕微鏡レベルでは可視化できなかった特定の細胞間相互作用など、細胞生物学分野の重要な疑問に答えるのに役立ちます。この方法を用いることにより、我々は以前に、感覚入力内分泌細胞とggl入力との間の隠れた物理的化学的関係を報告した。

マウス結腸を分離した後、テキストプロトコルに従って、それを素敵な冷たいPBSに入れ、水中で組織を間膜に沿って切り開き、組織を歯科用ワックスのシート上のPBSの数滴に移し、遠位結腸から約6つの小さな組織セグメントをメスカスを使用して移します。PBSで5%低融点のarosを準備した後、それを使用して、標準サイズのティッシュテッククライオモールドなどの小さなプラスチック容器にティッシュセグメントを埋め込み、埋め込まれたセクションを振動ブレードミクロトームに取り付け、氷冷PBSを使用してバッファートレイを充填します。次に、300ミクロンのティッシュストリップを0.8の振幅と0.04ミリメートル/秒の速度でカットします。

300ミクロンのティッシュストリップをアロスでリードし、ブレードに対して垂直にマイクロトーンに取り付けます。次に、50ミクロンの厚さでティッシュストリップをカットし、詳細についてはテキストプロトコルを参照してから、ブロックを摂氏4度のPBSに保存します。テキストプロトコルに従って共焦点顕微鏡を使用して組織ブロックをイメージングした後、組織切片を樹脂に浸潤させて埋め込みます。

PBSから組織を取り出し、0.1モルのココートバッファーを使用して、それぞれ5分間ずつ3回すすぎます。レジンが調製され、電子顕微鏡法のために組織を染色されたら、テキストプロトコルに従って、組織ブロックが埋め込まれた後、液体放出剤で硬化したスライドガラスの間に組織ブロックを挟み込み、ブロックを60°Cでさらに48時間平らに硬化させます。次に、スライドを引き離してブロックを解剖スコープで解放し、レジンに埋め込まれた組織ブロックの向きを共焦点顕微鏡写真の向きと一致させます。

目的の細胞を含む領域の同定を容易にするために、導電性エポキシを含むピンにブロックを平らに取り付け、30分間乾燥させます。次に、ブロックを表面に平らに置き、翌日摂氏60度で一晩乾燥させます。ブロックをコロイド状の銀液でコーティングします。

組織切片を平らに保ち、ブロックを直角にスライスして、シリアルブロック面と共焦点顕微鏡写真の相関を容易にします。テキストプロトコルに従って走査型電子顕微鏡法を実施した後、フィジーで0.8ガウスぼかしフィルターを使用して、SPEM画像を生のDM3形式から8ビットTIFF画像に変換します。TIFF画像をフィルタリングします。

データセットを元のサイズの 25% にスケールダウンし、TIFF スタックとして保存して、変換モードでふるいにかけた Fiji プラグインの線形スタック アライメントを使用してデータセットを処理するために必要な RAM メモリの量を最小限に抑えます。SPEM画像のスタックを整列させ、crop 3Dプラグインを使用してそれらをトリミングします。データをレンダリングするには、描画モードでサーフェス ツールを使用し、描画モードで 50 ミリ秒のコンター オプションを使用して、目的のセルを手動でセグメント化およびボリューム レンダリングします。

セルのすべてのスライスで輪郭をトレースしてレンダリングをスムーズにするか、5 つのスライスごとに輪郭をトレースしてレンダリングを高速化します。スナップショット ツールを使用して、P-Y-Y-G-F-P マウスを使用して 300 DPI 以上の解像度で最終画像をエクスポートします。ここに示すように、小腸の遠位部分のすべての腸内分泌細胞が同定され、SBEMが処理されます。

選択した組織セグメントを共焦点顕微鏡で画像化し、光学的に1ミクロン間隔でZack画像を取得しました。組織ブロックの寸法を最適化することは、共焦点データとSBEMデータの間のトポグラフィー相関にとって重要です。マウスの回腸内の腸内分泌細胞のこのボリュームレンダリングビューは、上皮細胞の下に約60ミクロン伸びた顕著な神経ポッドを示しています。

共焦点Zスタックをブロック面全体のSBEM画像と相関させることにより、A-P-Y-Y-G-F-Pマウスの遠位結腸からのブロック内で目的の細胞が同定されます。ブロックの向きをできるだけ平らに保ち、SBEMイメージの光学スライスに一致させることが重要です。細胞が同定されると、SBEMイメージングは、分泌性細胞や他の細胞小器官を同定するのに十分な高い分解能で行われます。

このビデオには、腸内分泌細胞の3Dレンダリングが含まれています。データセットには、組織の深さの 45 ミクロンにまたがる 643 枚の画像が含まれています。細胞には、分泌性のlesと微絨毛が詰まった神経ポッドが含まれています。

このビデオを見た後、特定の腸の完全な超微細構造を文書化する方法をよく理解しているはずです 感覚細胞は、目的の細胞または細胞をガイドとして使用して、天然の腸組織の他の上皮細胞に散らばっています 目的の細胞を特定し、シリアルブロック位相走査型電子顕微鏡のために組織を処理します。