Name: 具体的な感覚細胞の相関共焦点と3次元電子顕微鏡 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 学ぶ 共焦点顕微鏡と連続ブロック面走査型電子顕微鏡を組み合わせたcocem3D法により、腸管感覚細胞の超微細構造を3次元で可視化する方法。細胞間相互作用の詳細な解析に有用です。

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私たちの心からの感謝は、以下の方々に捧げます：デューク光学顕微鏡コアファシリティのサム・ジョンソン博士とベンジャミン・カールソン博士には、データ可視化ソフトウェアへの支援をいただき、ノースカロライナ州立大学の電子顕微鏡センターのヴァレリー・ラパムさんとジョン・M・マッケンジー博士には、電子顕微鏡に関するアドバイスをいただきました。 エレイン・B・ボホルケス博士の編集協力に感謝します。 著者は、DVB、SM、およびRALが実験を設計し、データを分析しました。 DVBは実験を行い、FHはデータの手動レンダリングを実行しました。 SMは、SBEMデータを取得したRenovo Neuralのディレクターです。 DVBが原稿を書き、すべての著者が最終原稿をレビューおよび編集しました。 この研究は、NIHの助成金R01DK091946とRALへの退役軍人省の助成金I01BX002230、およびDVBへのF32DK094704の支援を受けました。

全ての動物のケアと実験は、デューク大学施設内動物管理使用委員会によって承認されたプロトコルに従って行われました。 Cocem3Dは、以前に公開されたプロトコル10,11の組み合わせから茎とPyyGFPレポーターマウス12を使用して、特定の腸内分泌細胞を研究するために、ここで適用しました。この方法は、商業的に容易に入手可能なトランスジェニックレポーターマウスを用いて、関心のある他のセルに適用することができます。相関、共焦点顕微鏡、シリアルブロック面を走査型電子顕微鏡（SBEM）、及び3Dのレンダリングデータ：この方法は、3つのセクションに記載されています。 相関共焦点顕微鏡このセクションの目的は、相関、共焦点とSBEMイメージングを可能にする寸法の遠位結腸からの組織セグメントを収穫することです。次のようにプロトコルは次のとおりです。 1.収穫組織<ol><li>準備しますPBS中の50μg/ mlのヘパリン溶液10ml。 </li><li>ケタミンの10ミリリットル（100 mg / mlの）とキシラジンの1ミリリットル（20 mg / mlの）を混合することにより、キシラジン/ケタミン麻酔在庫を準備します。 <ol><li> 0.1MのPBSで4：1をキシラジン/ケタミンの株式を希釈します。 </li></ol></li><li> PBS中の4％パラホルムアルデヒドおよび0.1％グルタルアルデヒドを含む固定剤溶液100mlを準備します。 </li><li>キシラジン/ケタミン麻酔薬の致死量で6〜10週齢PyyGFPマウスを、麻酔。マウス体重の20グラム当たり0.15ミリリットルで腹腔内麻酔薬を注入します。 </li><li>尾や足の指をつまんで、適切なマウスの麻酔を確認し、乾燥を防ぐために、目に軟膏を使用しています。 </li><li>心臓内固定剤10を灌流する可変流量蠕動ポンプを使用してください。外科用ハサミ（12センチの長さ）を使用する腸、心臓、および肺を露出させるために腹腔を開き切りました。狭パターン湾曲鉗子（13センチ長）との心を持ち、蠕動ポンプから翼状針（19 G）を挿入し、I左心室NTO。すぐに、春ストレートはさみ（長さ4ミリメートル）と右心房をカット。 1分間のヘパリン溶液で最初に2ml /分の速度で灌流し、その後15分間氷冷固定液溶液でマウスの尾が完全に剛性になるまで。 注：これは、腸粘膜に小血管の破裂を防ぐために遅い速度で灌流するために非常に重要です。血管の破裂は、組織の超微細構造を損なうことになります。灌流が適切である場合、肝臓は3〜5分以内に色が淡い有効にしてください。 </li><li>小さなハサミを使用して腹腔を開き、遠位直腸に盲腸との接合部から結腸全体を切除。氷冷PBSで組織を配置します。 PBSに沈めながら、小さな春のはさみで腸間膜に沿ってコロンを切り開い。 </li></ol> 2.組織セグメントを解剖し、固定<ol><li>メスを使用して、遠位結腸から約6小さな組織セグメント（2 平方ミリメートル） で切断しました。シートO上でこれを行いますF歯科用ワックス及びPBSの数滴中に沈め。 </li><li> 4℃で3時間固定液中で組織セグメントをポスト修正。 </li></ol> 3.マイクロ解剖組織ブロック<ol><li> PBS中の5％低融点アガロースを調製し、45℃の水浴中に保ちます。 </li><li>標準サイズのティッシュテックCryomoldように、小さなプラスチック容器を使用して、5％の低融点アガロースで組織セグメントを埋め込みます。 </li><li>振動刃ミクロトームに包埋切片をマウントし、氷冷PBSでバッファトレイを埋めます。 </li><li> 0.8振幅と0.04ミリメートル/秒の速度で300μmの組織片をカットします。注：この時点で、組織片をアガロースから除去されます。 </li><li>アガロースで300μmの組織片を再埋め込み、ビブラトームのブレードに垂直にミクロトームにマウント。 </li><li>ビブラトームを用いて、50μmの厚さで組織片を切断します。注：最終的な組織ブロックは、約300μm幅×50μ​​mの厚さでなければなりません。これらのDimensionsは、腸内分泌細胞の厚さは15〜20ミクロンとneuropodの長さ30〜70 nmの間であることが示されたパイロット共焦点実験から最適化されています。電池の向きが組織ブロックの表面に平行である場合にはそのため、セル全体は、厚さ50μm、幅300μmの組織のブロック内に含まれる可能性があります。目的の組織および細胞タイプに応じて、これらの寸法を変え。 </li><li> 4℃でPBS中の組織ブロックを格納します。 </li></ol> 4.共焦点イメージング<ol><li> 4,000：1でPBSにDAPIを希釈することにより核染色溶液を調製します。 </li><li> 5分間、DAPI核染色で組織ブロックをインキュベートします。注：DAPI染色は、共焦点とSBEM画像を相関させるために有用であるそれらの核によって区別個々の細胞を容易にします。 </li><li>帯電したスライドガラス上にマウント組織ブロックは、PBSを数滴を追加し、カバースリップでそれらをカバーしています。 </li><li>共焦点顕微鏡を使用して、ブロックを識別する興味のある無傷の絨毛およびPyyGFP細胞とSとzスタックに光学切片を得るためにそれらを画像化しました。 <ol><li> 1μmの光学切片のzスタックを取得するために20X / 0.8ツァイスプランアポクロマート対物レンズを使用してください。 </li><li> zスタックのために細胞の位置を決定するために、対象の細胞、および微分干渉コントラスト（DIC）を局在化するために、他のセルとの関係を決定するために488nmの内在性GFPを405 nmで（DAPI）のためにチャネルを使用しますルーメン。 </li><li> 1024ピクセル以上の画像解像度を使用します。 </li></ol></li></ol>アガロース5.埋め込みブロック<ol><li> PBS中の4％パラホルムアルデヒドおよび2.5％グルタルアルデヒドを含む固定液の10ミリリットルを準備します。 </li><li>慎重に組織ブロックにダメージを与えることなく離れてガラススライドからカバースリップをスライドし、カバースリップの端にPBSを添加することにより、ガラススライドから組織ブロックを削除します。そして、1にスライドから組織ブロックを転送するために美術の絵筆を使用4％パラホルムアルデヒドおよび2.5％グルタルアルデヒド固定剤を含む0.5ミリリットルのマイクロチューブ。 </li><li> 4℃でのポストフィックス組織ブロックO / N。 </li><li> PBSに組織ブロックを転送します。そして、2枚のスライドガラスの間に、それらを挟んで5％低融点アガロースでフラットブロックを埋め込みます。 注：アガロースの薄層でブロックを埋め込み、染色の際に事後操作が容易になります。 </li><li>広場にアガロースをカットし、上側のハンド側に切り込みを作ります。注：このステップは、後続のステップの配向を維持する必要があります。 </li><li>さらに処理するまで4℃でPBS 1.5 mlのマイクロ遠心チューブに保管ブロック。 </li></ol>シリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡（SBEM） このセクションでは、組織ブロックは、低倍率でSBEMを用いて調製し、画像化されます。ブロック面の調査画像は、目的の細胞を含む領域を識別するために、共焦点データと相関しています。地域一回識別され、組織は7ナノメートル/ピクセルと70nmのスライスの解像度で撮像されます。これが解決し、他の細胞小器官から大高密度コア分泌小胞を区別するのに十分でした。腸内分泌細胞では、小胞のこのタイプは、直径13で100から150nmの間で変化します。次のようにプロトコルは次のとおりです。 6.染色組織切片<ol><li> PBSから組織を除去し、0.1Mカコジル酸緩衝液で3回、各5分、すすぎます。 </li><li>細胞膜14のコントラストを向上させるために0.1 Mカコジル酸緩衝液に溶解した0.1％のタンニン酸で1時間染色ブロック。 </li><li>公開されたプロトコル11に従って、その後の染色および組織の脱水を行います。 Deerinckらに続いて。プロトコルは、これらの溶液を調製する：1）1％（w / v）のthiocarbonhydrazide（THC）。 2）アスパラギン酸溶液をリード。 3）1％酢酸ウラニル、および4）オスミウムtetraoxyde /フェロシアン化カリウム（のOsO 4 / Kフェロシアン化）。 4％のOsO 4と2倍を混ぜますのOsO 4 / Kフェロシアン化を行うために1：1の比率で[10ミリリットルのH 2 OにKフェロシアン化し、0.86グラムのNaカコジル酸を0.3グラム] Kフェロシアン化ストック。注：アガロース中に包埋された組織は染色中の取り扱いを容易にしたが。慎重に、その後の樹脂の浸透のためのアガロースを除去します。 </li><li> 0.1 Mカコジル酸緩衝液中のサンプル三回、5分毎に、リンスした後、4℃で2時間、OsO4 / Kフェロシアン化溶液を用いて染色。 </li><li> 60℃でそれぞれ、超純水で5分間3回すすぎ、そして30分間TCHと染色。 </li><li> RTで60分間、2％のOsO 4（なしKフェロシアン化）と超純水で3回、それぞれ5分間および汚れを洗い流します。超純水で再び3回、各5分洗浄します。 </li><li> 4℃で1％の酢酸ウラニルO / Nで染色。超純水で3回、各5分洗浄します。 </li><li> 60℃で30分間のリードアスパラギン酸で染色。超純水で3回、各5分洗浄します。 </li><li> solutioですすぐことにより、組織を脱水エタノール濃度の増加に伴って、NS。 50％、75％、85％、95％、絶対100％エタノールで2回、各5分洗浄します。終わりに、プロピレンオキシドを用いて2回、10分毎にセクションをすすぎます。 </li></ol>樹脂7.浸潤と埋め込み組織切片<ol><li>商業avaialbleキットを用いて樹脂とブロックを潜入。エポン包埋キットを用いて樹脂に埋め込む組織。 48％のエポキシ樹脂の混合物を準備し、20％ミリリットルDDSA、30％ミリリットルNMA、および2％DMP30。 5分間激しく樹脂混合物を攪拌した後、気泡が表面に来ることができるように30分間真空中でミックスを置きます。 </li><li> 1のプロピレンオキシドと樹脂を混合：1の比率、激しく振ります。組織から最後の脱水すすぎを外し、プロピレンオキシドとの混合樹脂を追加します。回転子のO / Nでのサンプルと場所バイアルとキャップなしバイアルのままにします。次の日は、作りたてのエポン樹脂を追加し、回転装置で90分間混合します。 </li><li>それらを挟んでできるだけ平坦樹脂中に埋め込みブロック互いに15に付着するのを防止するために、液体離型剤を用いて硬化されたガラススライドの間です。 </li><li>ブロックが平坦に埋め込まれると、60℃でさらに48時間のブロックを治します。 </li><li>ブロックを解放するために離れてスライドを引き出します。 </li></ol> 8.取り付けとイメージングのための組織ブロックをトリミング<ol><li>解剖顕微鏡下で、ブロックをトリミングする前に、目的の細胞を含有する領域を同定する容易にするために、共焦点顕微鏡写真のものと樹脂に包埋組織ブロックの向きと一致しています。 </li><li>手動ダウン〜500×500μmのブロック面に樹脂包埋ブロックをトリミング。 </li><li> 30分間導電性エポキシ、乾燥を含むピンのフラットブロックをマウントします。その後、60℃で、表面上に平らにブロックを置き、乾燥O / N。 </li><li>コー​​ト銀コロイド液でブロック。 COを容易にするために、直角ブロックのスライスを確保するために、組織切片フラットを維持シリアルブロック面と共焦点顕微鏡写真をrrelating。 </li></ol> 9. SBEM <ol><li>画像SBEMシステムを備えた走査型電子顕微鏡を用いてブロック（E .G。、3View）。 </li><li>組織の顔がブロックから出てくるまで〜2μm刻み、切断時に初期厚さのセクションを設定します。 </li><li>ブロック全体の顔のsurver画像を取得。 </li><li>フィジーソフトウェアを使用して、固定および16を染色中にサンプルの反りのための共通分母とアカウントを生成するために、両方のシリアルブロック面と共焦点顕微鏡写真の測定を行います。 </li><li>共焦点画像の座標に分母を乗じてブロック面上の関心領域の位置を確認します。参考として、微絨毛、杯細胞、または固有層の位置のように、他の構造的特徴を使用してください。 </li><li>で、目的の画像領域2.25 kVの高真空モードでは7nm /ピクセル（または15,147X倍率）。スライスの増分を設定してください70nm以下で。 </li><li>生の16ビット.dm3形式でSBEMデータを収集します。 </li></ol>面分割のための10の最適化SBEM画像<ol><li> SBEMイメージは、8ビットの.TIFFに生.dm3形式から変換します。 </li><li>フィジー0.8ガウスぼかしフィルタを用いて画像を.TIFFフィルター。 </li><li>元のサイズの25％に設定されたデータを縮小してセットを処理するのに必要なRAMメモリの量を最小限にするために.TIFFスタックとして保存します。 </li><li>変換モードフィジーのプラグイン「SIFTと線形スタックアライメント」を使用してSBEM画像のスタックの位置を合わせ、「作物3D」プラグインを使用して切り取ら。注：トリミングをさらにセグメント化し、ボリュームレンダリングに必要なRAMメモリの量を低減するのに役立ちます。 </li></ol> 3Dで描画データ 11.共焦点顕微鏡<ol><li> 「面」ツールのモードを上回る自動を使用して、Zスタックを再構築する。 図1D、RECを示しています絶対強度として0.126ミクロンで表面エリアの詳細、上の滑らかなオプションを使用して、各チャネルのonstruction、およびしきい値。 </li></ol> 12.シリアルブロック面SEM 注：手動データセグメント化は非常に時間の手順を消費し、数週間かかることが手順を描画する機能に応じてです。 Bohórquez らに提示ビデオや数値のための分割。2014年8を手動で行われ、労働力の約500時間を要しました。これは、セグメント化プロセスを開始する前にレンダリングを必要とする基本的な機能に優先順位を付けることをお勧めします。手順は次のとおりです。 <ol><li>手動セグメントに50ミリ秒の描画モードで描画モードと「輪郭」オプションで「面」ツールを使用し、ボリュームが目的の細胞をレンダリング。 </li><li>スムーズなレンダリングまたはより高速なレンダリングのために、すべての5つのスライスにセルのすべてのスライス上の輪郭をトレースします。 </li><li>エクスポート最終イム300dpiの以上の解像度で「スナップショット」ツールを使用して年齢。 </li></ol>

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博士サティシュMedicettyはの従業員であり、Renovoの神経社から100％の給与を受けます。しかし、これは、データを共有すると、材料にJoveの方針の著者の遵守を変更しません。興味のある競合は、残りの著者のために宣言されていません。

<html>胃腸chemosensationは、生物医学研究にエキサイティングな新しい分野として浮上しています。これは、腸内分泌細胞18内の機能味覚受容体の発見に大きな部分です。その後の研究は、腸内分泌細胞は、炭水化物、脂質、およびアミノ酸5,6,19,20などの栄養素のための特異的受容体を発現することを示しました。これらの発見のための触媒因子は、腸内分泌細胞は、蛍光20をラベル付けされたレポーターマウスの開発、となっています。我々は、遠位小腸および結腸17,21の腸内分泌細胞を研究するために、これらのマウスの1、PyyGFPマウスを開発しました。彼らは満腹22,23の誘導因子であり、どちらもPYYおよびグルカゴン様ペプチド1を分泌するので、これらの細胞は、関心対象です。このとき、これらの細胞の完全な超構造のアカウントは、我々は彼らのシグナル伝達機構を理解することが不可欠だと信じていたこれ、行方不明になりました。 ontentは &quot;&gt;ここでは、SBEMと共焦点顕微鏡を埋めるための視覚的方法を説明した。方法は、私たちは、腸内分泌細胞の完全な超微細構造を文書化することができCocem3D、と呼ばれている。我々は、これらの細胞が三含まneuropodを持っていることを報告しています細胞を腸これらneuropodsが物理的にニューロンに接続しても分泌小胞8のすべての四半期。neuropod内では、ニューロフィラメントと神経軸索のようなはるかにあり、neuropodsが腸内グリア細胞8に育まれています。さらに重要なこと、それは腸を支配し、コロン9。 cocem3Dの強みの一つは、そのシンプルさです。共焦点によって結像さSBEMが組織内の特定の細胞の同定を容易にすることができるブロックに組織サンプルを減らします。分泌小胞および他の細胞小器官は、7ナノメートル/ピクセルの解像度で容易に識別することができます。 SBEMのセクションが破棄されているので、さらにプロセスへ特定のタンパク質を同定するために、組織の歌うこの時点ではオプションではありません。しかしながら、そのような組織ブロックからの切片が保存されているアトゥム24、などの方法の開発は、細胞中の特定のタンパク質の同定を可能にする可能性があります。腸内分泌細胞は、脳内の腸と満腹の食糧間の感覚のインターフェイスであるため、腸内分泌細胞に化学感覚受容体の特定の位置を決定することは、肥満のための薬物療法の開発のための重要な情報です。

細胞内の生命は時間と空間で起こります。経時変化は、しばしば、超解像顕微鏡のような蛍光イメージング技術と組み合わせタイムラプス顕微鏡を用いて研究されています。スペースは、特に、細胞内小器官または細胞間相互作用の配置は、唯一のセルの微細構造を完全に考慮することによって導出することができます。細胞の微細構造の包括的なアカウントはC.のような、ゲノムが利用可能である場合には、ゲノム機能に明確さをもたらすことができます線虫1またはフラット板形動物門のtricoplaxのアドヘレン2 エレガンス 。連続切片の電子顕微鏡検査は、現在、効率的な再現性、時間、シリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡3（SBEM）のような自動化された3次元電子顕微鏡技術の開発に安価なタスクのおかげです。 機能を解明するための構造情報の必要性は、特定のセル画では非常に明白ですこのようなニューロン、グリア、または感覚上皮細胞としての機能は、物理的な細胞間相互作用に依存するL型、。我々は、腸の内腔での栄養素からの感覚信号は、最終的欲求行動を調節する電気信号に導入されているかの解明に特に興味を持っています。回路は複雑であるが、栄養素が腸内分泌細胞と呼ばれる感覚上皮細胞に接触し、腸の壁に始まります。このような味覚細胞のような他の感覚上皮細胞とは異なり、腸内分泌細胞は、1千4-7つの割合で腸上皮全体に分散されています。したがって、それらは、特定し研究することが困難であった、そして長時間彼らは消化管ホルモンの供給源として観察しました。しかし、細胞特異的蛍光レポーターマウスの開発に、これらの細胞の複雑な感覚機能が浮上しています。これらのレポーターマウスの一つは、ペプチドYY-GFP（PyyGFP）マウスを使用して、我々はそのenteroendocrを発見しましたINE細胞は、我々はneuropodという名前の顕著な細胞質尾部を持っています。 neuropodsの出現は、細胞間コミュニケーションに保存された機能を示唆しました。したがって、我々は、腸内分泌細胞の超微細構造を文書化することにより、neuropodsの関数を導出することができると推論しました。 特定するのは困難である分散セルに付属物の構造を理解する必要性は、共焦点顕微鏡とSBEMを結合する方法を開発するための主な根拠でした。関心の細胞は、PyyGFP腸内分泌細胞特異的レポーターマウスを用いて同定しました。この方法は、私たちは腸内分泌細胞とそのneuropod全体の超微細構造を文書化することができました。 neuropodsの中で、我々は、腸溶性グリア8への物理的な関係を発見し、神経細胞の軸索の構造的特徴を発見し、外neuropods。実際、neuropodsは、これらの細胞の分泌機能において必須の役割を示唆しているすべての分泌小胞の約70％を含みます。上の建物構造データは、より最近では、これらのneuropodsを通じて、腸内分泌細胞と神経細胞が腸舌8,9で味細胞と同様の神経上皮の回路を形成し、神経支配することがわかりました。 構造データから生じ胃腸化学感覚のメカニズムのような特徴を暴くことは、この相関顕微鏡法を使用して収集しました。我々は、細胞は、非常に低い割合で組織内に分散している場合は特に、この方法は、細胞生物学の他の分野に有用であり得ると考えています。我々は、3次元（Cocem3D）における相関、共焦点およびシリアルブロックフェイス走査電子顕微鏡などの方法に言及しました。組織切開、共焦点顕微鏡、SBEMイメージング、SBEMと共焦点画像相関、および手動のセグメンテーション：メソッドは、以下の主要なステップから構成されています。相関が物理的ではなく、化学物質であるため、他の相関の方法と比較して、概念はかなり単純です。

<table><tbody><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>生命技術</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリンナトリウム塩</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>158127</td><td>4%、PBSで新たに製造、最終pH 7.4</td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>シグマ</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>デンタルワックス</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>72660</td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース</td><td>生命技術</td><td>16520-100</td><td>5%、PBSで新たに製造</td></tr><tr><td>標準 Tissue-Tek クライオモールド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>62534-25</td><td></td></tr><tr><td>DAPI&nbsp;核の汚れ</td><td>生命技術</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>正装ガラススライドとカバーガラス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ファインアートペイントブラシ #1</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>カコジル酸バッファー</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>11650</td><td></td></tr><tr><td>タンニン酸</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>21700</td><td></td></tr><tr><td>EMbed 812キット&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14120</td><td></td></tr><tr><td>液体放出剤&nbsp;</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70880</td><td></td></tr><tr><td>液体銀コロイド&nbsp;&nbsp;&nbsp;</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>12630</td><td></td></tr><tr><td>CircuitWorks 導電性エポキシ&nbsp;&nbsp;</td><td>ITW Chemtronics</td><td>CW2400</td><td></td></tr><tr><td>可変流量蠕動ポンプ</td><td>VWR</td><td>70730-064</td><td></td></tr><tr><td>VT1200S 振動ブレード ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ツァイス 780i 共焦点顕微鏡</td><td>カール ツァイス&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sigma VP 走査型電子顕微鏡&nbsp;</td><td>カール・ツァイス&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3view system</td><td>Gatan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Renovo Neural Inc (オハイオ州クリーブランド)</td><td></td><td>http://www.renovoneural.com</td><td>Renovoは3D EMサービスを提供しています</td></tr><tr><td>フィジーソフトウェア</td><td>オープンアクセスソフトウェア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16GB以上の</td><td></td><td></td><td></td>RAMを搭載したコンピューターステーション</tr><tr><td>データ視覚化ソフトウェア Imaris 7.5&nbsp;</td><td>ビットプレーン</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

具体的な感覚細胞の相関共焦点と3次元電子顕微鏡

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

細胞の超微細構造の描写は、その機能を理解するために重要です。これは、腸上皮の腸内分泌細胞などの多様な細胞型からなる組織に拡散希少細胞タイプのために困難なプロジェクトであることができます。千：彼らは1の割合で他の上皮細胞に分散しているため、食品や細菌のこれらの胃腸のセンサは、勉強することが困難でした。近年、トランスジェニックレポーターマウスは、蛍光によって腸内分泌細胞を同定するために生成されています。それらの一つは、ペプチドYY-GFPマウスです。このマウスを用いて、共焦点およびシリアルブロック面の走査型電子顕微鏡を相関させる方法を開発しました。私たちはこの方法cocem3Dという名前で、組織内の特定の腸内分泌細胞を識別し、3Dで細胞の超微細構造を明らかにするためにそれを適用しました。 cocem3Dの分解能は、分泌小胞と小さい小器官を同定するために、ボリューム再ために細胞膜を区別するのに十分ですndering。 Cocem3Dは容易に天然の組織内の他の特定の細胞型の3次元超微細構造を研究するために適合させることができます。

ここで紹介する方法は、上皮の層内の特定の細胞の超微細構造を研究するために使用しました。この場合、目的の細胞は、とらえどころのない腸内分泌細胞です。 その場でそれらの同定は、細胞特異的蛍光レポーターマウスの開発にここ数年で可能でした。 2011年に、我々は、ホルモンPYYのプロモーターは緑色蛍光タンパク質17の発現を駆動するマウスを開発しました。このPyyGFPマウスでは、小腸および結腸の遠位部分の腸内分泌細胞は、容易にUV光下で識別されます。このマウスモデルは、腸内分泌細胞を含む組織ブロックを識別し、SBEMためにそれを処理するための基盤でした。相関法はcocem3Dとしてここに呼ばれ、以前に公開されたプロトコル10,11の上に建てられました。 組織ブロックの寸法を最適化することは、相関のために重要です。予備実験では、それは目的の細胞の全身を覆いながら組織ブロックに300ミクロンが長い×50ミクロンの厚SBEM画像の数を最小限に低減されることが決定した。 図1（a）は、振動羽根microtromeにを使用して切開の見逃しを示しています右の寸法を有する組織ブロックを得ます。少なくとも100ブロックは、関心のある無傷の細胞を有するものを選択するためにそれらを分類する前に取得されます。ブロックは、共焦点顕微鏡と画像のzスタックによって撮像され、選択された光学的にすべての1ミクロン（ 図1BおよびC）を間隔を置いて配置されている。 図1Dは、マウスの回腸における腸内分泌細胞のボリュームレンダリングされた図を示しています。その顕著なneuropodは〜60ミクロンのために上皮細胞の下に延びています。 目的の細胞は、ブロック全体の顔のSBEMイメージと共焦点のzスタックを相関させることによって発見されました。例はPyyGFPの遠位結腸からブロックからここに提示されていますマウス。共焦点のzスタック（ 図2A）を得た後、ブロックは、低融点アガロース（ 図2B）の薄層に埋め込 ​​まれています。これは、ブロックの後続の操作のために必要です。これはSBEMスライスの光スライスに合わせて可能な限り平坦なブロックの向きを維持することが重要です。 図2Cに、代表画像は、組織ブロックの全面で示されています。この図の一部は、以前にBohorquez らに出版された。2014年8。これは、その後、アカウントの組織のランドマークと寸法を考慮することにより、共焦点画像と相関していた。 図2Dは ​​、明らかに、ブロックの共焦点とSBEM画像の重ね合わせを示しています興味のある私たちの細胞の正確な位置。 セルが識別されると、SBEMイメージングは​​分泌小胞および他の細胞小器官を同定するのに十分に高い解像度で行われます。彼提示されたデータセットブロックの画像は、すべての70nmで採取したとして再画素当たり7 nmで画像化しました。データセットは、組織の深さ45ミクロンに及ぶ643の画像を含んでいました。数ミクロンは、低倍率での全体ブロック面の最初の撮影中に剃毛されています。生SBEMデータセットは.dm3形式で取得し、以降の処理のために.TIFFに転換しました。 SBEMスタックは、関心のある領域のみを含むようにフィジーのソフトウェアプラグイン「作物（3D）」ブロックを使用して、トリミングされました。これは、ボリュームレンダリングに必要なRAMメモリの量を減少させます。セルは、その位置と、分泌小胞によって識別され、IMARISソフトウェアを使用してセグメント化された。 図3は、腸内分泌細胞の3Dでレンダリングが含まれています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig1.jpg" /> 図1：相関、共焦点顕微鏡の一部を分析するための（A）のワークフロー。300×厚さ50μmの組織ブロックに腸組織。 （B）右の寸法の代表組織ブロック。マウス小腸からこれらのディメンションの組織ブロックは、コロン約8陰窩の場合には、約3絨毛をまたがっているか、ということに注意してください。 （C）目的の細胞を含む小腸で絨毛。 （D）IMARISソフトウェアを使用して3次元でレンダリング共焦点zスタックは、腸上皮の下に実行されている顕著なneuropodで腸内分泌細胞を示します。青= DAPI核染色。バー=10μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig2.jpg" /> 図2：SELEの連続ブロック面の走査型電子顕微鏡検査（A）共焦点画像興味のPyyGFPの腸内分泌細胞（緑）を含む大腸から組織ブロックをCTED。ブロックは、共焦点顕微鏡によって画像化されると、（B）は、その後、スライドガラスを使用して低融点アガロースで平坦に埋め込 ​​まれます。アガロースで組織ブロックを埋め込むことは、その後の操作を容易にし、左の角のノッチが正しい方向にSBEM内のブロックをマウントすることができます。 （C）ブロックの顔のSBEM画像。 （D）利息（白矢印）の細胞を識別するためのSBEMと共焦点データの相関。この図のCとDの画像は、。Bohorquezらから変更2014年8されています。ブルーはDAPI核染色を=。バー=10μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig3.jpg" /> 図3：IMARISソフトウェアを使用して腸内分泌細胞のデータは、3Dでレンダリング（A）ボリュームレンダリング。細胞は、分泌小胞を充填したneuropodが含まれています。腸内分泌細胞の超微細構造の完全な説明については、Bohórquez ら 、2014年8を参照してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

ここでは、共焦点顕微鏡とシリアルブロック面走査型電子顕微鏡を橋渡しすることにより、特定の細胞の天然組織における超微細構造を明らかにする方法、cocem3Dを紹介します。

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

この手順の全体的な目的は、天然の腸組織における他の上皮細胞の中に点在する、特定の腸感覚細胞の完全な超微形態を記録することです。これは、まず腸から300 by 50 micronの組織片を採取することで達成されます。次に、共焦点顕微鏡を用いて、その組織片の光学的なZスタック画像を取得します。次に、共焦点データを用いて、連続ブロック面走査電子顕微鏡（SBEM）による組織の処理およびイメージングのガイドとします。最後に、SBEMデータをセグメンテーションし、特定の腸管センサー細胞の超微細構造を3Dでレンダリングします。最終的に、共焦点顕微鏡法と連続ブロック面走査電子顕微鏡法を相関させます。電子顕微鏡は、天然の組織内における特定の細胞を示し、その超微細構造を3Dで明らかにするために用いられます。この手法は、光学顕微鏡レベルでは可視化できなかった特定の細胞間相互作用など、細胞生物学分野における重要な疑問への回答に役立ちます。我々は以前、この手法を用いることで、感覚腸内分泌細胞と腸神経節（enter ggl）の間に隠れた物理化学的な関係があることを報告しました。テキストプロトコルに従ってマウスの結腸を摘出した後、十分に冷却したPBSに入れ、浸したまま腸間膜に沿って組織を切開します。組織をデンタルワックス上の数滴のPBSに移し、メスを用いて遠位結腸から約6つの小さな組織セグメントを切り出します。PBSで5%低融点アガロースを調製し、標準サイズのTissue-Tekクライオモールドなどの小さなプラスチック容器を用いて組織セグメントを包埋します。包埋した切片を振動刃ミクロトームにセットし、バッファーレイに氷冷PBSを満たします。その後、振幅0.8、速度0.04 mm/sで、厚さ300 µmの組織ストリップを切り出します。300 µmの組織切片をアロスに入れ、マイクロトームの刃に対して垂直に固定します。次に、テキストプロトコルの詳細に従って組織切片を50 µmの厚さで切断し、ブロックをPBS中で4 °Cで保存します。テキストプロトコルに従って共焦点顕微鏡で組織ブロックをイメージングした後、組織切片を樹脂に浸透させ、包埋します。組織をPBSから取り出し、0.1 Mのco coateバッファーを用いて、5分間ずつ3回洗浄します。テキストのプロトコルに従って樹脂の調製と電子顕微鏡用の組織染色が完了したら、組織ブロックを包埋し、液体離型剤で処理したガラススライドの間に組織ブロックを挟みます。その後、60 °Cでさらに48時間、ブロックを平坦に硬化させます。次に、解剖顕微鏡下でスライドを引き離してブロックを取り出し、樹脂に包埋された組織ブロックの向きを共焦点顕微鏡写真の向きと合わせます。目的の細胞を含む領域の特定を容易にするため、導電性エポキシを含むピンにブロックを水平に取り付け、30分間乾燥させます。次に、ブロックを表面に平らに置き、翌日に60 °Cで一晩乾燥させます。その後、コロイド銀液体でブロックをコーティングします。組織切片を平坦に保持し、ブロックを適切な角度でスライスすることで、連続ブロック表面の画像と共焦点顕微鏡画像の相関付けを容易にします。テキストプロトコルに従って走査電子顕微鏡観察を行った後、Fijiを用いて0.8のガウスぼかしフィルターを適用し、SPEM画像をraw DM three形式から8ビットTIFF画像に変換します。TIFF画像をフィルタリングしてください。Fijiプラグインの「linear stack alignment with sift（translation mode）」を用いてデータセットを処理する際に必要なRAMメモリ量を最小限に抑えるため、データセットを元のサイズの25%に縮小し、TIFFスタックとして保存します。SPEM画像のスタックをアライメントし、「crop 3D」プラグインを使用してクロップします。データをレンダリングするには、「surfaces」ツールの「draw mode」と、「draw mode」の「contour」オプション（50 milliseconds）を使用して、目的の細胞を手動でセグメンテーションし、ボリュームレンダリングを行います。レンダリングを滑らかにするには細胞のすべてのスライスで、レンダリング速度を優先するには5スライスごとに輪郭をトレースします。P-Y-Y-G-F-Pマウスを用いて、スナップショットツールで最終画像を300 DPI以上の解像度で書き出します。小腸遠位部のすべての腸内分泌細胞を同定し、ここに示すようにSBEM用の処理を行います。選定した組織切片を共焦点顕微鏡で撮影し、光学的に1 µm間隔で離れたZスタック画像を取得しました。共焦点データとSBEMデータの地形的な相関を得るためには、組織ブロックの寸法を最適化することが重要です。マウス回腸における腸内分泌細胞のこのボリュームレンダリング像では、上皮細胞の下に約60 µm伸びた顕著なニューロポッドが示されています。共焦点Zスタック画像とブロック面全体のSBEM画像とを相関させることで、A-P-Y-Y-G-F-Pマウスの遠位結腸ブロックから目的の細胞を特定します。SBEM画像における光学スライスと一致させるため、ブロックの向きを可能な限り水平に維持することが重要です。細胞が特定された後、分泌顆粒やその他の細胞小器官を識別できる十分な高解像度でSBEMイメージングを行います。このビデオには、腸内分泌細胞の3Dレンダリングが含まれています。データセットには、組織深さ45 micronにわたる643枚の画像が含まれています。この細胞には、分泌顆粒が詰まったニューロポッド（neuro pod）および微絨毛が含まれています。このビデオを視聴することで、蛍光を用いて目的の細胞を特定し、組織を連続ブロック面走査電子顕微鏡法（serial block face scanning electron microscopy）用に処理することにより、天然の腸組織において他の上皮細胞の中に散在する特定の腸感覚細胞の完全な超微細構造をどのように記録させるかについて、十分に理解することができます。

correlative-confocal-3d-electron-microscopy-specific-sensory

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

CLEMの技術はマイクロインジェクション分子の影響を受け、膜、細胞小器官、および細胞内構造の超微形態を分析するように適合されています。このメソッドでは、複数ナノメートルの分解能にミリメートルできるようにマイクロマニピュレーション/マイクロインジェクションの強力な技術、共焦点蛍光顕微鏡、電子顕微鏡を組み合わせたものです。この技術は、多種多様なアプリケーションに適している。...

マイクロインジェクション分子およびそれらの真核生物の細胞内ターゲットを視覚化するツールに相関光学および電子顕微鏡（クレム）

ニューロンの軸索と樹状突起を示すマウスの皮質脳組織の固定切片を取ります。樹状突起には、樹状突起棘と呼ばれる突起があり、軸索とシナプスを形成します。脂質に結合するオスミウム-フェロシアン化物と組織をインキュベートし、続いてイメージングのための構造コントラストを強化する別のオスミウムアプリケーションを使用します。高分子に結合してコントラストを高める重金属化合物で染色します。樹脂の埋め込みのためにアルコール濃度を上げて脱水します。ティッシュを樹脂に埋め込んでホルダーにマウントし、金でコーティングすることでイメージング品質を最適化します。集束イオンビーム走査型電子顕微鏡を使用して、3次元イメージングを行います。イオンビームを使用して、樹脂に埋め込まれた組織の薄層を除去し、イメージング面を露出させます。露出した表面に電子ビームを集束させ、反射電子を検出して画像を生成します。 連続スライスとイメージングを行い、3次元画像を再構築して、シナプス的にリンクされた皮質ニューロンネットワークを明らかにします。...

集束イオンビーム走査型電子顕微鏡によるシナプス結合ニューロンの3D再構成

出典: Bagheri, M., et. al.アストロサイトの三次元共焦点形態計測解析のためのプロトコルJ. Vis.

共焦点顕微鏡を用いた免疫標識星状細胞の三次元イメージング

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量子ドット(QD)ナノ粒子をエポキシ包埋ヒト病理組織の相関免疫細胞化学的研究に使用できる方法が説明されています。私たちは、広視野蛍光光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡で可視化される市販の抗体フラグメント標識量子ドットを採用しています。...

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このプロトコルでは、相関超解像光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡像によるゼブラフィッシュの網膜の細胞内タンパク質局在結果を取得する必要な手順について説明します。...

ゼブラフィッシュの網膜におけるタンパク質局在を解決する相関超解像および電子顕微鏡観察

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ここでは、運動ニューロンの投影と形質転換Hb9::GFPマウス胚における軸索分枝を可視化するためのプロトコルについて述べる。運動ニューロンの免疫染色後は、後続の定量分析のため光シート蛍光顕微鏡画像の胚を使用されます。このプロトコルは、中枢神経系の他のニューロンのナビゲーション...

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学ぶ 共焦点顕微鏡と連続ブロック面走査型電子顕微鏡を組み合わせたcocem3D法により、腸管感覚細胞の超微細構造を3次元で可視化する方法。細胞間相互作用の詳細な解析に有用です。

具体的な感覚細胞の相関共焦点と3次元電子顕微鏡

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