RAFT制御重合によるトライ成分蛍光グリコの容易かつ効率的な準備

この手順の全体的な目標は、可逆的付加フラグメンテーション、鎖移動、またはラフト重合を使用して、蛍光統計線状グリコポリマーを十分に制御して合成することです。これは、最初にグリコモノマー、2ラクトバイオエチルメタアクリルアミド、またはL-A-E-M-Aを合成することによって達成されます。第2ステップは、L-A-E-M-A-N 2アミノエチルメタアクリルアミド、またはA EMAとN 2ヒドロキシエチルアクリルアミドまたはGAAのラフト重合を使用して、対応する低分散糖ポリマーを合成することです。

次に、グリコポリマーをカルボキシフルオレセインxitoミドルエステルと反応させることにより、その第一級アミンの1つで修飾し、フルオレセイン化グリコポリマーを生成します。最後のステップは、フルオレセイン天然糖ポリマーを、既知の糖鎖結合特異性を持つレクチン被覆アローズビーズに結合させることです。最終的に、蛍光顕微鏡法を使用して、糖ポリマーのアローズビーズへの結合を分析し、糖ポリマーが目的の炭水化物を保有し、蛍光タグで標識されていることが確認されます。

従来のフリーラジカル重合を採用する既存の方法に対するRAF重合の利点は、wrathプロセスが開始剤由来鎖の数を最小限に抑える制御重合技術であることです。これにより、所定の分子量のポリマーと非常に狭いポリ分散ラックが得られます。重合は、特定の蛍光糖ポリマーを調製するために、モノマーの定義された混合物に適用することができます。

これらの糖ポリマーは、レクチンコーティングビーズを使用することで確認できる明確な結合能を持っています。蛍光糖ポリマーの効率的な調製は、将来の糖鎖生物学研究にとって大きな価値があることが証明されるはずです。まず、2グラムのラクトバイオン酸を3ミリリットルの無水メタノールに溶解します。

次に、無水エタノールを溶液にゆっくりと滴下して、曇るまで加えます。ロータリーエバポレーターを使用して、すべての溶剤を取り除きます。このプロセスを3回繰り返して、98%の収量で1.94グラムのラクトバイオワンファイブラクトンを生成します。

2ミリリットルのメタノール中のA EMAとMEHQの溶液に、3ミリリットルのメタノールに1グラムのラクトバイオラクトンを添加します。次に、1ミリリットルのトリエチルアミンを加え、室温で混合物を攪拌します。48時間後、20ミリリットルの脱イオン水を混合物に加え、ロータリーエバポレーターに移します。

完全に乾くまで蒸発させます。残留物を20ミリリットルの脱イオン水に溶解し、10 x 20ミリメートルの陰イオン交換カラムの上部に溶液を塗布します。1 ミリグラムの MEHQ が入ったビーカーをコンセントの下に置き、カラムをビーカーに溶出します。

ロータリーエバポレーターで溶液を吸引した後、残留物を20ミリリットルの脱イオン水に溶解し、イオン交換樹脂の1ミリグラムアリコートを追加します。消火栓試験が陰性になるまで、消火栓試験では、溶液の1マイクロリットルを除去し、それを薄層クロマトグラフィープレートに適用することにより実施されます。プレートに2%アンヒをエタノール溶液にスプレーし、ホットプレートで摂氏90度で1分間加熱します。

青色が形成されないときにエンドポイントに到達しました。次に、フリットガラス漏斗を通して溶液を試験管にろ過します。溶液をマイナス80°Cで凍結し、凍結乾燥機に移して凍結乾燥させます。

残留物を最小限のメタノールに溶解し、摂氏マイナス20度と無水アセトンを添加して製品を沈殿させます。沈殿したL-A-E-M-Aをフリットガラス漏斗でろ過して回収します。漏斗を移し、2ミリリットルの試験管で約150メッシュの酸化アルミニウムナノ粒子を1ミリリットルの商用グレードのHEAAに0.5グラムで乾燥させるために真空乾燥剤に沈殿させます。

チューブをGの300倍で30秒間遠心分離し、最上層を阻害剤を含まないHEAAとして使用します32.8ミリグラムのL-A-E-M-A、1.7ミリグラムのEMA、27.5マイクロリットルの阻害剤を含まないHEAA、0.4ミリリットルの脱イオン水を慎重に溶解し、溶液をよく洗浄した1ミリリットルの側面チューブに移します。次に、50マイクロリットルのラフト試薬と50マイクロリットルのイニシエータ試薬をチューブに加え、バルブを閉じた状態でチューブの側面を軽くたたいて混ぜます。チューブを真空ラインに接続し、ドライアイスエタノールバスを使用して内容物を凍結します。

次に、ポンプでチューブの圧力を50ミリトールに下げ、バルブを閉じます。ドライアイスバスを取り出し、内容物を解凍します。凍結、真空、解凍のサイクルをさらに2回慎重に繰り返します。

チューブを検査して内容物が完全に溶解していることを確認し、必要に応じて穏やかにボルテックスします。着座する前に、閉じたチューブを真空ラインから取り外し、透明なプラスチック製の真空バッグに入れます。プラスチック製のハンドポンプでバッグから空気を排出します。

次に、バッグを摂氏70度の蓋付きウォーターバスに24時間入れます。次に、チューブをバッグから取り出し、その内容物を分子量カットオフが3, 500ダルトンの透析バッグに移します。透析バッグをビーカーに入れ、2リットルの脱イオン水に対して24時間透析します。

透析バッグの内容物を試験管に移し、マイナス80°Cの冷凍庫に入れます。凍結したら、凍結乾燥機に移し、凍結乾燥します。ふわふわの白色糖鎖ポリマーPMA LA EMAを得るには、まず、0.9ミリリットルのPBSに5ミリグラムのPMA LA EMAの溶液を調製します。

次に、0.6ミリグラムのカルボキシフルオレセインシンをゆっくりと加え、100で中間のエター、ジメチルホルムアミドのマイクロリットルを急速に攪拌した溶液、マイクロチューブおよびホイルに加え、室温で16時間ゆっくりと攪拌し、溶液を分子量カットオフ3, 500ダルトンの透析バッグに移します。バッグをビーカーに入れ、光から保護しながら、2リットルの脱イオン水に対して16時間透析します。透析バッグの内容物を試験管に移します。

溶液をマイナス80°Cで凍結した後、凍結乾燥させます。P-M-A-L-A-E-M-A、糖ポリマーと標識されたふわふわの黄色の蛍光を得るには、HPLCシステムを使用して糖ポリマーの数平均分子量、重量、平均分子量、および糖鎖ポリマーの分散性を決定します。まず、1.5ミリリットルのPBSから50マイクロリットルのエリクリスタギャレーレクチンコーティングされたアロビーズの懸濁液を遠心分離管に入れます。

次に、チューブをGの300倍で1分間遠心分離します。次に、上澄みを捨て、さらに2回洗浄を繰り返してから、最後に0.5ミリリットルのPBSを追加します。6マイクロリットルのPBS中に3マイクログラムのPMA LA EMAと標識されたフルオレセインの溶液を、レクチンコーティングビーズの入ったチューブに加えます。

ネガティブコントロールとして、P-M-A-G-A-E-M-Aとラベル付けされたフルオレセインを使用してください。次に、チューブをホイルで包み、室温で1時間インキュベートします。チューブを1分間遠心分離し、上清を捨てます。

次に、ビーズを1.5ミリリットルの新鮮なPBSに懸濁し、洗浄を3回繰り返します。最後に、レウスはビーズを0.2ミリリットルのPBSに懸濁し、懸濁したビーズの4マイクロリットルを免疫蛍光顕微鏡のウェルに移します。スライドさせてガラスカバースリップレコードで覆います。

10倍対物レンズFITCフィルターとカメラを取り付けた蛍光顕微鏡を使用したスライドの画像。糖ポリマーをゲル浸透クロマトグラフィーで分析しました。ラフトを使用せずに合成されたポリマーは、ラフトを使用して製造されたポリマーよりもはるかに高い分散性を示します。

フルオレセインで標識すると、グリコポリマーの物理的外観は白色から紫外線の下で示される強い黄色に変わります。レッテルを貼付されていないポリマーの溶液は暗いままですが、フルオレセイン標識ポリマーは明るい緑色に光ります レッテルの存在を確認する レクチン被覆ビーズへの特異的結合は、ペンダント糖残留物を運ぶポリマーでのみ発生します ビーズは結合すると緑色に光り、ペンダント糖残基を欠くポリマーで処理すると暗いままです。このラフトベースの重合技術により、合成できる糖ポリマーの種類に大きな柔軟性がもたらされます。

その後のグリコポリマーの標識は、水性環境下で一次手段と反応することができる多種多様な蛍光試薬を用いても達成できます。糖鎖生物学の分野の研究者は、この技術を使用して、汎用性が高く明確な糖鎖ポリマーを容易に得ることができます。これらの糖ポリマーは、嚢胞性線維症の患者や多くの種類のヒトのがんに関与する患者の呼吸器経路で観察されるような、炭水化物結合特異性を探索するためのツールとして使用できます。