別の雑草種の堅牢な除草剤抵抗性試験のためのプロトコル

本手順の目的は、広範囲の雑草種および除草剤における除草剤耐性を試験・確認し、その耐性レベルを推定することである。これはまず、除草剤処理を生き抜いた植物から採取した種子の休眠を打破し、一斉に発芽および苗の出芽を促すことで達成される。数日から1週間以上の種子春化期間が必要となる。

第2ステップでは、硝酸カリウムを含むアガー培地をプラスチック製シャーレに注ぎます。その後、Vernの種子を凝固したアガー上に配置し、各雑草種の最適条件に設定した発芽キャビネットにシャーレを移します。次に、15〜20本の苗を、標準的な培養土を満たしたプラスチック製トレーに移植します。

各トレイに一意の識別情報をすべて含むバーコードを割り当て、苗が2〜3葉期に達するまで加温温室に置きます。最終ステップは、精密ベンチスプレーヤーを用いた除草剤処理です。すべての除草剤は、推奨される界面活性剤を含む市販製剤として、推奨圃場用量の2倍および3倍の2つの用量で散布します。処理の3〜4週間後に最終評価を行います。バーコードリーダーを用いて、実験単位あたりの生存株数と視覚的に推定したバイオマスを記録します。

その後、データをコンピュータにダウンロードし、除草剤耐性の状態を判定するために解析します。in vivoまたはin vitroの診断スクリーニング試験に対する本法の主な利点は、その堅牢性と柔軟性にあります。言い換えれば、本法は信頼性が高く、わずかな調整で幅広い種に容易に適応させることが可能です。

この手法は、除草剤耐性雑草群の研究および管理における、耐性のパターンやレベルなどの重要な疑問を解消するのに役立ちます。また、用量反応試験などのさらなる実験ステップを適切に計画することを可能にします。一般的に、除草剤耐性試験に不慣れな研究者は、考慮し、かつ特定の実験条件に適応させるべき多くの手順や側面があるため、困難に直面することがあります。

まず、1種ずつ種子のサンプルを採取し、固有のコードを割り当てます。籾殻を取り除き、脱粒させることで種子を洗浄します。割り当てた固有のコードを記載したフォームに、サンプルごとの情報を記入してください。

種の名称、採集日、GPS座標、市区町村、農家名、圃場面積、被害レベル、作物、シーズン中に使用した除草剤、および圃場の履歴記録を記載してください。種子は、割り当てられた固有コードを記載した密封されていない紙袋に入れて保管します。水分を蒸発させますが、種子を高温や極端な温度変化にさらさないようにしてください。

二次休眠の誘導を避けるため、洗浄した種子を暗室の4 °Cで保存し、春化させます。プラスチック製ディッシュに脱イオン水を入れます。

フィルターペーパーを2枚のディスク状と1枚のストリップ状に切り分けます。このストリップは、毛細管現象によって水と2枚のディスクの間にブリッジを形成させます。フィルターペーパーを水に浸し、プラスチック製ディッシュに入れます。その後、風乾させた種子をペーパーの上に配置します。

種に応じて必要な期間、プラスチック製のディッシュを4°Cで保持します。次に、脱イオン水を用いて0.1%硝酸カリウムを含む0.6%アガー溶液を調製します。電子レンジでアガーを溶解させ、アガー溶液をプラスチックディッシュに注ぎます。基質が冷却されたら、発芽させるVernの種子を凝固したアガーの上に配置します。

プラスチック製ディッシュを発芽キャビネットに配置します。春化処理の期間、ならびに光および温度条件は、雑草の種によって異なります。直播ではなく移植を行うことで、同一成長段階の均一な個体群を得ることができ、これは除草剤処理の性能を最適化するための重要な前提条件となります。60%のシルト質ローム土、15%の砂、15%の農業用パーライト、および10%のピートを混合した標準的な培養土を満たしたプラスチックトレイに、15〜20本の苗を移植します。各トレイに、個体群コード、試験中の除草剤、反復番号、および通しトレイ番号を含む、個体識別用の情報を記載したバーコードを貼付します。

トレイを加熱温室内に設置し、基質を圃場容水量またはそれに近い状態に維持するため、必要に応じて植物に潅水します。出芽後処理除草剤の場合、生育温度は雑草の種類によって異なります。植物が2〜3葉期に達したときに散布します。界面活性剤溶液はラベルの指示に従って一括して調製してください。最終濃度は通常、最終容量に対する割合（%）として、または単位面積あたりに散布する容量として表記されています。

界面活性剤溶液に溶解させる市販製剤の量を算出します。この方程式を用いて、推奨される圃場投与量に最大試験投与量を乗じ、さらに溶液の最終容量をベンチスプレーヤーによる投与量で除することで、除草剤の投与量を算出します。まず、最も濃度の高い除草剤溶液を調製します。次に、この除草剤溶液を3回段階的に希釈し、低濃度の溶液を調製します。

この手順により、除草剤の計量やピペッティング時のミスを減らすことができます。除草剤溶液。濃度は、単位面積あたりに散布する量として表されます。

除草剤の低用量から処理を開始します。これにより、同一の除草剤を用いた2回の処理の間に噴霧キャビネットを洗浄する必要がなくなります。除草剤溶液は、3つのフラットファン形油圧ノズルを備えたブームを用い、圧力215 kilo pascals、速度0.75 meters per secondで、1ヘクタールあたり300 litersを散布する精密ベンチスプレーヤーを使用して散布します。

除草剤を変更する際は、1%の漂白剤を用いて噴霧キャビネットを2回洗浄し、その後ですすぎを行ってください。試験した除草剤の記録に基づき、処理から3〜4週間後に評価を行います。バーコードリーダーを使用して各トレイを自動的に識別し、処理後に生存した植物の数および目視で推定したバイオマス（VEB）を記録します。植物の色やその他の外見に関わらず、活性成長が見られない場合は「死亡」と判定します。

VEBは、同一個体群の処理区と未処理の対照区における植物バイオマスの視覚的な比較によって算出します。除草剤の影響を受けていない植物には10点、完全に枯死している植物には0点とし、処理した各トレイにスコアを割り当てます。除草剤で処理されたことがない、あるいはほとんどない場所で採取された個体群など、感受性個体群をすべての実験に組み込むことで、一般的な処理効率を評価してください。

除草剤処理直前に数えた処理植物数に対する生存率をパーセンテージで表し、標準誤差を算出します。得られた2つの除草剤投与量による処理結果に基づき、個体群を以下の4つのカテゴリーに分類します。除草剤投与後の生存率が5%未満の場合は「感受性」とします。生存率が5%から20%の間である場合は「弱耐性」とします。

除草剤の投与量に対して20%以上の個体が生存した場合を1倍耐性と定義する。1倍の投与量で20%以上、および3倍の投与量で10%以上の個体が生存した場合を、1倍および高度耐性と定義する。4つのiopa集団に対するpanolamによる除草剤処理の代表的な結果を3倍の条件で示す。

感受性対照区は完全に防除されたが、個体群1410は生存率が20%未満であったため、弱抵抗性と分類された。個体群1411は3倍量では防除されたが、1倍量での植物生存率は20%を超えたため、中程度の抵抗性と判定された。最後に、個体群1412は推奨される圃場適用量の1倍量および3倍量のいずれにおいても防除されなかったため、強抵抗性のカテゴリーに割り当てられた。

トリフルオロメチル処理を施した植物の個体群におけるバイオマス視覚的推定の2つ目の例をここに示します。未処理の対照群には10のスコアを割り当て、植物が完全に抑制されたトレイのVEBは0とします。中程度のスコアである5を、該当するトレイに割り当てます。

除草剤処理の影響を受けず、そのため高い耐性を示し、未処理の対照群と同等のバイオマスを持つ植物を含むトレイの全植物バイオマスが、未処理の植物のトレイの半分であった場合、VEBは10となります。この手順を行う際は、成熟時に採取し、その後復元させた雑草種子の品質が、本手順に従った実験の成功に強く影響することを念頭に置くことが重要です。耐性レベルに関する追加の疑問に正確に答えるためには、応答バイアスなどの他の手法を実施することができます。

このビデオを視聴することで、除草剤耐性試験へのアプローチ方法や、異なる雑草種に合わせて各ステップを調整する方法について、十分な理解を得ることができます。特に、種子の休眠打破と種子の発芽について詳しく解説します。除草剤や濃縮酸を取り扱う作業は極めて危険であるため、本手順を実施する際は、マスク、手袋、その他の個人用保護具の着用など、常に十分な予防策を講じてください。