内皮細胞接着性の定量インビトロ

この手順の全体的な目標は、in vitroで内皮細胞の接着性を定量化することです。これは、最初にフィブロネクチンコーティングされたカバースリップを24ワールドクラスタープレートに調製することによって達成されます。次に、ヒト冠状動脈内皮細胞をガラスカバースリップに適用し、コンフルエントな内皮細胞単層が形成されるまでインキュベートします。

所望の処理を内皮細胞に投与した後、ガラスカバーに添加した蛍光標識単球を滑らせ、内皮細胞単層とインキュベートする。最後のステップは、カバースリップの細心の注意を払って浸漬および洗浄手順することにより、内皮単層から未結合の単球を除去することです。最終的に、この方法により、特定の処理後に癒着する内皮細胞集団の割合を定量化できます。

この手法の主な利点は、現在のすべての方法で測定される内皮単層の全体的な粘着性とは対照的に、接着性内皮細胞の実際の数または割合を測定することです。この方法のアイデアが最初に浮かんだのは、現在利用可能な方法を使用して内皮細胞のADIを測定しようと試み、これらの方法に固有の技術的な課題により、結果に許容できないほど大きなばらつきが発生したときでした。滅菌された直径12ミリメートルの丸いガラスカバースリップは、70%エタノールに少なくとも10分間浸漬し、時折攪拌して、すべてのカバースリップがエタノールに完全に露出するようにします。

次に、すべてのガラスカバーを滑り込ませ、エタノールを滅菌した細胞培養皿に、滅菌済みの細かい5つのB鉗子を取り付けます。個々のガラスカバースリップを拾い上げて、24ウェルクラスタープレートのウェルに入れます。カバースリップがウェルのサイズに触れず、ほぼ中央にあることを確認するように注意してください、カバーされていない24ワールドクラスタープレートをガラスカバースリップでフローキャビネットに乾燥させます。

これには約10分かかります。カバースリップが乾いたら、100マイクロリットルのコーティング液を各ガラスカバースリップに撫でて、溶液がウェルの外側を引っ張らずにガラスだけを覆うようにします。蓋をした24ウェルクラスタープレートを細胞培養インキュベーターに少なくとも1時間置きます。

培養、ヒト冠状動脈内皮細胞を摂氏37度および5%二酸化炭素の培地で培地から吸引し、内皮細胞単層を10ミリリットルのハンクバランス塩溶液またはHBSSですすぎ、その後、0.2%EDTA溶液で0.5%tripsの2ミリリットルでHBSSを吸引し、内皮細胞を側面にタップして取り外すことができる約5分間室温でインキュベートします。フラスコ。フラスコの表面に噴出する大豆トリプシン阻害剤の5ミリリットルで。細胞をさらに除去するには、細胞を15ミリリットルのチューブに移し、チューブを200倍のGで5分間遠心分離し、仰臥位を吸引し、内皮ペレットを5ミリリットルの培地に再懸濁します。

ヘモサイトメーターで細胞をカウントし、細胞濃度を培地1ミリリットルあたり50, 000内皮細胞に調整します。コーティングされたガラスカバースリップを含む24ウェルプレートの各ウェルに1ミリリットルの細胞懸濁液を分注し、細胞培養インキュベーターで細胞を摂氏37度プラス5%の二酸化炭素で一晩インキュベートします。細胞は目的の治療の準備ができています。

3日以内にコンフルエント単層が形成されたら、RPMIで培養したHL60細胞を10%ウシ胎児血清を15ミリリットルのチューブに補充し、Gの200倍で細胞を5分間遠心分離します。次に、すむかし酸を除去し、HL 60細胞の蛍光標識のために、血清を含まない5ミリリットルの培地に細胞を再懸濁します。適切な量の細胞をカウントし、15ミリリットルの遠心分離チューブに移します。

細胞をGの200倍で5分間遠心分離します。仰臥位を除去した後、血清を含まないPMI培地のセルトラッカーに細胞ペレットを再懸濁します。1ミリリットルあたり100万個の細胞の濃度で、インキュベーション後1時間細胞培養インキュベーターで細胞をインキュベートし、細胞をGの200倍で5分間遠心分離し、すくい

培地中のCell palを1ミリリットルあたり200万個の細胞の濃度で懸濁します。内皮細胞単層を含む24ウェルクラスタープレートの各ウェルにHL 60細胞懸濁液と標識された1ミリリットルのセルトラッカーを加え、インキュベーション期間後1〜3時間の間に選択した一定期間、摂氏37度および5%二酸化炭素の細胞培養インキュベーターでプレートをインキュベートします。細い5つのB鉗子のペアを使用して、カバースリップの外側の端だけを裂くウェルからガラスカバースリップを拾い上げ、カバースリップとカバーの端を軽くたたきます。

ベンチのティッシュを3秒間滑ります。カバースリップの細胞被覆面に触れないように注意し、カバースリップを保持している組織とスリップを一対の鉗子でしっかりと取り付けます。カバーを5回目のダンク後、HBSSに5回出し入れ

HBSSはカバーの端を軽くたたきます。ティッシュを3秒間滑ります。ダンクとダブの手順を繰り返して、5つのダンクの合計3セットとダブします。

次に、カバースリップをTencentフォーミュラを含むウェルに移し、セルを室温で固定します。カラースリップは、長期保存のための列挙、または接着性内皮細胞を列挙するためのテキストプロトコルに記載されているように、抗体または老化関連ベータガラクトサーゼ活性の対比染色を受ける準備ができており、DPIカウンターステインを備えた顕微鏡スライドにカバースリップを取り付けて、fourexまたは10 x対物レンズを備えた倒立顕微鏡を使用して個々の細胞を識別します。複数のフィールドの画像を取得し、放射されていない内皮細胞に凝集する単球の最大数をカウントします。

必要に応じて、クラスターとして定義される内皮細胞上の単球のしきい値として、この数値の 2 倍を設定します。実験の性質に応じて、クラスターの定義に異なる基準を使用できます。フィールド内のクラスター数と内皮細胞の数を数えます。

フォームを後者で割って、接着性内皮細胞の割合を求めます。多数のフィールドをスコアリングして、カウントの平均と標準偏差を取得します。灰色放射線照射後7日目の単球とのインキュベーション前の内皮単層は、個々の内皮細胞の周りのクラスターで単球に結合していました。

この現象は位相差の下で容易に観察できますが、顕微鏡法の蛍光顕微鏡法では、単球クラスターの画像がさらに鮮明になります。記載のADIアッセイを実施した後、適切な抗体を用いて細胞の膜細胞質または核タンパク質の染色に進むことができます。標準的な免疫蛍光法では、過度の力が単球を剥がす可能性があるため、洗浄手順に注意してください。

さらに、老化関連ベシアーゼなどの酵素ベースのアッセイを行うことができる。これにより、老化細胞のリソソームが青色に変色し、その小さなサイズと球形のために同定される多数の単球によって選択的に結合する内皮細胞で明らかなように。各単球クラスターは個々の内皮細胞に対応しているため、クラスターを列挙すると、単層内の接着性内皮細胞の実際の数、したがって集団内の接着性内皮細胞の割合が明らかになります。

これは、内皮単分子膜に付着した単球をトリプシンEDTA溶液で除去し、現代の方法と同様にプレートリーダーを使用して蛍光を測定することができる場合に、内皮細胞の接着性を定量化できるこれまでの唯一の方法です。一度習得すれば、このテクニックは4時間で、ほとんど時間をかけずに行うことができます。重要なのは、すべての洗浄と浸漬のステップは、この手順に従って、すべてのサンプル間で同じ回数の繰り返しで同じ方法で実行する必要があることを覚えてお

免疫蛍光法や老化関連ベータガラクトアッセイなどの他の方法を実行して、接着性のある内皮細胞とそうでない内皮細胞の特性は何かなどの質問に答えることができます。