デジタル核酸定量アッセイの簡単な一括読み出し

この手順の全体的な目的は、従来のリアルタイムPCR装置を用いてアッセイのバルク蛍光を測定し、デジタルドロップレットアッセイの読み取りを簡略化することです。まず、目的のサンプルと2つの標準物質の増幅反応液を調製し、ドロップレットを形成して、それぞれを数千個のナノリットルサイズのリアクターに分割します。次のステップでは、ドロップレットをインキュベートし、各ドロップレット内の核酸を増幅させます。

次に、標準的なQPCまたはサーモサイクラーを用いて、各サンプルまたは標準試料のバルク蛍光を測定します。最終ステップとして、標準試料から作成した標準曲線を用いて、目的のサンプルにおける蛍光ドロップレットの割合を予測します。本手法の性能を検証するために、蛍光顕微鏡を使用して、バルク蛍光アッセイの定量性能を独立して評価することができます。

ドロップレット計数などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、特殊な装置を必要としないことです。このアッセイを開始する前に、プロトコルの本文に記載されている必要なすべての試薬と、2つの標準試料を用意してください。1つはヌクレアーゼフリー水などのテンプレートなしコントロールで、もう1つはlambda DNAなどの高テンプレート濃度試料です。それぞれの標準試料 3.3 µL を、AQPCRチューブ内の変性バッファー 3.3 µL と混合して変性させます。

室温で3分間インキュベートします。それぞれに3.3 µLの中和バッファーを加えて反応を停止させます。同様に、目的のテンプレート3.3 µLを3.3 µLの変性バッファーで変性させ、室温で3分間インキュベートします。

3.3 µLの中和緩衝液でクエンチします。偽陽性を減らすため、サンプルあたり11 µLのマスターミックスを調製します。液滴を形成させる前に、マスターミックスをUV光に曝露させます。

まず、0.5 mLまたは1.5 mLの透明チューブを用いて、サンプルあたり10 µLのプレミックス混合液を氷上で準備します。プレミックス混合液は、ランダム化オリゴ、B-S-A-D-N-Aポリメラーゼ反応バッファー、dn、NTPs、およびヌクレアーゼフリーウォーターで構成されています。チューブを氷上の水に置き、UV照射を行います。

A-D-S-D-N-A結合染料と参照用ダイエットをプレミックス混合液に加えます。ポリメラーゼがpH 7.5から大きく外れた環境にさらされないよう、最後にPHI 29 DNA polymeraseを添加してください。変性させたテンプレートまたは標準試料10 µLと、マスターミックス10 µLを合わせ、十分に混合します。

液滴は静電気やせん断応力に非常に敏感であるため、実験者は静電気の原因となる衣類を取り除き、液滴を形成する前に接地（アース）を行う必要があります。このデモンストレーションに使用したマイクロ流体デバイスは自社製であり、オイル入口1つと、液滴生成用のフローフォーカシング接合部を持つ水相入口2つを備えています。2台のシリンジポンプを使用して、界面活性剤を含むオイル 55 µLと反応混合液 20 µLのマイクロ流体チップへの流速を制御してください。

20,001ナノリットルの液滴を生成する場合、最も困難な工程の一つはエマルションを乱さずに液滴を回収することです。ゆっくりと、かつ慎重にピペッティングすることが重要です。幅広のチップ（ワイドボアチップ）を使用してください。

各サンプルのドロップレットをすべてPCRチューブに回収します。ワイドボアチップを用いて、非常にゆっくりとピペッティングしながら、30 µLのオイルを光学用キャップ付きの新しいPCRチューブに分注します。オイルの上に20 µLのドロップレットを転送します。

容量を一定にすることで、アッセイの精度を最大限に高めることができます。キャップが緩いとオイルが蒸発するため、チューブのキャップをしっかりと閉めてください。エマルジョンが入ったチューブを扱う際は、エマルジョンからできるだけ離れたチューブの上部を持つようにしてください。等温増幅には、PCRサーモサイクラー、A-Q-P-C-Rサーモサイクラー、またはホットプレートを使用できます。

本デモンストレーションでは、A-Q-P-C-R サーマルサイクラーを使用します。サンプルを30 °Cで7時間インキュベートし、75 °Cで1分間不活化させます。反応および活性化後、直ちに次へ進みます。

QPCRサーモサイクラーを用いて、すべてのサンプルの蛍光レベルを測定します。各サンプルについて、dsDNA結合染料の蛍光強度をリファレンス染料の蛍光強度で除します。

すべてのサンプルから背景蛍光またはテンプレートなしコントロール（NTC）の標準化蛍光を差し引きます。標準試料の補正済み蛍光測定値を用いて、線形標準曲線を作成します。テンプレートなしコントロールの標準試料は、蛍光ドロップレットが0%のサンプルの蛍光を表し、高テンプレート濃度が上限となります。

蛍光測定とは、対応する標準曲線を用いて、蛍光ドロップレットが100%であるサンプルの期待蛍光値を求めることです。バルク蛍光に基づいて、陽性ドロップレットと陰性ドロップレットの中間比率を予測します。この手法では、従来のリアルタイムPCR装置を使用して、ドロップレットベースのデジタルアッセイのバルク蛍光を測定します。

蛍光ドロップレットと非蛍光ドロップレットを異なる比率で予め混合し、バルク蛍光強度と陽性ドロップレットの割合との比較を行いました。予想通り、バルク蛍光強度および陽性ドロップレット数は、投入した蛍光ドロップレットの割合に比例して線形に変化しました。標準試料に基づいて予測された比率を、期待される蛍光投入分率と比較しました。

直線は、線形関係を想定した場合の期待値を示しています。結果は、2桁のダイナミックレンジにわたって液滴比の定量において良好な性能を示すことがわかりました。この手法を実際の定量的な全ゲノム増幅アッセイで検証するため、デジタルドロップレットの蛍光レベルおよび陽性液滴の割合を確認しました。

テンプレートとなるLambda DNAの濃度を上昇させてMDAアッセイを測定した。直線は、実験データをモデリングするためにポアソン分布を用いて算出した期待蛍光分率を示している。液滴の代表的な蛍光画像が示されており、バルク蛍光およびデジタルMDAサンプルの陽性液滴分率の両方が、液滴あたりの平均テンプレート数に応じて期待通りにスケールしており、バルクでの読み取りがデジタルアッセイの結果を忠実に捉えられることを示している。

この手法は、アッセイの読み取りの高速化、並列化、および簡素化を実現することで、デジタルPCRなどの他のデジタルアッセイにも寄与します。