Name: デジタル核酸定量アッセイの簡単な一括読み出し (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: 学ぶ デジタル核酸定量アッセイの簡易化手法。標準qPCR装置を用いてバルク蛍光を測定し、微小鏡検で検証する。ナノリットル液滴を用いたアクセスしやすい分子生物学技術です。

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著者は、MDA試薬とプロトコルを提供してくれたLiyi Xuに感謝します。また、この作業に関連する議論をしてくれたDavid Feldman氏とNavpreet Ranu氏にも感謝します。この研究は、Scientific Interface to PCBのBurroughs Wellcome Career Awardによって部分的にサポートされました。

注意：このプロトコルの液滴は、既存の商業用の液滴メーカー23,29を形成することができるように、マイクロ流体デバイスを製造することは、このアッセイのために必要ではありません。 1.液滴形成マイクロ流体デバイスを作ります<ol><li>以前に31が、液滴発生器のマスクパターン32と概説SU-8マスター製作プロトコルチャネルのためのマスターモールドを準備します。 </li><li>ソフトリソグラフィ32,33の技術を使用して、PDMS内のデバイスを製造します。 </li></ol> 2.バルク液滴読み出し用の反応ミックスを調製します 注意：このプロトコルは、増幅反応の多くのタイプを使用して、核酸を定量するために使用することができます。一例として、いくつかのラムダDNA濃度のMDAのために必要な試薬が挙げられます。試薬の詳細は特定の試薬の表に記載されています。液滴内のテンプレートの配布はsufficienに依存サンプルのトン混合。 <ol><li>取得またはPurifyのファージPhi29 DNAポリメラーゼ。 <ol><li>以前サプライヤーから7、または購入を説明するようにファージPhi29を精製します。示される実験に使用されるフ​​ァージPhi29を精製しました。 </li></ol></li><li> 65 mMのKOH、1.65 mMのEDTA、及び14 mMのDTTからなる変性緩衝液10mlを準備します。 </li><li> 65 mMのHClを、0.21 Mトリス-Cl pH7.0の、および9 mMのトリス-Cl pH8.0のからなる中和緩衝液10mlを準備します。 </li><li>このようなヌクレアーゼフリー水のような2つの規格、1テンプレートを含まないコントロール（NTC）、および1つの高鋳型濃度（4 PG周り/μlのラムダDNA）を準備します。定量PCRチューブ内の変性緩衝液3.3μlの各標準の3.3μLを変性。 3分間室温でインキュベートします。中和バッファーの3.3μLで各クエンチ。 </li><li>定量PCRチューブ内の変性緩衝液3.3μlの関心のテンプレートの3.3μLを変性。 3分間室温でインキュベートします。 3.3μlのクエンチ中和バッファーの。 </li><li>氷上でサンプルあたりのマスター混合物11μlのを準備します。 2X MDA反応マスター混合物を2×二本鎖DNA（dsDNA）結合色素、2倍のqPCR参照色素、オリゴランダム化50μM、2 mg / mlのBSA、2×ファージPhi29 DNAポリメラーゼ反応緩衝液、4.8 mMのdNTPを、ヌクレアーゼを含まない水で構成され、および40 / mlのファージPhi29 DNAポリメラーゼ。ファージPhi29 DNAポリメラーゼは、ポリメラーゼがよく7.5.Mixよりもはるかに高いまたは低いpHレベルが発生しないようするために、最後の追加します。 </li><li>オプション：少ない偽陽性の場合は、事前の液滴34を形成する UV光でマスターミックスを公開します。 <ol><li>氷上で0.5ミリリットルまたは1.5ミリリットル明確なチューブにサンプルあたりの予備混合物の10μlのを準備します。プレミックスは、55μMの無作為化オリゴ、2.2 mg / mlのBSA、1.1倍ファージPhi29 DNAポリメラーゼ反応バッファー、5.3 mMのdNTP類、およびヌクレアーゼフリー水で構成されています。 </li><li> 34に記載されているように氷の上に水の中にチューブを置き、ACCUに、UV光（254nm）に公開5.7 J / cm 2のmulated用量。 </li><li>予備混合物中に40μgの/ mlに二本鎖DNA結合1Xに染料、1Xに参照色素、およびファージPhi29を追加します。よく混ぜます。 </li></ol></li><li>変性テンプレートまたは標準10μlのマスター混合物10μlのを兼ね備えています。よく混ぜます。 </li></ol> 3.液滴形成注液滴が静電気やせん断応力に対して非常に敏感であることができます。静電気が発生する可能性があり衣服を削除して、液滴を形成する前に、身体を接地してください。できるだけエマルジョンから、管の上部からエマルジョンのチューブを処理します。非常にゆっくりとピペットエマルジョン、好ましくはワイドボアピペットチップと。ピペットチップから分配する場合には、分注速度を決定するために、先端の側面にエマルションを見ます。 <ol><li>フォーム滴。示される実験では、マイクロ流体デバイスは、オイル入口と液滴を生成するためのフローフォーカシングジャンクショ​​ンの2つの水の入口があります。 2シリを使用してくださいNGE 20,000 1 NL液滴を生成するために、マイクロ流体チップを介して界面活性剤と油の55μlの反応混合物の20マイクロリットルの流量を制御するためのポンプ。 </li><li>注：これは、界面活性剤と油の多くの種類の液滴を生成することが可能であるが、組成物は、非常に高温で、経時安定性、液滴に影響を与えます。一つの可能な組み合わせは、陰イオン界面活性剤19,35とフッ素系オイルのHFE 7500です。 </li><li>いずれかの方法13,36との任意のサイズで液滴を生成するが、液滴集団内のサイズの変動は、バルク蛍光ため、アッセイの精度に影響します。示される実験では、液滴は1 NLの量で単分散しました。 </li><li> PCRチューブに液滴とオイルのすべてを収集します。各サンプルについて、光学キャップと新鮮なPCRチューブに一定分量の油の30μLを、オイルの上に液滴を20μlを移します。一貫性のあるボリュームは、アッセイは、交流としてであることを確認しますできるだけキュレーション。 </li><li>閉じるチューブのキャップをしっかりと、ルーズキャップは、油が蒸発することができます。 </li></ol> 4.等温増幅<ol><li> PCRサーモサイクラー、定量PCRサーモサイクラー、またはホットプレートを用いて、7時間、30℃でサンプルをインキュベートし、そして75℃で1分間の不活性化。液滴のチューブは、この時点で数時間ホイルで覆い、冷蔵庫に放置することができます。 </li></ol> 5.データ収集と分析<ol><li>直ちに反応不活性化の後、定量PCRサーモサイクラーを使用して、すべての試料について、色素の蛍光レベルを測定します。最適フィルタの設定は、色素の励起および発光スペクトルに依存するであろう。この例では、二本鎖DNA結合色素のための492nmの-516 nmのフィルターセット、および基準色素のための585 NM-610 nmのフィルターセットを使用します。他の蛍光測定技術は、蛍光を定量化するために使用することができます。 </li><li>各サンプルについて、によって二本鎖DNA結合色素の蛍光強度を分割参照色素の蛍光強度。すべてのサンプルから、バックグラウンド蛍光、または全くテンプレートコントロールの正規化された蛍光を引きます。 </li><li>標準から補正された蛍光測定値を用いて線形標準曲線を作成します。 NTC標準は0％、蛍光滴（「すべて陰性」）、および高鋳型濃度の蛍光測定したサンプルについての蛍光を表す（「すべての正」）の100％蛍光液滴を有する試料の予想蛍光です。対応する標準曲線を用いて、それらのバルクの蛍光に基づいて、正および負の液滴の中間比を予測します。 </li></ol> 6.生産液滴実証の原理測定のための<ol><li>蛍光（正）の液滴を作る：0.1 ngのラムダDNA、1×二本鎖DNA結合色素、1X参照色素​​、1.5単位のTaq DNAポリメラーゼ、10mMのトリス-HCl、50mMの塩化カリウム、1.5メートルからなるPCR反応液を調製MのMgCl 2、0.2mMのdNTPを、および0.5μMのプライマー。上記のように混合物を30時間（20秒、20秒、1分間72°C、55°C、95°C）熱サイクルは、液滴を形成します。 </li><li>メイク非蛍光（陰性）小滴：1XのdsDNA結合色素、1X参照色素、1.5単位のTaq DNAポリメラーゼ、10mMのトリス-HCl、50mMの塩化カリウム、1.5ミリモルのMgCl 2、0.2mMのdNTPを、からなるPCR反応混合物を調製しますおよび0.5μMのプライマー。混合物を30時間（20秒95℃、20秒、1分間72°C、55°C）は、その後の液滴を形成する熱サイクル。 </li><li>プレミックスの液滴の比率を形成<ol><li>定量PCRチューブにフッ素系オイルを20μlを配布し、蒸発を防ぐため、光学キャップでカバーしています。 </li><li>油の上に負の比：優しく希望正でよく混合液滴の10μLをピペット。示された結果では、正：負の液滴比は1（すべて正）、0.8、0.5、0.2、0.1、0.01、0.001、0.0001、0（すべて陰性でしたative）。 </li></ol></li><li>定量PCRサーモサイクラーを使用して、すべてのサンプルについて、色素の蛍光レベルを測定します。このプロトコルでは、二本鎖DNA結合色素のための492nmの-516 nmのフィルターセット、および基準色素のための585 NM-610 nmのフィルターセットを使用します。 <ol><li>二本鎖DNAは、参照色素の蛍光を用いた蛍光色素を結合正規化します。また、「すべての陽性」のサンプルの蛍光によって正規化します。 </li></ol></li><li> 「すべての正」と「すべての否定」のサンプルから正規化された蛍光測定値を用いて線形標準曲線を作成します。対応する標準曲線を用いて、それらのバルクの蛍光に基づいて、正および負の液滴の中間比を予測します。 </li><li>各比率（n = 3）を独立した液滴の形成と各反復のために混合しながらのための実験を​​繰り返します。 </li></ol> 7.実証の原理MDA実験<ol><li>スペックでラムダDNAストック溶液の濃度を測定しますtrophotometer。 <ol><li> 1滴あたり平均10テンプレート分子に必要なテンプレートの濃度を計算します。このプロトコルでは、液滴体積は1 NLとラムダDNAを1 ngのは、約1.9×10 7コピーが含まれていると仮定します。そのため、1滴あたり10テンプレートはNLあたり10コピー、または1μl当たり526 FGラムダDNAとなります。テンプレートには、液滴が形成されている場合〜6倍、したがって、初期最高テンプレート濃度が3.2 PG /μLになる希釈化することになります。 </li></ol></li><li>逐次変性バッファーと同体積の中和バッファー3.2 PG /μlにラムダDNAを希釈します。 0.1の希釈率は、変性バッファーの45μlの10μlのサンプルを組み合わせて、3分間室温でインキュベートします。クエンチするために中和バッファーの45 LLを追加します。 </li><li>実験用サンプルの残りの部分を作るためにステップ7.2で説明したように、試料を希釈します。示す反応における初期鋳型濃度は、3.2 PG、320 FGました160 FG、32 FG、16 FG、3.2 FG、およびマイクロリットル当たり1.6 FG。 注意：マスターミックスの添加後の最終的なテンプレート濃度は526 FGた、52.6 FG、26.3 FG、5.26 FG、マイクロリットル当たり2.63 FG、526社、263社。 10、1、0.5、0.1、0.05、0.01、およびそれぞれ1滴あたり0.005期待ラムダコピー。 </li><li>生成し、ステップ2.5から5.3に記載されているように、各サンプルからの液滴を分析します。 </li><li>デジタルカメラを使用して示す蛍光画像（ 図2,3）は、室温で10倍の対物レンズと落射蛍光顕微鏡に取り付けられ得ます。各サンプルのビューの12のフィールドを取得します。蛍光スライドを用いて得られた背景画像で補正蛍光画像。 </li><li>エマルジ ​​ョンオイルはすぐに蒸発するように、撮像37に含まれるチャンバーを使用してください。 </li><li> ImageJのマクロ（補足コードファイル）を使用して、個々の液滴の強度を分析します。 <ol><li>最高のNに非蛍光滴を分離する閾値蛍光強度を選択します高濃度のテンプレート画像内の蛍光液滴からTCの画像。各未知試料について、閾値より上の蛍光強度との液滴の割合を計算します。 </li></ol></li></ol> 8. PCRおよびMDAバルク反応<ol><li> PCR反応を準備します。 <ol><li>直列0.1の希釈率で鋳型DNAを希釈します。各希釈のために、変性緩衝液45μlのテンプレートを10μlを組み合わせて、3分間室温でインキュベートします。中和バッファーの45μlの希釈を組み合わせます。 </li><li>サンプルあたりのPCRマスターミックス20μlのを準備します。 1.1倍PCR反応マスター混合物は、60単位/μlのTaq DNAポリメラーゼ、11mMのトリス-HCl、55ミリメートルのKCl、1.65ミリモルのMgCl 2、0.22 mMのdNTPを、1.1倍のdsDNA結合色素、1.1倍の参照色素、および550nmの成り各プライマー。 </li><li>希釈されたテンプレートを2μlとマスターミックス20μlのを兼ね備えています。 注意：最後の鋳型濃度トンで彼が示したPCR反応50頁、5頁、500 FG、マイクロリットル当たり50 FG、5 FG、500社、および0グラムラムダDNAたし、三連で行いました。 </li><li>以下のプログラムでのqPCR機における熱サイクルのPCR反応。 2分間72℃で2分間前に30秒、30秒、20秒57℃、72℃、95℃の40サイクルを実行し、4℃で保持します。 </li><li>二本鎖DNAは、更なる分析の前に参照色素蛍光を用いた蛍光色素を結合正規化します。 </li></ol></li><li> MDA反応を準備します。 <ol><li>ステップ8.1.1で説明したようにサンプルを希釈します。 </li><li>氷上でサンプルあたりのマスター混合物11μlのを準備します。 2倍MDA反応マスター混合物は、2倍のdsDNA結合色素、2倍のリファレンス色素、オリゴランダム化、50μM、2 mg / mlのBSA、2倍のファージphi29 DNAポリメラーゼ反応緩衝液、4.8 mMのdNTPを、ヌクレアーゼフリー水、および40 / mlのから成りファージPhi29 DNAポリメラーゼ。 </li><li>ポリメラーゼdを確保するために、最後の40μg/ mlのファージPhi29 DNAポリメラーゼを追加OESは、7.5よりもはるかに高いまたは低いpHレベルは発生しませ。よく混ぜます。 </li><li>定量PCRチューブ内の変性緩衝液3.3μlの希釈したテンプレートの3.3μLを変性。 3分間室温でインキュベートします。中和バッファーの3.3μLを加えます。 </li><li>変性テンプレートの10μLとマスター混合物10μlのを兼ね備えています。よく混ぜます。 </li><li>以下のプログラムで定量PCR機にMDA反応を実行します。 </li><li> 4時間30℃で保持し、蛍光ごとに7.5分を測定します。 </li><li> 1分間75℃で不活性化します。 </li><li>二本鎖DNAは、参照色素の蛍光を用いた蛍光色素を結合正規化します。また、各サンプルの最大蛍光により正規化します。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

ブロード研究所は、この研究の側面を含む特許出願を提出するために動く可能性があります。

デジタルアッセイは、希少細胞の検出、および核酸分子の個々のカウントを可能にする強力な方法です。しかし、デジタルのアッセイは、まだ日常的に市販されている方法に関連する特殊な装置のコストを部分的には、分析ラボで適用によるものではありません。ここでは、標準的なリアルタイム定量PCR装置を用いて簡略化したアナログ読み出しと核酸を定量するためのエンドポイントのデジタルアッセイを説明します。この方法は、セット・アップするために迅速で、読み出しは、液滴カウント方法よりもはるかに簡単です。 私たちのアッセイは、標準的な機器を使用して一斉エンドポイント測定を簡単にするために、個々の液滴の測定値の単一分子（単一液滴）の感度を失います。当社のデジタルMDAの実験では、蛍光顕微鏡実際FRAによって確認にもかかわらず、バックグラウンドから200の負の液滴あたり1未満の正の液滴を区別することができませんでした（ 図4）予想通り正の液滴のctionでした。バルク蛍光測定限界低い正滴画分の一括測定アッセイの感度の感度と背景。高感度が必要な場合は、デジタル読み出し...

核酸定量化（デジタルPCR）1-4とベース順（シークエンシング）のためのデジタルアッセイが強く生命科学や医学に影響を与えています。デジタルアッセイは、高感度を提供する実験全体に容易な比較を可能にし、決定的に、比較可能なデータ5（ 表1）を含む大規模なデータベースの構築を可能にする、絶対的なスケール（対照と比較していない）上の分子数の定量化を提供します。 過去15年間で、全ゲノム増幅（WGA）は、核酸増幅のための一般的なツールとして、PCRと一緒に登場しました。 PCRと同様に、WGAは、容易に検出または塩基配列のようなその後の分析のために使用することができるレベルまでの分のサンプル要素を増幅することによって、分析および分取用途に有用です。 PCRとは異なり、WGAはむしろ未知の配列を含む、サンプル中のすべての配列の増幅を可能に、特定のDNA座に固有のものではありません。PCRとWGAとの間のこの根本的な違いは、互いに相補の方法を行い、そのアプリケーション内の別の課題が生じます。 WGA反応6の高収量は、単一分子7、単セル8および定量またはさらなる分析のために他の低バイオマスサンプル9からのゲノムDNAの日常的な増幅を可能にします。 WGAの化学的性質に関連する主要な課題は、その汚染物質に対する極端な感度、個々のテンプレート分子6全体で不均一に増幅しています。 WGAによってWGA技術10の「キラーアプリケーション」、およびテンプレートの定量化は、アプリケーション7の多くの分野で重要であるように、単一のセルの順序が浮上しているようしかし、WGAが人気を集めています。 デジタル核酸定量化のための計測は、以前バルブ付きとバルブレスマイクロ流体フォーマのさまざまに記載されています小滴ベースのアッセイを含むTS 11-14、15,16（ 表2）。しかし、デジタル解析用の市販のマイクロ流体システムは、反応のセットアップと製品の検出に特化した17の機器を必要とします。カスタムバルブ付きマイクロフルイディクスは、柔軟であるが、高精度の微細加工と空気圧制御システム18が必要です 。それは、エマルジ ​​ョンベースのデジタルアッセイ19,20のために単分散の微小液滴を作ることは比較的簡単であるが、デジタル読み出しは、（人気の次世代配列決定技術に類似）のいずれかの大規模な広視野イメージング21,22を必要とする 、技術的に厄介であるか、または高速フローベースの滴検出23-25。理想的には、デジタル分析は、複雑な器具類の必要性を低減し、多数のサンプルを迅速に読み出すことができるように、読み出しにセットアップから簡単になります。ここでは、従来のリアルタイムPCR Iを使用してデジタル液滴アッセイの読み出しのための簡略化された方法を説明しますnstrumentは、液滴ベースのデジタルアッセイの大部分の蛍光を測定しました。 新しいアプローチは、デジタルPCRアッセイに適用することができるが、それは、（PCRのための優れた結果を与える）問題とリアルタイム増幅アッセイアナログれるデジタルWGAアッセイに特に有利です。 WGAは、一般的に、配列、長さ、及びベース含有量の不均一であるテンプレート分子にサンプルに適用されます。これらの異なる鋳型分子は、整合特性を有する参照（「標準」）のサンプルの使用を必要とする、異なる速度6で増幅されています。多くの場合、そのような標準が利用できない、または入ってくるサンプルの特性は不明です。入力された質量、分子の入力番号、2つ、またはいずれの組み合わせを-入力された材料の不均一性及びWGA化学の長さに依存する特性26はまた、定量化されているもので曖昧さを作成することによって、結果の解釈を複雑にします。 F任意の配列の汚染物質の分子が妨害する可能性があるためinally、配列非特異性は、定量的PCRよりも汚染に敏感定量的な複数置換増幅（MDA）をレンダリングします。マイクロ流体デジタルアッセイは、鋳型分子を分離し、より少ない汚染物質がサンプリングされるように、反応体積を減らすことによって、汚染に対処します。 ここでは、人気の等温WGA法、MDA 27を使用します 。注目すべきは、PicoPlexとMALBAC 28を含むいくつかの他のWGA化学は初期等温鎖置換手順に決定的に依存しています。等温ステップは、定量的WGAするアナログリアルタイムアッセイを適用する挑戦を悪化させます。 WGAは完全に不要な変数プレ増幅につながる、セットアップ中に防止なく、また離散化もできない（「循環」）異種の分子の複製が完了するまで駆動し、PCR前11のように、次のサイクルに停止することができる方法で、 </suP&gt;（ 図1）。 WGAのためのデジタルアッセイ形式は、（そのように前増幅は、結果には影響しません）アッセイエンドポイントでの列挙のための各分子の分離に起因する典型的な反応セットアップ手順をaccomodates元の読み出しが精度が増幅効率の変動に大きく依存することになることを意味します。 アッセイエンドポイントでの1滴あたりの信号レベルは液滴量に依存することになるようアッセイは、均一な体積で油中に生成される液滴に依存しており、我々は結果の一貫性は、液滴サイズの分布全体に平均化に依存する必要はありません。単分散液滴を作ることになりました（約​​3,500単分散液滴の論文は2013年以降に発行された）標準的な手順ですが、マイクロ流体計測器25を必要とします 。実際には、以上の6社は、このような液滴の生産に依存している独立した商用製品を開発している、と液滴作りのマイクロ流体チップは、23,29市販。この研究のために、私たちは内製のカスタムマイクロ流体デバイスを（プロトコルを参照）を使用しました。デバイスを通る流れを駆動するためのシリンジポンプはまた、市販されているが、代替的に、コストを削減する30真空駆動流のための単一の使い捨て注射器で置換することができます。

<table><tbody><tr><td>Evagreen染料</td><td>Biotium</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>ニューイングランド</td><td>バイオテクノロジーB9000S</td><td></td></tr><tr><td>Phi29 DNAポリメラーゼ反応緩衝液</td><td>ニューイングランド</td><td>バイオテクノロジーB0269S</td>定期的に渦巻き、<td>骨材</td></tr>が<tr><td>ラムダDNA</td>を溶解するまで <td>ニューイングランド</td><td>バイオテクノロジーN3011S</td><td>50oCに加熱し、急冷希釈前の氷</td></tr><tr><td>ランダム化 MDAオリゴ</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td></td><td>5'-NNNNN*N-3'PCR</td></tr><tr><td>プライマー</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td></td><td>5'-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3'および5'-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3'</td></tr><tr><td>超高純度ヌクレアーゼフリー水</td><td>Life Technologies</td><td>10977-015</td><td>Stratalinker 2400 で 30 分間 UV 処理してから使用 (オプション)</td></tr><tr><td>ROX 参照色素</td><td>Life Technologies</td><td>12223-012</td><td></td></tr><tr><td>PCR 光学ストリップキャップ</td><td>Life Technologies</td><td>4323032</td><td></td></tr><tr><td>PCR チューブ</td><td>Agilent Technologies</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>dNTP (各 25 マイクロモル)</td><td>Agilentテクノロジー</td><td>200415</td><td></td></tr><tr><td>サーモサイクラー - Mx3000P qPCR システム</td><td>Agilent Technologies</td><td>401403</td><td></td></tr><tr><td>バリア ピペットチップ</td><td>VWR</td><td>89003-046</td><td></td></tr><tr><td>バイオ・ラッド オイル for evagreen</td><td>バイオ・ラッド</td><td>186-4005</td><td></td></tr><tr><td>JumpStart Taq ReadyMix</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2893-100RXN</td><td></td></tr></tbody></table>

デジタル核酸定量アッセイの簡単な一括読み出し

Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

デジタルアッセイは、稀な細胞と個々の核酸分子の計数の検出を可能にする強力な方法です。しかし、デジタルアッセイはまだ日常的に市販されている方法に関連するコストや特定の機器に起因適用されません。ここでは、液滴ベースのデジタルアッセイの大部分の蛍光を測定するために、従来のリアルタイムPCR機器を使用してデジタル液滴アッセイの読み出しのための簡略化された方法を提示します。 私たちは、合成液滴の混合物と液滴デジタル複数置換増幅（MDA）アッセイを使用してバルク読み取りアッセイの性能を特徴づけます。デジタル反応形式から定量的なMDAは特に利点が、私たちの新しい方法は、任意のデジタルアッセイに適用されます。デジタルPCRのような確立されたデジタルのアッセイプロトコールについては、この方法は、スピードアップとアッセイ読み取りを単純化するのに役立ちます。 我々のバルク読み出し方法はpartitioneの利点をもたらします専門の読み出し計測を必要とせずにDアッセイ。この規格の要件は、従来のリアルタイム実験のためのより少ない厳しいですがバルク読み出し方法論の主な制限は、液滴カウントプラットフォームおよび標準試料を必要と比べてダイナミックレンジが減少しています。定量的な全ゲノム増幅（WGA）をWGA反応中の汚染物質について試験するために使用され、医薬品の品質管理及び宇宙生物学を含む多様な応用分野における方法大きな期待を与え、未知の配列を有するDNA断片の存在を検出するための最も感度の高い方法です。

従来のバルク/リアルタイム読み出し定量PCRおよび定量WGAアッセイ（ 図1）の両方に使用することができるが、デジタル定量的アッセイは、利点がある （表1）を提供します 。記載された方法では、単純なバルクエンドポイント測定（ 図2）を用いて、マイクロ液滴形式のデジタル分析を読み出します。この方法は広く適用可能であるが、この方法は、従来のリアルタイム分析のための特別な課題を提示するので、我々は定量的WGA（MDA）に焦点を当てています。 当社のリアルタイムPCR装置は、油中に分散した蛍光微小液滴の変化分を検出することができるかどうかを確認するために、我々は、蛍光および非蛍光滴（ 図2）の合成混合物の大部分の蛍光を測定しました。バルク蛍光と正の滴数（独立蛍光顕微鏡によって評価）予想通り（蛍光液滴の入力割合で直線的に図3A）。実験は、各セットのために独立した液滴の形成と混合し、3回行いま...

私たちは、単純化された(アナログ)読み出しで核酸を定量するためのエンドポイントデジタルアッセイについて説明します。液滴ベースのデジタルアッセイのバルク蛍光は、特殊な装置ではなく標準的なqPCR装置を使用して測定し、顕微鏡で結果を確認します。

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

この手順の全体的な目的は、従来のリアルタイムPCR装置を用いてアッセイのバルク蛍光を測定し、デジタルドロップレットアッセイの読み取りを簡略化することです。まず、目的のサンプルと2つの標準物質の増幅反応液を調製し、ドロップレットを形成して、それぞれを数千個のナノリットルサイズのリアクターに分割します。次のステップでは、ドロップレットをインキュベートし、各ドロップレット内の核酸を増幅させます。次に、標準的なQPCまたはサーモサイクラーを用いて、各サンプルまたは標準試料のバルク蛍光を測定します。最終ステップとして、標準試料から作成した標準曲線を用いて、目的のサンプルにおける蛍光ドロップレットの割合を予測します。本手法の性能を検証するために、蛍光顕微鏡を使用して、バルク蛍光アッセイの定量性能を独立して評価することができます。ドロップレット計数などの既存の手法に対する本手法の主な利点は、特殊な装置を必要としないことです。このアッセイを開始する前に、プロトコルの本文に記載されている必要なすべての試薬と、2つの標準試料を用意してください。1つはヌクレアーゼフリー水などのテンプレートなしコントロールで、もう1つはlambda DNAなどの高テンプレート濃度試料です。それぞれの標準試料 3.3 µL を、AQPCRチューブ内の変性バッファー 3.3 µL と混合して変性させます。室温で3分間インキュベートします。それぞれに3.3 µLの中和バッファーを加えて反応を停止させます。同様に、目的のテンプレート3.3 µLを3.3 µLの変性バッファーで変性させ、室温で3分間インキュベートします。3.3 µLの中和緩衝液でクエンチします。偽陽性を減らすため、サンプルあたり11 µLのマスターミックスを調製します。液滴を形成させる前に、マスターミックスをUV光に曝露させます。まず、0.5 mLまたは1.5 mLの透明チューブを用いて、サンプルあたり10 µLのプレミックス混合液を氷上で準備します。プレミックス混合液は、ランダム化オリゴ、B-S-A-D-N-Aポリメラーゼ反応バッファー、dn、NTPs、およびヌクレアーゼフリーウォーターで構成されています。チューブを氷上の水に置き、UV照射を行います。A-D-S-D-N-A結合染料と参照用ダイエットをプレミックス混合液に加えます。ポリメラーゼがpH 7.5から大きく外れた環境にさらされないよう、最後にPHI 29 DNA polymeraseを添加してください。変性させたテンプレートまたは標準試料10 µLと、マスターミックス10 µLを合わせ、十分に混合します。液滴は静電気やせん断応力に非常に敏感であるため、実験者は静電気の原因となる衣類を取り除き、液滴を形成する前に接地（アース）を行う必要があります。このデモンストレーションに使用したマイクロ流体デバイスは自社製であり、オイル入口1つと、液滴生成用のフローフォーカシング接合部を持つ水相入口2つを備えています。2台のシリンジポンプを使用して、界面活性剤を含むオイル 55 µLと反応混合液 20 µLのマイクロ流体チップへの流速を制御してください。20,001ナノリットルの液滴を生成する場合、最も困難な工程の一つはエマルションを乱さずに液滴を回収することです。ゆっくりと、かつ慎重にピペッティングすることが重要です。幅広のチップ（ワイドボアチップ）を使用してください。各サンプルのドロップレットをすべてPCRチューブに回収します。ワイドボアチップを用いて、非常にゆっくりとピペッティングしながら、30 µLのオイルを光学用キャップ付きの新しいPCRチューブに分注します。オイルの上に20 µLのドロップレットを転送します。容量を一定にすることで、アッセイの精度を最大限に高めることができます。キャップが緩いとオイルが蒸発するため、チューブのキャップをしっかりと閉めてください。エマルジョンが入ったチューブを扱う際は、エマルジョンからできるだけ離れたチューブの上部を持つようにしてください。等温増幅には、PCRサーモサイクラー、A-Q-P-C-Rサーモサイクラー、またはホットプレートを使用できます。本デモンストレーションでは、A-Q-P-C-R サーマルサイクラーを使用します。サンプルを30 °Cで7時間インキュベートし、75 °Cで1分間不活化させます。反応および活性化後、直ちに次へ進みます。QPCRサーモサイクラーを用いて、すべてのサンプルの蛍光レベルを測定します。各サンプルについて、dsDNA結合染料の蛍光強度をリファレンス染料の蛍光強度で除します。すべてのサンプルから背景蛍光またはテンプレートなしコントロール（NTC）の標準化蛍光を差し引きます。標準試料の補正済み蛍光測定値を用いて、線形標準曲線を作成します。テンプレートなしコントロールの標準試料は、蛍光ドロップレットが0%のサンプルの蛍光を表し、高テンプレート濃度が上限となります。蛍光測定とは、対応する標準曲線を用いて、蛍光ドロップレットが100%であるサンプルの期待蛍光値を求めることです。バルク蛍光に基づいて、陽性ドロップレットと陰性ドロップレットの中間比率を予測します。この手法では、従来のリアルタイムPCR装置を使用して、ドロップレットベースのデジタルアッセイのバルク蛍光を測定します。蛍光ドロップレットと非蛍光ドロップレットを異なる比率で予め混合し、バルク蛍光強度と陽性ドロップレットの割合との比較を行いました。予想通り、バルク蛍光強度および陽性ドロップレット数は、投入した蛍光ドロップレットの割合に比例して線形に変化しました。標準試料に基づいて予測された比率を、期待される蛍光投入分率と比較しました。直線は、線形関係を想定した場合の期待値を示しています。結果は、2桁のダイナミックレンジにわたって液滴比の定量において良好な性能を示すことがわかりました。この手法を実際の定量的な全ゲノム増幅アッセイで検証するため、デジタルドロップレットの蛍光レベルおよび陽性液滴の割合を確認しました。テンプレートとなるLambda DNAの濃度を上昇させてMDAアッセイを測定した。直線は、実験データをモデリングするためにポアソン分布を用いて算出した期待蛍光分率を示している。液滴の代表的な蛍光画像が示されており、バルク蛍光およびデジタルMDAサンプルの陽性液滴分率の両方が、液滴あたりの平均テンプレート数に応じて期待通りにスケールしており、バルクでの読み取りがデジタルアッセイの結果を忠実に捉えられることを示している。この手法は、アッセイの読み取りの高速化、並列化、および簡素化を実現することで、デジタルPCRなどの他のデジタルアッセイにも寄与します。

simple-bulk-readout-of-digital-nucleic-acid-quantification-assays

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

従来の核酸の定量方法論への実践的かつ効率的な代替案として光度計微量システムの使用は、2つの微量核酸の定量プロトコルのデモンストレーションを通して説明されています。...

核酸の光度計微量定量

この通信は、dsDNAとタンパク質定量用BioSpec -ナノUV -...

マイクロボリュームバイオスペックナノ分光光度計を用いて核酸およびタンパク質の濃度測定

このビデオでは、デュプレックスデジタルPCR(ddPCR)技術を示しています。これは、従来のPCR技術の修正版で、2つの異なる遺伝子マーカーを同時に検出するのに役立ちます。1つのPCR反応をナノリットルサイズの乳化液滴に分割し、それぞれに増幅し、液滴画分から異なる色の蛍光増幅シグナルを検出することで、標的配列の初期濃度を算出します。...

デュプレックスデジタルPCRによるデュアル遺伝マーカーの同時定量

このビデオでは、DNAサンプルの単一塩基変異を検出するためのチップインチューブ形式のデジタルPCRの有用性を示しています。1つのPCR反応を独立したPCR反応として作用するチャンバーに分割し、チャンバー内の増幅されたターゲットからの蛍光シグナルの検出を使用して、サンプル中のバリアント対立遺伝子の周波数を計算します。...

Chip-in-a-TubeベースのデジタルPCRによる単一ヌクレオチドバリアントの定量

比色アッセイのスイートが急速に区別するタンパク質、RNA、DNA、および潜在的に異種生体試料中の再ducing糖に記載されている。...

定性的には生体試料中のRNAおよびDNAを区別するために迅速比色アッセイ

腫瘍学検体の標的次世代シーケンシングのための統合システムが説明されています。このクロスプラットフォームシステムは、低品質および少量の腫瘍生検に最適化されており、低DNAインプットに対応し、十分に特徴付けられた多変量コントロールを含み、定量的な分析前品質管理手段によって通知される新しいバリアントコーラーを備えています。...

ウェットとドライベンチ・プロセスの統合は、低品質と低量腫瘍生検の標的次世代シーケンシングを最適化

色素ベースの化学および液滴デジタルPCR技術を使用した無細胞マイクロRNA定量のための高感度で正確な方法が説明されています。...

DNA結合色素化学と液滴デジタルPCRを使用したマイクロRNA定量循環

潜在性の決定の増幅とフルレングス (そのまま、欠陥) HIV-1 の proviruses の近くの 1 つのシーケンスに効率的かつ高スループット方法を提供でき、フルレングス個々 プロウイルス シーケンス (反転)レプリケーション能力。反転は、潜在的な HIV 1...

次世代シーケンシングのフルレングスの HIV-1 Proviruses 近くの増幅

アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターゲノムコピーの正確な定量は重要ですが、標準化されたプロトコルはまだ確立されていません。このプロトコールでは、精製されたAAVサンプルを調製し、デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応(dd_PCR)を実施してウイルスゲノムの力価を確実に定量するための検証済みの方法について説明します。...

デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応による精製ベクターサンプル中のアデノ随伴ウイルスゲノムの定量(英語)

このプロトコルは、ロングリードシーケンシングプラットフォームを使用して結 核菌...

ロングリードシーケンシング技術を用いたアンプリコンシーケンシング

このプロトコールでは、蛍光灯アプタマーDAP-10-42をシグナルレポーターとして利用するスプリットハイブリダイゼーションプローブの設計と、核酸検出および単一ヌクレオチド置換を持つターゲット間の分化への応用について概説します。...

DNA蛍光発光アプタマーをシグナルレポーターとして用いたスプリットハイブリダイゼーションプローブによる塩基配列特異的核酸解析

学ぶ デジタル核酸定量アッセイの簡易化手法。標準qPCR装置を用いてバルク蛍光を測定し、微小鏡検で検証する。ナノリットル液滴を用いたアクセスしやすい分子生物学技術です。

デジタル核酸定量アッセイの簡単な一括読み出し

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