Name: ミニ浸透圧の移植は、病態生理学的状態で脳の再編成を検討するためにポンプ冊子トレーサーの配達 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 学ぶミニ浸透圧ポンプ移植法による脳への治療薬持続投与と経路トレーサー注入技術。神経回復研究における皮質脊髄路伝導性の変化と脳ネットワーク再編成を評価する再現性の高い手法です。

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この作業は、Dr. Werner Jackstädt Foundation(Eduardo Sanchez-Mendoza宛)、German Academic Exchange Service(DAAD;Jeismar Carballo宛)、German Research Council (HE3173/2-1, HE3173/2-2, HE3173/3-1; to Dirk M. Hermann宛)、Heinz Nixdorf Foundation(Dirk M. Hermann宛)の支援を受けました。

動物実験は、政府の承認を得て実施した（G1361 / 13、AZ84-02.04.2013.A192およびG1362 / 13、AZ84-02.04.2013.A194; Bezirksregierungデュッセルドルフ）実験動物の管理と使用に関するNI​​Hガイドラインに基づきます。 ミニ浸透圧ポンプの調製<ol><li>無菌環境で（ すなわち 、細胞培養フード）、ポンプ、カテーテルを得るモデレータ、脳注入カニューレ及びスペーサディスクに使用される（ 図1）が流れます。 </li><li>カニューレ針の先端部のみが、心室と接触するように直接脳室への薬物の送達のための一つのスペーサーディスクを使用します。ピンセットで逆さまにカニューレを保持します。シアノアクリレート系接着剤（CA）の2滴を追加し、1スペーサーディスクをご紹介します。 </li><li>スペーサーディスクとカニューレとの間に接着剤が乾燥するように上向きに平らな面にカニューレを残します。 </li><li>約2.5センチのセクションで、カテーテルをカット。 </li><li> EAについ​​てそれは、カテーテル内の気泡の形成を防止するために、その内部に完全に、従ってすべての空気を押し出すポンプを満たすために必要とされるように、CHポンプは、関心対象の溶液の300-350μLの最小を準備する。 気泡がフローを妨げるであろう脳へのソリューションを提供します。 </li><li>慎重に流量調節にカテーテルを接続します。 </li><li>脳注入キットにより提供される針に接続された2ミリリットルの注射器を使用して、ソリューションの少し量がポンプをエスケープするまでポンプを埋め、したがって内部の気泡を防止します。 </li><li>慎重に流量調節を充填し、注意を払って、カテーテルは、カテーテルの内部に残っている泡を防止します。 </li><li>ポンプ内部の流れのモデレータをご紹介します。 </li><li>満たされたら、慎重にカテーテルの端部にカニューレを接続します。それは、気泡が形成されることが観察された場合に、カニューレを取り外して慎重にビヒクル又は薬物溶液​​でカテーテルを再充填した後、カニューレを再導入します。 </li><li> PUを配置滅菌食塩水で容器に融点と37°​​のCO / Nのままにしておきます。 </li><li>移植前に気泡形成のために再検査。必要に応じて（ すなわち、気泡が観察された）場合はカニューレを取り外し、チューブを補充します。カニューレを再接続します。これにより、ソリューションのわずか数マイクロリットルを取る必要があります。 </li></ol>ミニ浸透圧ポンプの2注入注：これらの実験のために動物を1％イソフルラン（30％のO 2、70％N 2 O）で麻酔しました。これが利用できない場合は、麻酔の腹腔内注射を使用することも可能である11。 <ol><li>麻酔下で定位装置に動物を見つけて、麻酔下ながら乾燥を防ぐために、保護軟膏で目をカバーしています。指またはピンセットで押すと後足における応答の欠如を観察することによって麻酔を確認してください。動物が完全に眠っているまで、先に進まないでください。 </li><li>彼の上に毛皮をカット広告ハサミやシェービングマシンのいずれか。肌にダメージを与えることなく、できるだけ多くをカットします。 </li><li>抗菌剤および殺菌剤の特性を有する70％エタノールと消毒剤で皮膚をきれいにしてください。 </li><li>メスで正中線の右側にわずか1cmの切開を開き、頭蓋骨を露出させます。 </li><li>綿棒で頭蓋骨をきれいにしてください。 70％エタノールでそれを浸し、頭蓋骨の上に渡します。これを乾燥頭蓋骨を誘導します。 </li><li>頭蓋骨は、光の出血がある場合は、任意の出血点を解消するために焼灼器を使用しています。血液は、カニューレが移植されると、骨の上に適切に乾燥するのCAを防ぐことができます。 </li><li>カニューレが移植される頭蓋骨のポイントにマークを作るために定位デバイスを使用してください。左半球座標上心室注入用-0.2ミリメートルの尾、ブレグマに0.9ミリメートル、横方向（ 図2A）です。 </li><li>静かに45°の角度をなす頭蓋骨の上にドリル。これは誤ってbraiに入るのドリルを防止N。繰り返し数秒間ドリルして、穴がどのように深いご確認ください。頭蓋骨が薄く、まだ完全には浸透していないされた後の掘削を停止します。 </li><li>脳への完全なアクセスが達成されるまで滅菌針の先端で髄膜を破ります。脳に損傷を与えないように静かに行ってください。 </li><li>綿棒を用いて70％エタノールで頭蓋骨をきれいにしてください。 </li><li>前 - 尾側方向に動物の皮膚の下にストレートピンセットを紹介します。ポンプが移植される動物の背中に皮膚の下のスペースを開くために鉗子を使用してください。 （ 図2B）の外側カテーテルとカニューレを残す動物の背中にポンプを導入。それが削除され、固定のいずれかの種類を必要としなくなるまで、ポンプは、この位置のままになります。 </li><li>慎重に次のカニューレ内針に接着剤の4少し滴を配置します。 </li><li>慎重に横に移動することなく、頭蓋骨を通して針をご紹介します。 15〜30秒uのための位置にそれを保持カニューレが完全に装着されているntil（ 図2C.1）。代わりに、一度つのスペーサディスクが使用されている場合、カニューレは、背腹側方向に2.5ミリメートルに達します。正しく取り付けられている場合、カニューレは、実験終了まで骨に付着したままになります。 </li><li>取り外し可能なタブの上に一本の指を置き、次にハサミのセット（ 図2C.2）との首を切断する一方を使用しています。 </li><li> 5-0縫合糸で皮膚に傷を閉じて（ 図2D）の感染を防ぐために傷の上にポビドンヨード溶液（PVP-I）の数滴を追加します。 </li><li>新しいケージに動物を移動します。まだ動作していない動物と手術動物を置かないでください。薬物投与の時間の間に彼らのケージで単独のポンプを移植された動物を保管してください。 </li><li>彼らが目を覚ましていると胸骨横臥位を取り戻しまで無人マウスを放置しないでください。 </li></ol> 3.ポンプRemovaリットル注意：通常の実験は、ポンプによって許可された配信時間の終了時に終了します、しかし、それは、薬物送達のフォローアップとして、二次の実験を行うためにポンプを除去することができます。管トレーサー注射を行うためには、ポンプを除去する必要があります。 <ol><li>麻酔下seterotacticデバイスで動物を置き、麻酔下ながら乾燥を防ぐために、保護軟膏で目をカバーしています。指またはピンセットで押すと後足における応答の欠如を観察することによって麻酔を確認してください。動物が完全に眠っているまで、先に進まないでください。 </li><li>慎重にポンプ注入の日に行って切開して切断することにより、皮膚を開きます。 </li><li>外科手術用クランプでカニューレを保持し、それを引き出します。これは、簡単に頭蓋骨から削除する必要があります。穏やかな出血が予想されるように、綿棒を配置することによって、それを停止し、1〜2分待ちます。 </li><li>カテーテルによってポンプを引き出します。彼皮膚上の圧力を作成し、それを押して出てくる、それをのlp。 </li><li> 5-0縫合糸で再び傷口を閉じて、PVP-Iの数滴を追加します。 </li><li>新しいケージに動物を移動します。まだ動作していない動物と手術動物を入れないでください。手術を受けた動物は、一緒に置くことができます。 </li><li>彼らが目を覚ましていると胸骨横臥位を取り戻しまで無人マウスを放置しないでください。 </li><li>動物が道トレーサー注入に進む前に10日間回復させます。 </li></ol>右モータ皮質に45°の角度で4圧力トラクトトレーサー注入<ol><li>麻酔下で定位デバイス上で動物を置き、麻酔下ながら乾燥を防ぐために、保護軟膏で目をカバーしています。指またはピンセットで押すと後足における応答の欠如を観察することによって麻酔を確認してください。動物が完全に眠っているまで、先に進まないでください。 </li><li>ヘッド傷を開きます。 </li><li> C言語綿棒を使用して、70％エタノールで頭蓋骨を傾きます。 </li><li>デバイスの垂直ホルダーに5μlのガラスシリンジ（26S GA）を導入。ガラスホルダーの下端が正確に保持片であることを確認します。注射器は、それが垂直位置から45度でそれを配置し、注入を実行することは不可能になりすぎて、その下にあってはなりません。 </li><li>ブレグマ上に直接注射器を向けますし、目的の座標を見つけます。ポイント＃1：0.5ミリメートル吻側と2.5ミリメートルは、ブレグマに対して横方向運動皮質座標上注射のためにあります。ポイント＃2：1.34ミリメートル吻側、ブレグマに対して2.5ミリメートル、横。 </li><li>座標が配置された後、細い先端を有するマーカーと頭蓋骨の上に自分の位置を示しています。正しい座標を隠す可能性がある過度のインクリリースと頭蓋骨で1ドットのみを行います。 </li><li>慎重に45°にドリルを保持している頭蓋骨をドリル。それは完全にPERFないようにステップ2.8のように、頻繁に頭蓋骨をチェックドリルによって引き起こされる脳の損傷を避けるためにorated。すべての骨が除去されたことを確認するために、注射器の先端を使用してください。 </li><li>シリンジに道トレーサー希釈の600 NLをロードします。 </li><li>動物の右側に向かって45°の垂直位置を調整します。顕微鏡下で、右の穴の前に、注射器の針の先端を配置します。 </li><li> 1.5ミリメートルによって垂直方向に移動します。圧力注射を行う前に1分30秒のためのこの位置に針が安定してみましょう。 </li><li> 30秒によって互いに分離100 NLの3つのステップでトレーサー希釈の300 NLを注入します。最後の注射の後、脳の外に流れるようにトレーサーを回避するために1分30秒のための安定した注射器を残します。 </li><li>ゆっくりと、注射器を引き出し二穴の上にそれを再配置し、シリンジ内にある残りの300 NLと同じプロセスを繰り返します。 </li><li>二回目の注射後、注射器を取り外し、wouを閉じるに進みます5-0縫合糸でNDとPVP-Iの数滴を追加します。 </li><li>新しいケージに動物を移動します。まだ動作していない動物と手術動物を入れないでください。手術を受けた動物は、一緒に置くことができます。彼らが目を覚ましていると胸骨横臥位を取り戻しまで無人マウスを放置しないでください。 </li><li>動物が屠殺前に10日間回復させます。 </li></ol> 5.トラクトトレーサー観測<ol><li>完全に制度ガイドラインに従って動物を麻酔。指またはピンセットで押すと後足における応答の欠如を観察することによって麻酔を確認してください。動物が完全に眠っているまで、先に進まないでください。 </li><li>標準プロトコル6の下にPBS中の4％パラホルムアルデヒド（pHが7）を用いて動物を灌流。 </li><li>脳を削除し、ポストの4％パラホルムアルデヒド中のO / Nを浸漬することによってそれを修正。 </li><li>脳が沈むまで、30％スクロース中の脳をCryoprotect。その後、脳を除去し、10秒のインマすることによって、それらを凍結液体窒素中でrsion。セクションが生成されるまで-80℃で脳をしてください。 </li><li>クライオスタットで切片によって逆行管トレーサー分析用と順行道トレーサー分析のため40ミクロ​​ンで20ミクロンでセクションを生成します。 </li></ol>注：FG標識されたニューロンは、紫外線励起下での白血球として観察することができます。 BDAは、ファイバ6,7のコントラストを向上させるために0.4％のニッケルを添加したアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体と3,3 &#39;ジアミノベンジジンでO / Nインキュベーションによって検出されます。

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<li>Arras, M., Autenried, P., Rettich, A., Spaeni, D., Rulicke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+intraperitoneal+injection+anesthesia+in+mice%3A+drugs%2C+dosages%2C+adverse+effects%2C+and+anesthesia+depth%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Med%22%5BJournal%5D)">Optimization of intraperitoneal injection anesthesia in mice: drugs, dosages, adverse effects, and anesthesia depth.</a> Comp Med. 51, 443-456 (2001).</li>
</ol>

この記事で使用するミニ浸透圧ポンプを生産DURECT株式会社が提供する生産とオープンアクセス出版手数料。

長年にわたり、虚血性脳卒中または外傷性脳損傷などの神経変性疾患の研究は、急性脳卒中期におけるニューロンの生存を促進することを目的と神経保護療法の開発に注力してきました。診療所に変換する際のげっ歯類モデルにおいて有効であることが見出されている薬物療法の大部分は失敗しました。この治療の失敗の理由としては、機能的な神経学的回復を持続する、その結果持続薬物効果の欠如に限定されるものではありません。それは長い目で脳のリモデリングを促進戦略を開発することが重要です。失敗した神経保護試験の多数によって示唆されるように、単独でニューロンの生存の促進は、成功した脳卒中の回復を可能にするのに十分ではないため、神経可塑性の刺激は最近、フィールド内の主要な関心を得ています。 薬物送達のための手段は、腹腔内注射、尾の血管内のIでありますnjection、大腿注射、単一定位脳へのベクターの注入とミニ浸透圧ポンプにより一定の送達を継続します。我々は、脳への送達のために示したようにポンプは、カニューレを持っていない、または器官指向とすることができる場合には、後者は、全身送達を含めることができます。ミニ浸透圧ポンプの例外およびウイルスベクターを使用すると、他のすべての戦略が変動する薬物濃度を誘導します。長期の実験のために、それは、このように頻繁な注射を受けたストレスに動物を提出することが必要となります。 BBBは、脳内の治療濃度を達成するために巨大なタンパク質または薬剤の投与量を必要とし、その結果、血液からのタンパク質または薬物の脳への取り込みのための重要な障害を課します。例えばペジェグリーニ監督ら（2013年）5 30グラム（300グラムのラット750 IU /日）の動物を75 IU /日に線量当量で腹腔内注射によってのrhEPOを配信。 rhEpの比較では、標的送達脳へのoを0.25マイクロリットル/時間の一定の割合に大きな時間スケールにわたって回復を達成することができました、私たちは成功した脳卒中の回復のために私たちの研究では10 IU /日のはるかに低い用量を使用することができました。 本研究では、このようにBBBを回避する、心室に直接可塑性促進タンパク質のrhEPOをお届けするために、頭蓋骨に接続カニューレとミニポンプを移植する方法を示しています。この方法によって、のrhEPOは、梗塞サイズの縮小、グリア瘢痕形成の減少及び血管形成の誘導を含む、いくつかの方法で神経学的回復を促進しました。 rhEPOはまた、ニューロンの生存を促進し、除神経赤核と顔面神経核に向かってcontralesional運動野からの投射を増加させました。繊維の発芽は運動皮質（ 図4Aおよび図5A）に順行管トレーサーBDAを注射することによって明らかにしました。繊維の発芽への機能的相関はPRです運動技能の向上（ 図5B）によってovided。さらに、我々は、管トレーサー注入のための同様のアプローチは、逆行管トレーサーFG（ 図6B）の注入により視床皮質接続を明らかにするために適用することができることを示しています。 ミニ浸透圧ポンプの製造では、ターゲットポイントとスペーサの使用を考慮することが重要です。私たちはで、針の非常に先端が与えられた座標（-0.2ミリメートルの尾、横0.9ミリメートル、2.5ミリメートル背腹で心室に接触している。この方法のように0.5ミリメートルによって、針の長さを短くするために、1つのスペーサーを使用ブレグマに対して）。深い構造は、研究の対象とされている場合は、その後、何のスペーサが必要とされません。同様に、もし複数の外部配信ポイント（すなわち、皮質）、次に以上のスペーサーディスクが必要となることが望まれます。ポンプヘッドに近づきすぎないように、それはMOUの動きを妨げますようカテーテルは、十分な長さでなければなりませんSEだけでなく、長すぎるように一度注入し、過剰な長さは、このように、マウスの自然な動きによって、カニューレの除去の危険性を増加させ、カテーテルが曲がることがありません。カテーテルの2センチ部は、インプラント（ 図1および2）の移動性及び安定性の点で非常に良好な結果を与えます。 37°のCO / Nにおけるポンプのインキュベーションは、ポンプが直ちに注入の瞬間に脳内に薬剤をポンピング開始することができます。 ミニ浸透圧ポンプの移植では、頭蓋骨が適切にカニューレを移植する前に乾燥されることを保証することが重要です。通常、乾燥する骨を誘導する70％エタノールで洗浄するが、連続的な出血が見つかった場合、焼灼器で穏やかに頭蓋骨をタッチすると、完全に乾燥します。これは、針の導入が可能な限り垂直と遅いことを保証することが重要です。一度位置で、かつ接着剤が乾燥している間、カニューレの上に指を置くと、OV横に移動するのを防ぎますえー頭蓋骨。特別なケアは、カニューレの傷や配置に与えられるべきです。それは、切開が正確に頭蓋骨の中央ライン上ではなくやや右側に行われていないことが重要です。創傷を閉鎖すると切開が中間線で行われた場合、皮膚は、このように創傷開口のリスクを増加させ、過延伸になります。片側にわずかに切開を作ることは、縫合ポイントはカニューレの最も高い部分から離れてできるようになります。結果として、そこに縫合点にはあまりの緊張になり、傷が適切に治癒します。動物だけではケージに入れ、特に移植後の最初の10〜15日の間、毎日チェックする必要があります。巻か裂開の場合は、傷ができるだけ早く閉じする必要があります。カニューレが除去されるか、動物が感染を示した場合、実験を終了しなければなりません。カニューレの再注入は推奨されません。移植の成功は、組織の広告の適切な量を使用することは非常に重要ですhesive（あまりない！）、それが骨を劣化させ、カニューレの除去のリスクを増大させるように。しかし、あまりにも少ない接着剤を用いても、骨に取り付けられたカニューレを保持しています。ミニ浸透圧ポンプは、溶媒は、生体適合性であるこれにのみ制限され、多種多様な物質に溶解薬を運ぶことができます。さらに、ボリュームが小さいことを考えると（200μL）1は、実験に必要な濃度が適しているかどうかを判断しなければならないし、ポンプ内部の降水量が発生することはありません。 順行または逆行性トレーサーのいずれかを使用したトレースの道は、脳の接続性と可塑性を研究するために非常によく確立された技術です。一つは勉強したい脳の領域をターゲットに正確さを保証するために注入する場合には注意が使用定位フレームに与えられなければならない（皮質を注入する際、すなわち 、脳梁に注射を防ぐため）。 すべての外科的介入のための痛みを軽減するために、と炎症は、動物は介入後3日間一日一回に4mg / kgの介入とCaprofen前には0.1mg / kgのブプレノルフィンで治療すべきです。 結論として、このアプローチは、脳の可塑性の研究のために適している方法を示す、損傷した脳内のタンパク質または薬理学的化合物の効果を研究するための適切なツールを提供します。

脳へのタンパク質と薬理学的化合物の送達は、脳疾患の根底にあるメカニズムを研究し、新しい治療法の候補分子を評価するための重要な戦略です1,2。実験神経科学では、プラスミドやアデノウイルスなどのベクターの送達は、脳内のタンパク質の長期的な作用を研究するための重要なツールとなっています3,4。ベクターの単回注射は、それ自体が脳内の治療薬の非常に安定したレベルを維持するシステムの利点を提示する4。しかし、精製薬物を用いた長期実験では、腹腔内注射による全身投与はマウスやラットにストレスを誘発し、標的を絞った脳応答が必要な場合には最適な選択ではなく、大量の薬物も必要とする5。Miniosmoticポンプは、薬物の送達が脳内の標的の場所に直接起こり、選択されたポンプモデルによって決定される一定の流量で行われるため、脳への低いアクセス可能性と薬物濃度のピークの両方を回避することにより、脳への長期にわたる直接薬物送達のための理想的なシステムを表しています2,6,7。実際、このシステムにより、組換えヒトエリスロポエチン(rhEpo)や血管内皮増殖因子6,7などのいくつかの薬剤を送達することにより、脳卒中後の脳の回復を成功裏に研究することができました。
脳の可塑性は、脳の損傷に反応して接続を再配線するために不可欠です。可塑性は、シナプス接触の形成または排除、樹状突起スパインの成長、および長距離接続の伸長または収縮8,9に及ぶ広範な概念である。これまで、脳は病変後に接続を再構築する能力がないと考えられていました。しかし、多くのアプローチでは、適切に刺激されれば、接続性を再確立できることが示されています6,7,10。これを研究するために特に役立つ手法の1つは、トラクトトレーサーの使用です。前向性路トレーサーは、体細胞でニューロンに入り込み、軸索が標的構造に到達するまで軸索全体に分布する化合物です。2つの例は、カスケードブルー(CB)とビオチン化デキストランアミン(BDA)です。逆に、コレラ毒素B(CTB)やフルオロゴールド(FG)などの逆行性トラクトトレーサーは、軸索終末を介してニューロンに入り、体細胞に再び分布するため、注射部位を標的とするニューロンの起源部位が明らかになります。
ここでは、神経可塑性に潜在的な影響を与える可能性のあるタンパク質や薬物を直接送達するためのミニ浸透ポンプの移植方法と、運動皮質への入力と出力の接続を明らかにするためのBDAとFGの注入に使用する方法を紹介します。BDA は、脳卒中後に rhEpo 治療下で co から出現する軸索の可塑性の増加を示すために使用されるトラクト トレーサーの例としても使用されます。

<table><tbody><tr><td>Alzetミニ浸透ポンプ。モデル2004。</td><td>Alzet</td><td>000298</td><td>Drug container</td></tr><tr><td>Brain Infusion kit 3 1-3 mm</td><td>Alzet</td><td>0008851</td><td>Drug Brain delivery system</td></tr><tr><td>Loctite&nbsp; 454 プリズムゲル&nbsp;</td>頭蓋骨75Nガラスシリンジへのカニューレ接着用の<td>ロックタイト</td><td>45404</td><td>シアノアクリレート接着剤</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>ハミルトン</td><td>87900/00</td><td>トラクトトレーサービ</td></tr><tr><td>オチンデキストランアミン(10,000 MW)</td><td>の注入分子プローブ</td><td>N-7167</td><td>前行性トラクトトレーサー</td></tr><tr><td>フルオロゴールド</td><td>フルオロクロム、LLC。</td><td></td><td>逆行性トラクトトレーサー</td></tr><tr><td>五分位定位固定装置インジェクター(QSI)</td><td>ストールティング</td><td>53311</td><td>座標決定、ポンプ注入、トラクトトレーサー注入のための定位装置です。</td></tr></tbody></table>

ミニ浸透圧の移植は、病態生理学的状態で脳の再編成を検討するためにポンプ冊子トレーサーの配達

Implantation of Miniosmotic Pumps and Delivery of Tract Tracers to Study Brain Reorganization in Pathophysiological Conditions

脳疾患の動物モデルにおける薬理学的治療は、動物にストレスを誘発し、薬物の組織レベルを無常化させる可能性のある反復注射プロトコルの問題を課します。さらに、脳への薬物送達は血液脳関門(BBB)のために繊細であるため、全身投与後の選択的薬物の脳内濃度が大幅に減少します。したがって、ピークレベルのない一定の薬物送達とBBBの回避の両方を可能にするシステムは、BBBに対して不透過性の薬物の十分に高い脳内濃度を達成するためのものである。この文脈では、ミニ浸透圧ポンプは、動物における日常的な注射ストレスの問題を回避し、薬物の直接的な脳送達にも使用できる、固定された既知の速度で一定の薬物送達のための理想的なシステムを表しています。ここでは、この技術をうまく適用するために動物に与えるべきミニ浸透ポンプ移植と術後ケアの方法について説明します。私たちは、C57BL6マウスの脳内の神経可塑性を研究するために使用される標準的な手順に、前述の実験的パラダイムを組み込みます。そこで、動物を30分間脳梗塞に曝露し、カニューレを介して頭蓋骨に接続されたミニ浸透ポンプを移植して、可塑性促進薬を送達しました。行動テストは、治療の30日間に行われました。除去後、動物は回復の慢性期におけるニューロンの可塑性を分析するために、前向性トラクサーの注射を受けました。その結果、送達された薬剤による神経保護は、標的構造で脳の正中線を横切る運動線維の増加を伴うことが示されました。この結果は、現代の神経科学における薬物投与と脳の可塑性研究におけるこれらの技術の価値を裏付けています。

我々は左線条体病変を誘導腔内縫合法により中大脳動脈閉塞の30分に動物を提出してから3日後に開始する30日の間にミニ浸透圧ポンプ（ 図1、 図3）を用いて、脳に直接のrhEPOを配信しますストローク6。 図4は、CBとBDA注入とトレーサーを注入した領域の後に追跡した皮質脊髄路の概略図を示します。我々は、それぞれのrhEPO送達の14及び42日後に握力とモータの性能（ 図5）の改善を示しました。左線条体にストロークを受けた動物の権利運動野にBDAの送達は、発芽として繊維の染色に成功を実証し、赤と顔面神経核（ 図5）のレベルでミッドラインを横切る運動神経線維の増加を示しましたminiosmotでの薬物治療の結果ICポンプ。 rhEPO処置はまた、びまん性星状細胞増加を遅延グリア瘢痕形成を減少させ、研究期間6における血管新生を増加し、ニューロンの生存を増加させました。管トレーサー注射のためにこの同じ技術を使用して、我々は正常に逆行管トレーサーFG（ 図6）を注入することにより皮質に接続されている視床核を検出することができます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig1.jpg" /> 図このプロトコルで使用されるミニ浸透圧ポンプの1コンポーネント。スペーサーディスク、カニューレと取り外し可能なタブ、カテーテル、流れモデレータとミニ浸透圧ポンプを観察することができます。完全に組み立てられたポンプの側面は、 図2Aに見ることができる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> ithinページ= &quot;1&quot;&gt; <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig2.jpg" /> ポンプ注入キーポイントの2概要図。その隣に完全に構築ミニ浸透圧ポンプを用いて定位デバイスに配置として（A）マウスが示されています。矢印は、移植のために選択された座標を示している。（B）ポンプは、動物の背中に導入されており、唯一のカニューレが外側に残ります。移植後の頭の頭蓋骨が既に掘削されている。（C）アスペクト。（C.1）カニューレが位置にあるが、取り外し可能なタブがカットされていません。（C.2）取り外し可能なタブはカットし、ステッチのされています傷は今開始することができます。（D）アスタリスクは30日、移植（＃）の後に動物に比べて、最近移植動物を示しています。正しく収容されたときの画像に示すように、傷は、プロシージャが終了するまで、閉じたままにしてください。ove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig2large.jpg「ターゲット= &quot;_空白&quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig3.jpg" /> 皮質に移植部位を示す図3.ニッスル染色。小切開は、左皮質（矢印）の一部に観察することができます。浸透した領域の幅は約50μmです。ザは、対応する反対側の面積（*）と比較して、ニッスル染色に基づいて明白な重篤な組織の変更はありません。 R：右半球。 L：左半球。スケールバー=300μmの。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig4.jpg" /> 図4.トラクトReitmeier らによって以前に公開されたトレーサー注入戦略。6,7。 （A）CBのに対し、反対運動皮質で道トレーサーBDAの回路図を示す注射部位は、梗塞半球の運動皮質に注射しました。繊維が示されている赤核（図示せず）と、顔面神経核（ 図5参照）。（B）次の運動皮質に順行管トレーサーBDAの注射部位に追跡しました。黒い矢印は、BDAで標識されたいくつかの皮質細胞を示しているのに対し、針トラックを示す赤い矢印に注意してください。 CX：皮質。 CC：脳梁。 V：心室。 FN：顔面神経核。 B = 200μm単位のスケールバー。 図4（a）は、一種の許可6で再生される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <iMG ALT = &quot;図5&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52932 / 52932fig5.jpg&quot; /&gt; rhEPOの納入後脳梗塞の図5.回復。（A）BDAはその後、顔面神経核（ブレグマ-6.3 mmまで-5.8ミリメートル）のレベルで皮質延髄線維内で検出されたcontralesional運動皮質に注入。各半球の交差線が正中線とipsilesionalとcontralesional半球の方向の各ラインを横切る繊維に平行に描かれたがカウントされ、皮質脊髄路の総ラベル繊維のパーセンテージとして表しました。 contralesional顔面神経核データの方向に繊維交差を増加エリスロポエチンは+手段です - SD。データは、ビヒクル処置非虚血マウスと比較し§P&lt;0.05、ANOVAは最下位の差の検定に続いて、一方向により分析した。（B）モータの動作では、ロタロッドテストにおける手の握力と調整の改善を示しました。データは、平均バリューですES + - SD。データは、各時点のために、一方向ANOVA /最小有意差検定を行い、双方向の反復測定ANOVAによって分析しました。 §P&lt;虚血前のベースラインと比較して0.05​​。 * P &lt;媒体処置虚血マウスと比較して0.05。 図5AおよびBは一種の許可6で再現されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52932/52932fig6.jpg" /> 図6.ターゲット構造は、フルオロゴールド（FG）の注入後に到達した。（A）運動皮質の隣FGの注射部位図1に示すように、針トラックとのいくつかの標識された細胞を示す白い矢印を示す赤い矢印に注意してください。皮質。（B）FGはモーターの近くに注入皮質はVPLで検出されます。 Fiの：采。 IC：内部のカプセル。 RT：視床網様核。 VPL：視床腹側後側部の核。スケールバー=200μmである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52932/52932fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

病的な条件下での脳の再編成を研究するために、血液脳関門を迂回して脳に直接タンパク質を送達するためのミニ浸透ポンプを使用しました。次に、トラクトトレーサーを注入して、タンパク質の影響下での脳の接続性の変化を研究します。

Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and ...

本手順の総合的な目的は、治療薬を脳に届けるためにミニ浸透圧ポンプを植え込み、次いで路標染料（トラクトトレーサー）を投与して、皮質脊髄路の伝導性の変化を調べることです。この手法は、潜在的な治療薬の存在下で中枢神経系内の長距離接続がどのように変化するかなど、神経再生研究分野における重要な疑問への回答に寄与します。これらの手法の主な利点は、治療薬を継続的に投与することで結果の再現性が得られる点であり、また路標染料は長距離接続における形態学的変化を追跡するための非常に信頼性の高い薬剤である点にあります。一般的に、これらの手法に不慣れな方は、さまざまな介入による脳損傷を防ぐために精密さと外科的な技術が不可欠であるため、習得に苦労します。ここでは、Hammond教授の研究室の大学院生であるJeismar Carballoとともに、手順を実演します。まず、無菌環境でミニ浸透圧ポンプを準備することから始めてください。まず、ピンセットを用いて脳注入用カニューレを逆さまに保持します。次に、シアノアクリレート系接着剤を2滴加え、脳室への薬剤投与用のスペーサーディスクを1枚挿入します。続いて、カテーターを2.5 centimetersの長さに切断し、フローモデレーターに慎重に接続します。次に、気泡の発生を防ぐため、針を接続した2 milliliterのシリンジを用いて、少量の溶液がポンプから出るまでポンプ内を満たします。その後、フローモディレーターとカテーテルに慎重に充填し、カテーテル内部に気泡がないことを確認してください。最後に、フローモディレーターをポンプに取り付けます。充填後、カニューレをカテーテルの先端に慎重に接続し、ポンプを滅菌生理食塩水の入った容器に入れ、37 °Cで一晩放置します。承認されたプロトコルに従って動物を麻酔し、後肢へのピンチ刺激に対する反応がないことで麻酔状態を確認した後、動物を脳定位固定装置に設置します。乾燥を防ぐため、保護用軟膏で目を覆ってください。また、頭部の被毛を皮膚にできるだけ密着するように刈り取り、70% ethanolおよび抗菌・抗真菌作用のある消毒剤で皮膚を洗浄します。メスを用いて正中線からわずかに右側に1 cmの切開を加え、頭蓋骨を露出させ、70% ethanolに浸した綿棒で洗浄します。ブレグマ上のステレオタキシスアームを切り離した後、ステレオタキシスアームを操作して、脳室を標的とする座標まで移動させます。頭蓋骨上のこの点に印を付けます。脳への不慮の損傷を防ぐため、ドリルを45度の角度に傾けて、この点を慎重に穿孔します。数秒間ドリルを当てては穴の深さを確認することを繰り返します。頭蓋骨が薄くなったところで、完全に貫通する直前にドリリングを停止し、滅菌針の先端で髄膜を破り、脳へのアクセス経路を確保します。次に、動物の皮膚の下にストレート鉗子を前尾方向に挿入し、ポンプを植え込む動物の背中の皮下空間を広げます。カテーテルとカニューレを外に出した状態で、ポンプを動物の背中に挿入します。カニューレの針の隣に、接着剤を少量ずつ4滴慎重に滴下します。次に、針を左右に動かさないよう注意しながら、頭蓋骨を通して慎重に挿入します。カニューレが完全に固定されるまで、15～30秒間その位置で保持します。ポンプ針を挿入する際は、慎重かつ正確に行うことが重要であり、また動物によって脱落することなく投与期間を完遂させるため、カニューレが頭蓋骨に適切に固定されていることを確認してください。次に、取り外し可能なタブの上に指を置き、狭い部分をハサミで切り取ります。最後に、5-0縫合糸で切開部を閉鎖し、閉鎖した切開部をポビドンヨード溶液で消毒します。動物を清潔なケージに移し、胸立位に戻るまで観察します。薬剤投与期間中は、動物を単独飼育してください。前述と同様に動物を準備し、麻酔をかけて定位固定装置に固定した後、ポンプ植込み時に使用した切開線に沿って皮膚を切開し、外科用クランプでカニューレを保持して、図のように引き抜きます。頭蓋骨から容易に取り外せるはずです。綿棒を患部に1〜2分間押し当て、止血します。カテーテルを掴み、カテーテルを引きながら同時にポンプを押し出すことで、ポンプを取り除きます。ポンプを取り出した後、前回と同様に創傷部を縫合し、ポビドンヨード液を数滴塗布します。動物を清潔なケージに移し、自力で動けるようになるまで観察してください。ミニ浸透圧ポンプの除去から10日後、動物を麻酔し、再び定位固定装置に固定して、頭部の創傷部を開きます。70%エタノールで頭蓋骨を洗浄します。5 µLガラスシリンジを脳定位固定装置の垂直ホルダーに適切に装着します。シリンジをブレグマの直上に合わせ、目的の座標まで移動させて運動皮質に注入します。細いチップのマーカーを用いて、この点に印を付けます。次に、シリンジを2番目の点に移動させ、そこに小さな印を付けます。ドリルを45度の角度に保持しながら、両方の点を慎重に穿孔します。繰り返しになりますが、頭蓋骨を完全に貫通させないように注意し、針の先端を用いて残りの骨を取り除きます。シリンジにトレーサーを600 nanoliters充填します。次に、針の位置を調整し、頭蓋骨の右側で45度の角度に設定します。手術用顕微鏡で観察しながら、針先を穴の直前に配置し、脳内に1.5 mmの深さまで挿入します。表示されている速度はデモンストレーション用です。通常は、0.5 mm進めるごとに30秒間待機してください。針を30秒から1分間そのまま留めておきます。ご覧いただいた通り、トラクトトレーサー注入時の針の刺入方向を外套膜側からにすることで、誤った領域を標的にすることを避け、個体間で結果に混乱が生じるのを防ぎます。針をゆっくりと抜くことで、トレーサーの逆流を防ぐことができます。次に、トレーサー300 nanolitersを、30秒の間隔を空けて100 nanoliterずつ3回に分けて注入します。最後の注入後、シリンジを30秒から1分間そのまま保持し、その後ゆっくりと引き抜きます。シリンジの先端を2番目の穴の上に配置します。前と同様に針を刺し、シリンジに残っている300 nanolitersを繰り返し注入します。2回目の注入後、シリンジを抜き、5-0縫合糸で傷口を閉じます。再び、動物を清潔なケージに入れ、麻酔から回復するまで観察した後、飼育室に戻します。動物に30分間の中大脳動脈閉塞を行い、左線条体に病変を誘導した。3日後、リコンビナントヒトエリスロポエチンをミニ浸透圧ポンプを用いて30日間投与した。梗塞側の半球にCascade blueを、対側半球にビオチン化デキストランアミンを注入した。神経線維を顔面神経核まで追跡した。対側病変側の運動皮質に注入したBiotin dextran amineは、皮質延髄路の線維に検出された。同側病変側および対側病変側の半球へ向かう線維をカウントし、皮質脊髄路における全標識線維に対する割合として算出した。エリスロポエチンは、対側顔面神経核に向かう神経線維の交差を増加させました。組み換えヒトエリスロポエチンの投与後、運動機能においては、虚血前のベースラインと比較して握力の改善が認められました。また、ロータロッド試験で評価した運動協調性についても、組み換えヒトエリスロポエチンの投与後に改善が見られました。この手法を習得すれば、適切に実施することで、1件の手術につき30分未満で完了させることができます。本処置を行う際は、脳への感染を防ぐため、ポンプの調製時および手術中に十分な無菌状態を維持することが重要です。順行性および逆行性軸索トレーサーの使用は、安全かつ低コストな手法であり、健康時および疾患時の双方における脳のコネクティビティを理解することを可能にします。このビデオを視聴することで、ミニ浸透圧ポンプの植込みと摘出、およびトラクトトレーサー注入の手順について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

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