Name: 抗腫瘍特性を有する好中球の単離とキャラクタリゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: 学ぼう、密度勾配法による好中球単離とルシフェラーゼ標識腫瘍細胞との共培養を用いた抗腫瘍活性評価法。非特異的活性化を最小限に抑え、放射線不使用で細胞生存率を測定する革新的アプローチです。

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ZGはイスラエル科学財団（助成金番号11分の41）のI-COREプログラムからの助成金によってサポートされ、Abisch·フレンケル財団、Rosetrees信託、イスラエル癌研究財団（ICRF - 研究キャリア開発賞）とCONCERNファンデーション。 ZGFはイスラエル癌研究財団（ICRF - 研究キャリア開発賞）からの助成金によってサポートされ、保健のイスラエル省イスラエル肺協会のチーフサイエンティスト。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

好中球は、すべての白血球の最も豊富であり、感染症や炎症の場合には最初の対応です。そのようなものとして、それらは、外部の合図に非常に敏感であり、容易に活性化されます。また、好中球は非常に短い半減期および迅速なターンオーバーを持っています。一緒に、これらの特性は、ユニークな実験的な戦略が必要とされるように、好中球での作業のいくつかの困難を、上げます。例えば、いくつかの好中球の精製戦略は、独自の長所と短所とのそれぞれは、存在します。 好中球での作業における重要なステップは、全血からの精製です。好中球は、効率的に密度勾配または抗体ベースの戦略（正または負の選択）のいずれかを用いて精製することができます。選択の私たちの方法は、最小限の非特異的活性化と高度に精製された好中球の高い数を得られるので、密度勾配を使用することです。しかし、我々は最近の研究21に示すように、ウィット時間腫瘍進行好中球、単核、低密度画分に高い数値に蓄積します。これらの条件下での密度勾配の使用は、全体の循環好中球のレパートリー、及び高他の単核細胞（リンパ球および単球）で汚染された低密度の好中球の割合を...

好中球は、最初に侵入微生物に対する最初の行の防御として機能する自然免疫細胞として特徴づけられました。今日では、好中球は造血3の調節、外来抗原1,2-に対する適応免疫応答をマウントに関与している多くの広範囲の機能を有することが知られている血管新生4,5創傷治癒します。さらに、好中球は、それらのプロ及び抗腫瘍活性6,7によって腫瘍の増殖および転移の進行に影響を及ぼし得ます。好中球は、多型、セグメント化、核によって特徴付けられる（したがって、多形核（PMN）白血球と呼ばれる）と、少なくとも3顆粒の別個のサブクラスならびに分泌小胞8（ 図1A-C）を含有します。 好中球は、高い貪食能と微生物の除去のための重要な高NADPHオキシダーゼ活性を有しており、時のための重要なケモカインの広い範囲を分泌します炎症8,9の部位に付加的な好中球および他の免疫細胞の牽引。好中球は、Toll様受容体（TLR）を含む表面受容体の多量の発現を特徴とする、C型レクチン受容体（のCLR）は、受容体3（のCD11b / CD18）、および他の接着分子（ 例えば、L-セレクチンを補完しますLFA-1、VLA-4および癌胎児性抗原関連細胞接着分子3（CEACAM3 / CD66b））、ケモカイン受容体（ 例えば、CXCR1、CXCR2、CCR1、CCR2）、化学誘引物質受容体（ 例えば、PAFR、LTB 4 RとのC5aR） 、サイトカイン受容体（ 例えば、G-CSFR、IL-1R、IL-4R、IL-12R、IL-18R、TNFR）、ホルミルペプチド受容体（ 例えば、FPR1-3）、およびFc受容体（ 例えば、CD16（FcγRIIIをヒト好中球はのCD11b、CD15、CD16およびCD66b白血球マーカーを用いて同定されるのに対して）、CD32（のFcγRII）およびCD64（FcγRIで）10。マウスでは、好中球は通常、のCD11b + Ly6G +として同定されています。また、一般的に組織中の好中球の検出のための顆粒タンパク質のミエロペルオキシダーゼ（MPO）と好中球エラスターゼ（NE）のために染色する受け入れられています。 これは、好中球の多様な機能が同じ細胞により、または異なる細胞亜集団によって媒介されるかどうかはまだ不明です。蓄積データは、プロ炎症性刺激と微小環境11,12の影響を受けて可塑性の高度を示す異種好中球集団の存在を示唆しています。 Fridlender ら 13は、2つの主要な亜集団に癌において好中球を著しく分割しているプロ腫瘍特性を有する抗腫瘍特性を有するN1およびN2と呼ばれます。癌において、ならびに慢性炎症において、T細胞応答14を抑制顆粒骨髄由来サプレッサー細胞（G-たMDSC）からなる追加の亜集団が存在します。 G-のMDSCはのCD11b + Ly6Cによって特徴付け未熟骨髄細胞であると考えられていますマウス15で低 Ly6G こんにちは表現型、ヒト16でCD15 + / CD16 低の表現型を有しながら。 G-たMDSC通常よりもサイトカインおよびケモカインのより低いレベルは、好中球を循環させながら、アルギナーゼおよびミエロペルオキシダーゼのより高いレベルを発現します。彼らはあまり食作用および移動であるが、ROS 15,17,18の高いレベルを生成します。本論文では、抗腫瘍特性を有する好中球の単離および特徴付けのためにいくつかの基本的な方法論を説明します。 （45から70までパーセント; 1,800 - 6,000 /μl）を好中球は、ヒトの循環内のすべての白血球の最大の人口を構成しているが、マウスでは、通常の条件下で、彼らは（10むしろ疎である - 15％、300から500 /μL ）。慢性炎症7の状態を示して着実に炎症時に時折癌における好中球数が増加します。好中球は多能骨髄系共通前駆体（CMP）CEから発生します骨髄中のLLS、骨髄芽球の段階を通過する分化プロセス（MB）を介して、前骨髄球（PM）、骨髄球（MC）、後骨髄球（MM）とバンド細胞（BC）8。それらは循環8に放出される前に7日-成熟した、有糸分裂後の好中球は4のための骨髄内に残ることがあります。炎症状態の下で延長することができる12時間、 - 血液中の好中球の売上高は6の平均半減期は、通常、迅速です。非刺激好中球は、ホルボールエステルホルボール12にそれらを暴露することにより、抗腫瘍形成活性、ケモカインIL-8（CXCL2）、CCL2、CCL5およびCXCL5 6,19または人工的にナイーブな好中球を露出することによって取得することができる機能を制限してきました-myristate 13-アセテート（PMA）6。 一緒に好中球の数が少ないと血液の好中球の半減期が短い（〜3から5×10 5）ナイーブ6 1mlの血液から達成- 8週齢のマウス、それを作りましたin vitroでマウスの好中球を循環させる機能を探索することは困難。この困難を克服するために、他のソースが使用されています。例えば、好中球の多くは、（チオグリコレート培地またはザイモサンAの腹腔内注射後に、 例えば ）骨髄20または無菌性炎症の誘導後腹膜から得ることができます。これは、腹腔から得られた好中球は、任意の抗腫瘍形成活性（未発表の観察）を及ぼさないことに留意すべきです。 Granot ら 6 20れるよう、マウス4T1乳癌細胞株を用いて同所接種したBALB / cマウスは、腫瘍進行6（ 図2A）で悪化好中球増加症を発症することが観察- 40万人の血液好中球は容易に1ミリリットルの血液から単離することができます3から4週間後、腫瘍接種。これらの好中球は、抗腫瘍活性を獲得し、それに応じてCOIされていますナイーブ好中球6（ 図2B）と区別するために定義される腫瘍連行好中球（TEN）、。高密度の好中球（HDN、 図1（a））は非常に抗腫瘍形成であるが、癌との関連で発生した低密度の好中球（LDN、 図1B）は 21ではありません。また、腫瘍を有するマウスの骨髄および脾臓から高密度の好中球は、抗腫瘍活性（未発表データ）を有しています。これは、好中球の量が増加すると、腫瘍の進行に脾臓を徐々に拡大（脾腫）となることに留意すべきです。 これは、10にも自発的な（MMTV-PyMTおよびMMTV-Wnt1の乳腺腫瘍とのK-ras駆動肺腫瘍）の両方を含む癌の他のモデルで生成され、AT-3（MMTV-PyMT）とE0771の乳癌（注入されることに留意すべきです細胞、LLCルイス肺癌細胞およびB16-F10黒色腫細胞）。しかしながら、これらのTUMでの好中球動員の、程度3週間後に1ミリリットルの血液中の10×10 6好中球-またはモデルが5に達し、4T1-接種されたマウスのよりもはるかに少ないです。

<table><tbody><tr><td>細胞株</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>マウス 4T1 乳がん細胞</td><td>ADCC</td><td>CRL-2539</td><td>増殖培地: DMEM + 10% 熱不活化 FBS</td></tr><tr><td>プラスチック製品および機器</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24 ウェル組織培養プレート&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>100 mm 組織培養プレート&nbsp;</td><td>コーニング</td><td>430167</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>25 cm2 組織培養フラスコ</td><td>Nunc</td><td>156340</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>90 mm 細菌グレード培養皿&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Israel</td><td>20090-01-017</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>15 ml 滅菌円錐形遠心分離チューブ&nbsp;</td><td>Miniplast、Ein Shemer、イスラエル</td><td>835015-40-111</td><td></td>滅菌</tr><tr><td>50ml滅菌円錐形遠心分離チューブ&nbsp;</td><td>Miniplast, Ein Shemer, Israel</td><td>835050-21-111</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Falcon 12 x 75 mm 丸底ポリスチレンチューブ&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>352058</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Millicell 24 マイグレーションプレート、孔径 5μ;m&nbsp;</td><td>Merck Millipore</td><td>PSMT010R1</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>ホワイト 96 平底ウェルプレート&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3917</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>セルストレーナー (40 mm)&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>20G x 1.5" ニードル</td><td>BD Microlance 3&nbsp;</td><td>301300</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>23G x 1インチ針&nbsp;</td><td>BD Microlance 4</td><td>300800</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>25G x 5/8" 針&nbsp;</td><td>BD Microlance 5</td><td>300600</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>0.3 ml シリンジ 30G x 8mm ニードル付き</td><td>BD Micro-Fine Plus Demi</td><td>320829</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>9 mm クリップ&nbsp;</td><td>BD、オートクリップ&nbsp;</td><td>427631</td><td>滅菌済み</td></tr><tr><td>EasySepマグネット&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>MACS LS 分離カラム&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-201</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>MidiMACS セパレーター マグネット</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライドガラス&nbsp;</td><td>メンゼル-GL&auml;serスーパーフロスト&nbsp;Plus Thermo</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Orbital Shaker&nbsp;</td><td>スカイライン ELMI</td><td>S-3.02.10L</td><td></td></tr><tr><td>プレートリーダー&nbsp;</td><td>TECAN</td><td>InfiniteF200Pro</td><td></td></tr><tr><td>POWDER</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA), フラクション V</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>ブロモデオキシウリジン (BrdU)&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td></td><td>550891 滅菌</td></tr><tr><td>CFSE (5-(および 6-)-カルボキシフルオレセイン ジアセテート、スクシンイミジルエステル)</td><td>Molecular Probes</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>Dextran T500</td><td>Sigma</td><td>31392</td><td></td></tr><tr><td>Heparin sodium salt from porcine intestinal mucosa&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム (NaN3)</td><td>Sigma</td><td>S8032</td><td>毒性が高く、取り扱いには注意が必要です</td></tr><tr><td>チオグリコール酸粉末&nbsp;</td><td>Difco</td><td>225650</td><td></td></tr><tr><td>Zymosan A</td><td>Sigma</td><td>Z4250</td><td></td></tr><tr><td>メディアとサプリメント</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコの修正イーグル培地 (DMEM)</td><td>シグマ</td><td>D5796</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>Opti-MEM&reg;減らした血清中&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>31985062</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Foetal ウシ血清 (FBS), 熱不活性化</td><td>Sigma</td><td>F9665</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-020-1A</td><td>Sterile</td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-042-1B</td><td>滅菌ペ</td></tr><tr><td>ニシリン ストレプトマイシン x 1000 溶液</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-031-5</td><td></td></tr><tr><td>Mg2+ および Ca2+&nbsp;</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>02-023-1</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ および Mg2+&nbsp;</td><td>バイオロジカルインダストリーズ、ベス・ハエメク、イスラエル</td><td>02-023-5A</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>HPLCグレードの水&nbsp;</td><td>J.T.ベイ</td><td>カー4218-03</td><td>オートクレーブ</td></tr><tr><td>ソリューション</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACK&ndash;塩化アンモニウム・カリウム</td><td>ライフテクノロジーズ&nbsp;</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>PBS中のブロモデオキシウリジン(BrdU)溶液(10 mg / ml)</td><td>BrdU10 mgを1 mLのPBSおよび滅菌フィルターに溶解します。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFSE、DMSO</td><td></td><td></td>中の5 mM <td>2.8 mgのCFSEを1 mLのDMSOに溶解します。滅菌済みの200mlチューブで10mlのアリコートに分け、-20oCで暗所で保存します。</td></tr><tr><td>Eosin Y solution</td><td>Sigma</td><td>HT110-2-32</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' balanced salt solution</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>02-016-1A</td><td>滅菌</td></tr><tr><td>ヘパリン、PBS</td><td></td><td></td>に20mg/ml ヘ<td>パリン100mgを5mlの滅菌PBSに溶解し、0.2mmフィルターに滅菌フィルターを通します。&nbsp;</td></tr><tr><td>Histopaque-1119&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>11191</td><td>0.2mmフィルターを通した滅菌フィルター。</td></tr><tr><td>Histopaque-1077&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>10771</td><td>0.2mmフィルターを通した滅菌フィルター。</td></tr><tr><td>ルシフェラーゼ細胞培養溶解バッファー x5</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>使用直前に滅菌水で1:5に希釈してください。</td></tr><tr><td>ルシフェラーゼアッセイ溶液</td><td>プロメガ</td><td>E1501</td><td>ルシフェラーゼアッセイ基質粉末(E151A)とルシフェラーゼアッセイバッファー(E152A)メ</td></tr><tr><td>イヤーのヘマトキシリン溶液が含まれています&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>MHS-32</td><td></td></tr><tr><td>PBS + 0.5% BSA</td><td></td><td></td><td>2.5 g BSAを500 ml PBSに溶解し、0.2 mmフィルターで滅菌フィルターを通します。</td></tr><tr><td>PBS + 1% BSA</td><td></td><td></td><td>1g BSAを100mlのPBSに溶解し、0.2mmフィルターで滅菌フィルターを通します。</td></tr><tr><td>2.5% BSA</td><td></td><td></td>入り5x PBS <td>12.5g BSAを250mlの滅菌HPLCグレードの水と250mlのPBSx10の混合物に溶解し、滅菌フィルターを0.2mmフィルターに通します。</td></tr><tr><td>0.5% BSAと2 mM EDTA</td><td></td><td></td>を含むPBS <td>250 mg BSAを50 mlの滅菌PBSに溶解し、0.5 mLの0.5M EDTA pH 8.0の200 mlを0.2 mmフィルターを通して滅菌フィルターに加えます。</td></tr><tr><td>FACS緩衝液(0.5%BSA、2mM EDTAおよび0.02%NaN3)</td><td></td><td></td><td>250 mg BSAを50 mlの滅菌PBS&nbsp;に溶解し、200 mlの0.5M EDTA pH 8.0および500 mlの2%NaN3、0.2 mmフィルターを通して滅菌フィルターを加えます。</td></tr><tr><td>生理食塩水(0.9%NaCl)</td><td></td><td></td><td>9 gのNaClを1,000 ml ddwに溶解し、オートクレーブ</td></tr><tr><td>0.2%NaCl溶液</td><td></td><td></td><td>2 gを1,000 ml ddwに溶解し、オートクレーブ</td></tr><tr><td>1.6%NaCl溶液</td><td></td><td></td><td>16 gのNaClを1,000 ml ddwに溶解し、オートクレーブ</td></tr><tr><td>2%アジ</td><td></td><td></td>化ナトリウム<td>1gを50 mlの滅菌ddwに溶解し、4oC.で保存します。</td></tr><tr><td>3%チオグリコール酸溶液</td><td></td><td></td><td>&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;3 gのチオグリコール酸粉末を100 mlddwに溶解します。&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;溶液が黄色になり、オートクレーブになるまで煮沸します。</td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液(0.4%)</td><td>シグマ</td><td>T8154</td>を<td>PBSで1:10に希釈して、0.04%溶液を得ます。</td></tr><tr><td>トリプシン溶液B&nbsp;</td><td>Biological Industries, Beth HaEmek, Israel</td><td>03-046-1</td><td>滅菌済み</td></tr><tr><td>1 mg/ml Zymosan A</td><td></td><td></td><td>Eppendorf チューブ内の 1 ml 滅菌 PBS 中に 1 mg の Zymosan A を再懸濁します。激しくボルテックスし、チューブを37oCで30分間インキュベートします。オートクレーブはしないでください。使用前に溶液を新たに調製してください。</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>キット</tr><tr><td>EasySep PEセレクションキット</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18557</td><td></td></tr><tr><td>EasySep PEセレクションカクテル&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18151</td><td></td></tr><tr><td>EasySep磁性ナノ粒子&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>18150</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G mouse MicroBead Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-332</td><td></td></tr><tr><td>EasySep マウス好中球濃縮キット</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>EasySep ヒト好中球濃縮キット</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>19257</td><td></td></tr><tr><td>FITC BrdU フローキット</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td></td><td></td>559619</tr><tr><td>MACS 好中球単離キット</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-658</td><td></td></tr><tr><td>食作用アッセイキット&nbsp;</td><td>ケイマン・ケミカル・カンパニー&nbsp;</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FcR ブロッキング抗体&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101302</td><td></td></tr><tr><td>精製ラット抗Ly6G抗体&nbsp;</td><td>BDファーミンゲン&nbsp;</td><td>551459</td><td>クローン1A8</td></tr><tr><td>PE標識ラット抗マウスLy6G抗体&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>127608</td><td>Clone 1A8</td></tr><tr><td>FITC-conjugated rat anti-mouse Ly6G</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>551460</td><td>クローン 1A8</td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 ラット抗マウス Ly6G&nbsp;</td><td>TONBO Biosciences</td><td>65-1276</td><td>クローン 1A8</td></tr><tr><td>バイオレットフルーア 450-標識ラット抗マウス Ly6G&nbsp;</td><td>TONBO Biosciences</td><td>75-1276</td><td>クローン 1A8</td></tr><tr><td>FITC 標識ラット 抗マウス CD11b</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553310</td><td>クローン M1/70</td></tr><tr><td>FITC 標識ラット抗マウス Ly-6G および Ly-6C (GR-1)</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553127</td><td>クローンRB6-8C5</td></tr><tr><td>PE標識ラット抗マウスCD45</td><td>BD Pharmingen&nbsp;</td><td>553081</td><td>クローン30-F11</td></tr><tr><td>FITC標識ラット抗マウスF4/80&nbsp;</td><td>アブカム</td><td>ab60343</td><td>クローン BM8</td></tr><tr><td>FITC 標識マウス 抗ヒト CD66b&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>305103</td><td>Clone G10F5</td></tr><tr><td>精製ラットアイソタイプコントロール抗体 (IgG2a, k)&nbsp;</td><td>BDファーミンゲン&nbsp;</td><td>553927</td><td>クローンR35-95</td></tr><tr><td>葉精製アルメニアハムスター抗マウスCD3e抗体</td><td>BioLegend</td><td>100314</td><td>クローン145-2C11</td></tr></tbody></table>

抗腫瘍特性を有する好中球の単離とキャラクタリゼーション

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

好中球は、ヒト循環中の全白血球の最も豊富な、微生物侵入に対する宿主防御において重要な役割を果たしています。さらに、好中球は、腫瘍細胞の免疫監視において中心的な役割を果たす。彼らは、腫瘍細胞を認識し、細胞接触依存性機構含む過酸化水素を介して、または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を介してのいずれかで腫瘍細胞死を誘導する能力を有します。抗腫瘍活性を有する好中球は、癌患者の腫瘍を有するマウスの末梢血から単離することができます。これらの好中球は、有意な腫瘍細胞傷害活性を示さない健常者またはナイーブマウスの好中球と区別するために、腫瘍同伴好中球（TEN）と呼ばれています。他の白血球と比較して、好中球は、密度勾配にかけたときに可能&gt; 98％純粋な好中球の集団を得ることができる別の浮力を示しています。しかし、加えて、通常高密度の好中球集団（HDN）に、癌患者において、腫瘍を有するマウスにおける、ならびに慢性炎症性条件下で、明確な低密度好中球集団（LDN）は、循環に表示されます。 LDNは、単核画分と共精製すると、正または負の選択戦略を用いて、単核細胞から分離することができます。単離された好中球の純度は、フローサイトメトリーにより決定されると、それらは、 インビトロおよびインビボ機能アッセイにおいて用いることができます。我々は、好中球の抗腫瘍活性を監視するための能力移行すると活性酸素種を生成すること、ならびにそれらの貪食能のex vivoでモニタリングする技術を説明します。我々はさらに、in vivoで追跡するための好中球を標識するための技術を説明し、そしてインビボでの抗転移能力を決定します。すべてのこれらの技術は、抗腫瘍で好中球を取得し、特徴づけるためにどのように理解するために不可欠です機能。

最近の研究では、好中球6のための抗転移作用を同定しました。腫瘍を有するマウスからの好中球は、細胞傷害性表現型を獲得し、腫瘍細胞の6を殺す能力を有します。これは、有意な抗腫瘍効果6を有していないナイーブマウスからの好中球とは対照的です。プロトコルセクションに記載された技術のいくつかは、in vitroおよびin vivo 6 において抗腫瘍好中球機能を研究するために使用されています。 腫瘍細胞傷害性好中球は、腫瘍を有するマウス6から得ることができます。この目的を達成するために、マウスを、同所左鼠径部乳房脂肪パッド（プロトコル1）に4T1細胞を注射しました。 2 cm 3の（ 図3 - -腫瘍は左下腹部に明らかである）後21日目の腫瘍接種により、原発腫瘍は1のサイズに達しました。この時、マウスを安楽死させ、1mlの血液を（マウス当たり）描かれました心臓穿刺（ 図3）</s...

好中球は、侵入する微生物に対する宿主防御だけでなく、腫瘍細胞の免疫監視にも重要な役割を果たしています。ここでは、抗腫瘍特性を持つ好中球の単離に関連する技術と、in vitroおよびin vivoでの抗腫瘍好中球機能のモニタリング方法について述べる。

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

本手順の目的は、がんにおける好中球の機能を研究することです。まず末梢血を採取し、次に密度勾配遠心法で好中球を精製した後、一晩の共培養を行います。ルシフェラーゼ標識腫瘍細胞を用いて、細胞のルシフェラーゼ活性を定量します。最終的に、各共培養系におけるルシフェラーゼ量は、その共培養系内での好中球の細胞毒性と逆相関させることができます。抗体を用いた好中球分離やその他の細胞生存率評価法などの既存の手法と比較して、本手法の主な利点は、好中球の非特異的な活性化を最小限に抑え、放射性標識を使用せずに細胞生存率を測定できることです。この手順の実演は、私の研究室の大学院生と、同じく私の研究室のポストドクターであるDr. Simoniが行います。腫瘍を担持したマウスから好中球を単離するには、まず心 puncture によって得られた血液 1 mL を、0.5% BSA 含有 PBS で最終容量 6 mL にまで希釈します。次に、15 mL の円錐形ポリプロピレン遠心チューブの底に、滅菌ろ過した 1.119 g/mL のショ糖溶液 3 mL を加えます。その後、チューブをゆっくりと慎重に傾けます。滅菌ろ過した1.077 g/mLのスクロース3 mLを1.119 g/mLのスクロースの上に層状に重ね、さらに希釈血液6 mLを加えてください。室温で700 Gs、30分間遠心分離を行い、スクロース密度勾配によって細胞を分離させます。分離終了時にブレーキをかけることで、赤血球の大部分がチューブの底部に集まります。高密度の好中球は、ショ糖層の界面にある白から赤のリング（3 mL付近）に集まります。低密度の白血球は、1.077 g/mL層とBSA含有PBSの界面にある白いリング（6 mL付近）に位置します。まず、低密度細胞層の5 mm上まで、PBS-BSA層を吸引して除去します。次に、1 mLピペットチップを用いて、細胞をゆっくりと旋回させながら、低密度細胞を緩徐に吸引して回収します。細胞を0.5% BSAを含む30 millilitersのPBSに分注します。次に、高密度好中球を0.5% BSAを含む30 millilitersのPBSが入った別のチューブに移します。同様に、両方の細胞群を遠心分離し、その後、ペレットを36 millilitersの滅菌HPLCグレード水で再懸濁します。30秒後、2.5% BSAを添加した5 XPBS 9 mLを用いて細胞の等張性を回復させ、細胞を遠心分離して回収します。再び細胞をP-B-S-B-S-A 10 mLに再懸濁し、トリパンブルー排除法により生存細胞数を測定します。その後、再度遠心分離を行い、好中球を適切な最終細胞密度になるようインキュベーション培地に再懸濁します。がん患者から血中好中球を分離します。まず、ヘパリン処理したヒト血液 10 milliliters と、生理食塩水で調製した 3%DExT strand T 500 を同量混合し、室温で 30 分間インキュベートして赤血球を沈降させます。赤血球が沈殿した後、白血球を豊富に含む上清を 1.077 grams per milliliter のショ糖溶液 10 milliliters 上にゆっくりと重層し、遠心分離によって細胞を分離します。実演した通り、ヒトの高密度好中球はペレット中に存在し、低密度好中球は 1.077 grams per milliliter のショ糖層と血漿の界面において、単球およびリンパ球と共に精製されます。前述の手順で好中球を回収した後、細胞を10 millilitersの0.2% sodium chlorideで30秒間希釈し、混入している赤血球を溶血させます。次に、10 millilitersの1.6% sodium chlorideを加えて細胞の等張性を回復させ、チューブを1回転倒させて混合します。細胞を遠心分離して回収し、ペレットを20 millilitersのHBSSで3回洗浄します。その後、細胞数をカウントし、適切な細胞密度になるよう2% FBSを添加したRPMI 1640で再懸濁します。thi glycoまたはXanによって誘導された好中球を分離するために、23ゲージの1インチ針を装着した結核用注射器を用いて腹腔内投与を行います。マウスの腹腔内に適切な溶液を1 mL注入します。4～24時間後、安楽死させた動物の腹腔に、25ゲージ・5/8インチ針を装着した5 mLシリンジを用いて、滅菌PBSを5 mL注入します。腹腔を穏やかにマッサージした後、液体をシリンジに回収し、腹腔滲出細胞を採取します。10% FBSを添加したRPMI 1640培地で細胞を洗浄します。次に、マクロファージを除去するため、FBS添加培地を含む組織培養グレードの培養皿内で、1 mLあたり10⁶個の細胞を37°Cで2時間インキュベートします。単離した好中球を染色するために、10⁵個の細胞を50 µLずつのPBSに再懸濁し、薄層細胞調製アダプターを用いて150 ×gで遠心分離します。5分後、アダプターからプレラベル済みのガラススライドを取り出し、細胞を固定して染色します。次に、スライドを水道水で15回洗浄します。スライドを再び自然乾燥させ、その後、光学顕微鏡下で細胞を観察し、好中球の抗腫瘍活性を評価します。ルシフェラーゼ標識腫瘍細胞を、0.5% FBSを添加した最適化低血清培地を用いて、1 mLあたり10⁴個に5倍希釈します。次に、0.5% FBSを含む最適化低血清培地100 µLを用いて、腫瘍細胞を5×10³個ずつ、白色の96ウェル平底組織培養プレートの各ウェルに播種します。4時間後、0.5% FBSを含む最適化低血清培地50 µLに懸濁した好中球を1×10⁵個ずつ各ウェルに加え、一晩インキュベートします。翌朝、上清を穏やかに吸引し、200 µLのPBSで各ウェルを洗浄します。次にPBSを吸引し、各ウェルに50 µLのパッシブ溶出バッファーを加えます。続いて、プレートをアルミホイルで覆い、室温のオービタルシェーカーを用いて150 RPMでインキュベートします。20分後、プレートをルミネッセンスプレートリーダーにロードしてください。ルシフェラーゼアッセイ溶液を各ウェルに50 µL注入し、1ウェルあたり10秒間化学発光を測定します。最後に、計算式を用いて腫瘍溶解率を算出し、この代表的な実験における好中球の細胞毒性の程度を検証します（1×10⁵）。好中球を、上述した通りルシフェラーゼを発現する4T1標的細胞および腫瘍のないマウスから精製した好中球と共に共培養しました。腫瘍細胞の死滅はほとんど観察されませんでした。しかし、腫瘍担持マウスから精製した好中球は有意なレベルの細胞毒性を示したため、低密度および高密度好中球の免疫抑制能を検証しました。anti-CD3、またはanti-CD3に低密度もしくは高密度好中球を加えて刺激した後のCD8陽性脾臓T細胞数を、anti-CD3活性化後に評価しました。CD8陽性細胞の劇的な増加が観察されました。しかし、低密度の好中球との共培養では、CD8陽性細胞の顕著な減少が誘導されましたが、この効果は高密度の好中球が存在する場合には観察されませんでした。また、増殖の指標としてCFSEの保持率についても評価しました。anti-CD3処理した細胞、および高密度の好中球共存下で培養したanti-CD3処理細胞の両方において、CD8陽性細胞の増殖が増加し、左方へのワードシフトが認められることに注目してください。この手順に続いて、酸化バースト、食作用、または遊走の測定といった他の手法を実施することで、「異なる病理学的シナリオにおいて好中球機能はどのように影響を受けるか」といったさらなる疑問に対する検証が可能です。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

本稿では、腫瘍に浸潤する白血球の高度に精製された集団を単離するためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは複雑な腫瘍組織から細胞を単離するための収率および純度を高めるためにミルテニーバイオテクプロトコルから構成されている。...

原発腫瘍から免疫細胞の分離

このビデオでは、不連続なショ糖勾配遠心分離により、担がんマウスの血液から細胞傷害性の高密度好中球と低密度好中球を分離する方法を示します。...

担腫瘍性マウス血液からの細胞傷害性好中球の単離

このビデオは、抗血管新生腫瘍関連好中球(TAN)を生成するアッセイを示しています。血管新生促進性TANを含むマウス黒色腫を採取すると、蛍光活性化セルソーティング(FACS)を使用して単一細胞を単離し、ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ(NAMPT)の阻害剤で治療して血管新生を刺激する能力を低下させます。...

抗血管新生性腫瘍関連好中球の作製

好中球は最も豊富な種類の白血球です。ここでは、密度勾配分離法によるヒト血液からの好中球の単離と、顆粒球経路に沿ったヒト前骨髄球(HL60)細胞の分化について説明します。抗リンパ腫薬に対するリンパ腫細胞の感受性に対するそれらの役割をテストするため。...

治療薬にリンパ腫細胞の感度での役割を決定するために、好中球の単離と解析

新しいプロトコルを特定し人間由来の微粒子を特徴付けるとおりマウス好中球。これらのプロトコルは遠心、フローサイトメトリーとイムノブロット微粒子コンテンツを分析する手法を活用し、細胞機能のさまざまなセル型から派生した微粒子の役割を研究する使用できます。...

分離と機能研究の好中球由来の微粒子のキャラクタリゼーション

ひと低密度好中球 (LDN) 術後の腹腔洗浄液から回収が大規模な好中球細胞外トラップ (網)...

低密度の好中球によって生成された好中球細胞外トラップは仲介する腹腔洗浄液から得られた腫瘍細胞の増殖と添付ファイル

ここでは、固定/グリセリン組織学セクションで好中球の存在を検出し、ライブの精製された好中球の活性化状態を評価するためのプロトコルを提案する.特に、ムバーラク40ペプチドは、ラクトフェリンの好中球固有および第三紀の顆粒に存在をバインドします。透過や好中球活性化を介して顆粒内容の暴露は、好中球のマーキングが可能です。...

炎症の好中球を介したイベントの検出で使用するムバーラク40ペプチド

ここで、腫瘍担持マウスへの移植後の抗血管新腫腫瘍関連好中球の治療可能性を示す。このプロトコルは、好中球活性ex...

操作された腫瘍関連好中球を腫瘍性マウスに移植し、生体内の血管新生電位を研究する

全血、バフィーコート、または白血病膜からの好中球の分離方法を詳述し、良好な収率、高純度、および最小限の細胞活性化を達成する。我々は、精製の勾配、赤血球(RBC)沈殿、RBC溶菌を利用して、高品質/純度好中球製剤を得る。...

全血とバフィーコートからのヒト好中球の分離

この定義されたプロトコルは、 in...

ヒト好中球細胞外トラップ放出のリアルタイムハイスループット顕微鏡定量とアンタゴニストの薬理学の評価

ここでは、磁気分離(ネガティブセレクション)と不連続密度勾配培地を使用して、全血から低密度および正常密度の好中球を分離するための信頼性の高いアプローチを提供します。高純度細胞(≥93%)を手つかずで分離し、健康や疾患における好中球亜集団の役割を理解するために重要な、好中球亜集団の正確な下流分析を促進します。...

全血からの低密度および正常密度好中球の単離と特性評価

学ぼう、密度勾配法による好中球単離とルシフェラーゼ標識腫瘍細胞との共培養を用いた抗腫瘍活性評価法。非特異的活性化を最小限に抑え、放射線不使用で細胞生存率を測定する革新的アプローチです。

抗腫瘍特性を有する好中球の単離とキャラクタリゼーション

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