実験視神経の脱髄のラットモデルにおける視覚誘発電位の記録
2015年7月29日
限局性脱髄は、リゾレシチンマイクロインジェクションを使用して視神経に誘導されます。視覚誘発電位は、視覚野上に埋め込まれた頭蓋骨電極を介して記録され、in vivo の視覚経路に沿ったシグナル伝導を調べます。このプロトコルは、電極移植と視神経マイクロインジェクションの根底にある外科的手順を詳しく説明しています。
次の実験の全体的な目標は、視神経の脱髄をin vivoで監視することです。これは、最初に視覚野に微小電極を埋め込むことによって達成されます。第 2 ステップとして、lyin が視神経にマイクロ インジェクションされ、脱髄の限局性病変が誘発されます。
その後、視覚的に誘発された可能性を録音することができます。最終的に、回帰分析では、視覚的に誘発される潜在的な遅延遅延とボリュームとの間に強い線形相関があることが示されています。このビデオでは、ラットの視覚誘発電位を記録する技術を紹介します。
埋め込まれた頭蓋骨電極を使用して、マイクロインジェクション技術を使用して視神経の焦点性脱髄の技術も示します。すべての実験は、マッコーリー大学医学部の研究室で行われています。この技術は、博士課程の学生であるNitin Chichiによって実演されます 手術を開始する前に、ケタミンとマイネの腹腔内注射で12週齢以上の成体ラットに麻酔をかけます。
離脱反射がないことを確認してください。手術中に動物に戻る反射に対処するために、必要に応じて10%のケタミンを投与する準備をしてください。次に、手術部位の皮膚を剃り、次に動物をヒートパッドの上に置いて準備を完了します。
ポビドンヨードで皮膚をこすり、動物をドレープし、眼科用軟膏を塗ります。また、無菌器具を使用して無菌を維持するようにしてください。手術を開始するには、頭の正中線に縦方向の皮膚切開を行います。
次に、結合組織をクリアして、頭蓋骨を十分に露出させます。次に、マイクロハンドドリルを使用して、bgmaの7mm後ろ、正中線から3mm横の小さなバーの穴を慎重に穴に入れます。頭蓋骨を通って皮質に約0.5ミリメートルのところにスクリュー電極を埋め込みます。
次に、正中線に参照スクリュー電極を埋め込み、必要に応じてbgmaに対して3ミリメートルの吻側に埋め込みます。歯科用セメントを塗布して、ネジ電極を包み込み、固定します。最後に、皮膚を縫合して閉じます。
電極は露出したままにしておくことができるので、録音のたびに皮膚を再度開く必要はありません。次に、動物が麻酔から回復する前に、非ステロイド性抗炎症薬またはnsaid、またはオピオイド鎮痛薬を迅速に投与します。最後に、抗生物質軟膏で皮膚を治療します。
動物をウォーミングパッド付きのリカバリーケージに入れ、完全に歩行できるようになるまで常に監視します。その後、少なくとも1週間は回復させます。VEP記録を行う前に、前述のように動物を手術のために準備し、目の眼窩の上の1〜1.5センチメートルの皮膚切開を行い、細かい虹彩はさみで目
を切開します。皮下組織を開き、眼窩腔にアクセスします。次に、立体視鏡の下で、結膜と前腱のカプセルを開きます。次に、外眼筋と眼窩内涙腺を引っ込めます。
視神経の周りの視神経の約3ミリメートルを露出させるには、眼科用ブレードを使用して硬膜とくも膜の物質層を縦方向に開きます。次に、ハミルトンのシリンジに取り付けられたガラス製のマイクロピペットを、球体から2mm後方の神経に挿入します。30秒以上かけて、ライインのボーラスに染料を注入して手順を完了します。
皮膚の切開部を縫合します。感染を防ぐために抗生物質軟膏を塗布します。動物を保温パッドに移動し、回復するまで監視します。
動物に麻酔をかけ、以前と同じように皮膚を準備した後、そこの暗い部屋に移します。ホメオテーマのブランケットシステムと温度プローブを使用して、暗所で監視しながら体温を摂氏37度半以内に保ちます。動物を5〜30分間適応させます。
30分後、1%tropic IDE点眼薬で瞳孔を拡張します。次に、はさみと鉗子を使用します。頭蓋骨の上の皮膚を開き、事前に配置されたNC2ネジ電極にアクセスします。
ネジをインピーダンスメーターに接続します。次に、電極インピーダンスを5キロオーム未満に測定して維持します。次に、刺激された目の反対側の視覚野にネジを接続します。
次に、テールに針電極を挿入して地面を表面化させます。次に、キャリブレーションされたミニガンツフェルド刺激装置をまぶたの周りの皮膚に配置して、目の隔離を改善します。次に、1ヘルツで100回のフラッシュを使用し、1ヘルツでローパスフィルターとハイバンドパスを使用して光刺激を配信します。
100ヘルツでフィルタリングします。完了したら、皮膚を縫合し、麻酔から回復するために動物を保温パッドの上に保ちます。週に数回から数週間に1回に1回に繰り返す録音が可能です。
とりなして、VEP トレースは N one レイテンシに大幅な遅延があることを示しています。視神経注射後、再現性を実証するために毎日録音が行われました。脱髄の部分的な視神経病変は、ルクサールファストブルーで染色された組織切片で観察することができました。
病変の体積を測定した後、潜伏遅延と病変のサイズとの相関関係が明らかになりました。この技術は、視神経に病変を誘発し、これらの病変をVPの変化と相関させるために、焦点性脱髄のモデルとして使用できます。誘発される病変のサイズはかなり変動するため、変化を組織学的に相関させることが重要です。
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概要
本記事では、マイクロインジェクションによるげっ歯類視神経への局所脱髄の誘導と、視覚誘発電位（VEP）記録を用いた機能的変化のモニタリングに関する詳細なプロトコルを提示します。この手法により、脱髄および再髄鞘化プロセスの縦断的な評価が可能となり、視神経病理の研究や潜在的な治療法の評価における有用なモデルとなります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 電気生理学
- 眼科学
背景
- VEP記録は、視神経炎の重症度評価および疾患の進行状況のモニタリングに広く用いられています。
- VEPパラメータの変化は、視神経における病理学的損傷と相関しています。
- げっ歯類モデルを用いることで、実験的研究のために脱髄を制御して誘導することが可能です。
- 縦断的なVEP記録により、個体における機能的な変化を時間経過とともに追跡できます。
研究目的
- 部分的な視神経脱髄の再現性のあるげっ歯類モデルを構築すること。
- 頭蓋内に埋め込んだ電極を用いたVEP記録のプロトコルを記述すること。
- VEP潜時の変化を、病変サイズおよび脱髄の重症度と相関させること。
使用された手法
- 成体ラットの視覚皮質へのスクリュー電極の植込み。
- 局所的な脱髄を誘導するための視神経へのリゾレシチン（lyin）の微量注入。
- ミニ・ガンツフェルト刺激装置および光刺激を用いた視覚誘発電位（VEP）の縦断的記録。
- Luxol fast blue染色を用いた視神経病変の組織学的解析。
主な結果
- 視神経の脱髄後、VEP波形においてN1潜時の有意な遅延が認められた。
- 病変サイズは個体差があったが、組織学的に定量化することができた。
- VEP潜時の遅延と病変体積との間に強い線形相関が認められた。
- 本プロトコルにより、セッション内およびセッション間において再現性のあるVEP記録が可能となった。
結論
- このモデルにより、生体内（in vivo）で視神経脱髄を制御的に誘導し、モニタリングすることが可能になります。
- VEP記録により、組織学的損傷と相関する機能的な読み出しが得られます。
- 本手法は、脱髄および再髄鞘化の調査、ならびに神経保護療法や再髄鞘化療法の試験に適しています。
よくある質問
産業界における重要性
視神経脱髄ラットモデルにおける視覚誘発電位（VEP）記録は、脱髄および再髄鞘化による機能的影響を評価するための、トランスレーショナルに有用なプラットフォームを提供します。この手法により、視神経の完全性を定量的かつ経時的に評価することが可能となり、前臨床段階における神経保護および再髄鞘化療法の開発において、予測的な信頼性を裏付けることができます。このモデルは、中枢神経系脱髄疾患に対する初期探索およびターゲット検証に直接的に寄与します。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 脱髄および再髄鞘化のメカニズムに関連する治療仮説の検証を可能にします。
- 機能的なVEPの変化と組織学的な病変サイズを相関させることで、生物学的なリスク低減（de-risking）を支援します。
- 定量的で再現性のあるリードアウトを通じて、機能的なターゲットバリデーションを促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 視神経機能に対する化合物の影響を評価するための、検証済みin vivoシステムを提供します。
- 比較研究に適した、標準化され再現性のあるVEP測定を可能にします。
- 個体における介入効果の縦断的な追跡を可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 機能的なVEP出力を、疾患に関連する脱髄および再髄化プロセスと整合させます。
- 探索から神経保護戦略の前臨床検証までの継続性をサポートします。
- 定量的な機能的エンドポイントに基づいた、リスク調整後の進展判断を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
このモデルは、初期の探索から前臨床研究までを統合し、メカニズム研究と候補療法のトランスレーショナル評価を橋渡しするものです。
- 探索生物学：VEP潜時の変化を病変体積に関連付けることで、仮説の検証およびメカニズムのリスク低減を促進します。
- スクリーニング：化合物評価のための、再現性のある定量的なVEP出力を提供します。
- 分析：機能的データと組織学的データの統計的な相関分析を可能にし、意思決定に役立てます。
- トランスレーショナルリサーチ：視神経病変における疾患関連エンドポイントとの整合をサポートします。
- 企業内での再利用：多様な神経保護および再髄鞘化療法のパイプラインに利用可能な再利用可能なプラットフォームを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 脱髄研究における予測の信頼性を高め、メカニズムに関する曖昧さを軽減する。
- 運用的価値： 機能評価を標準化し、研究間での再現性を支援する。
- 戦略的価値： Go/No-go判断の根拠となり、CNSポートフォリオ開発における資本効率を向上させる。
- ポートフォリオへの影響： 神経保護および再髄鞘化候補物質のリスク調整後の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- げっ歯類の手術、電気生理学、および組織学的解析の専門知識が必要である。
- VEP記録およびマイクロインジェクションの手順のための専用装置が必要である。
- 電極の配置および刺激プロトコルの、チーム間での厳格な標準化が求められる。
- 異なる脱髄モデルやCNS領域に合わせて適応させる必要がある場合がある。
- 病変サイズに変動があるため、確実な解釈には組織学的な相関が必要である。
