Name: qPCRTag分析 - 高スループット、Sc2.0ジェノタイピングのためのリアルタイムPCRアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: 学ぶqPCRTag分析による合成酵母ゲノムプロジェクトの高スループットジェノタイピング。リアルタイムPCR検出システムとナノスケール音響液滴噴射技術を用いて、ゲル電気泳動を不要にし、約1時間で正確な遺伝子型判定を実現する革新的な方法です。

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この作品は、国立科学財団助成MCB-0718846および米国防総省の国防高等研究計画庁（JDBに）契約N66001-12-C-4020によって部分的にサポートされていました。 LAMは、自然科学とカナダの工学研究評議会からのポスドクフェローシップによって資金を供給されました。この記事の公開は、ロシュが主催されています。

1.酵母ゲノムDNA（gDNAを）を準備<ol><li> 50mMトリスpH8.0の、100mMのNaCl、1％SDSを含んでいる酵母溶解緩衝液9のストックを調製し（W / V）、2％トリトンX-100（v / v）、1mMのEDTA pHは8.0。 </li><li>材料の使用を開始するなど、通常BY4741 10背景の実験室株について飽和文化の〜100μlに対応〜2×10 6細胞、。培養した細胞を1.5mlのマイクロチューブ中で室温で3分間、1000×gの遠心分離によって収集されるべきです。上清を吸引除去します。 </li><li>酵母溶解緩衝液200μlを加え、ピペッティングにより細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>酸の〜300μlをビーズのレベルは約1mm細胞スラリーのレベル以下であるようなガラスビーズを洗浄しました。 </li><li>ドラフト内（25：24：1）をフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール200μlを添加します。マイクロチューブに蓋をし、この揺れの間に漏れになりますように何のビーズがキャップとチューブの間に立ち往生していないことを確認（ステップ1.6）。混合し、キャップが密封されていることを確認するために3回転倒。 </li><li>例えば、エッペンドルフ5432などのベンチトップミキサーを用いて室温で10分間チューブを振ります。 </li><li> 4℃で10分間、20,800×gで遠心分離します。 </li><li> 100％エタノール1 mlを含む新しいマイクロチューブに移し、水相の75μLを。混合するために10回転倒。 </li><li> 4℃で20分間、20,800×gでの遠心分離によってDNAをペレット化。 </li><li> DNAペレットを外れることなく、上清を吸引除去します。 70％エタノール500μlでペレットを洗浄します。 </li><li> 4℃で5分間、20,800×gで遠心分離します。 </li><li> DNAペレットを取り除くと、通常、約10分である過剰のエタノールが蒸発するまで、オープンマイクロフュージキャップ、とのペレットを空気は、乾燥することなく、上清を吸引除去します。 </li><li>混合するために10mMのトリスpH7.4の渦の75μlのDNAペレットを再懸濁します。無期限に-20℃でサンプルを保管してください。用いて試料中のDNAの濃度を測定しますこのようなRNAからDNAを区別量子ビットとして、ベンチトップ蛍光光度。のgDNAの最終濃度は〜1-2 ng /μLであることを確認してください。 </li><li>混合するために、水とボルテックスを用いてゲノムDNAの1:10希釈液を調製します。 </li><li>小分けナノスケール音響液体ディスペンサー（ステップ3）と互換性のあるソースプレートの適切なウェルに希釈したgDNAの30μlの。 Labcyteエコー550を使用している場合は、384ウェルポリプロピレンプレート（384PP板）を使用します。 注：適切に密封されたときに、このプレートを-20℃で少なくとも1ヶ月間保存することができます。 </li></ol> 2. 1536マルチウェルプレートに準備し、ディスペンス定量PCRマスターミックス<ol><li>混合するために1.5mlマイクロチューブと渦では、このようなライトサイクラー1536 DNAグリーンマスターとして定量PCRマスターミックスの850μLを、準備します。任意の気泡を除去するために、室温で20,800×gで2分間、定量PCRマスターミックスを遠心します。シングル1,536マルチウェルプレートに必要な定量PCRマスターミックスの成分は以下の通りですS： <ol><li>酵素マスターミックス（濃縮グリーンマスターチューブ1、5倍）、SYBR 42.5μlの（20倍濃縮されたグリーンマスターチューブ4）の170μlを、水637.5μLを兼ね備えています。 </li></ol></li><li>このようなアート·ロビンスコブラなどのバルク液体ディスペンサーを用いて十分に1,536マルチウェルプレートへ/ 500 nlの分注します。 （手順は、2.2.1-2.2.4コブラに特異的に参照することに注意してください。） <ol><li>次の設定でディスペンシング·プログラムを作成します。液体クラス、水;吸引量、800μlの。ボリューム、500 NLを分配します。時間、20秒を洗います。ディスペンスの設定では、分注速度は49.6ミリメートル/秒に設定されていることを確認し、オフセット分注は0.25ミリメートルであり、過剰な吸引液が十分に戻って元に分配されます。 </li><li>マイクロチューブのキャップを切断したり、単にオープンのままにデッキ1位に位置しているマイクロチューブホルダー、ウェルA1での定量PCRマスターミックスを含むマイクロチューブを置きます。 Aspiratを編集して、A1に「よく吸引する」に設定しE設定。 </li><li>前の最初の脱選択吸引によって定量PCRマスターミックスを分注する洗浄工程を行い、ステップ2.2.2で設定プログラムのステップを分配した後、「実行」を打ちます。完了したら、吸引を再選択して、定量PCRマスターミックスを分注するための完全なプログラムを実行する前にステップを分配します。コブラは、プライムシステムに提供しています10分未満の初期洗浄工程、アイドル状態に座っている場合は、不要です。 </li><li>各ウェルに定量PCRマスターミックスを分配するために「実行」を押してください。 </li></ol></li><li> 1536マルチウェルプレート（低速PCRプレートスピナーを使用して、30秒）を簡単に遠心分離することにより、各ウェルの底の定量PCRマスターミックスを収集します。 </li></ol> 3.ディスペンス鋳型DNAと1,536マルチウェルプレートにプライマー<ol><li>このようなエコー550のような音響液体転送システムを使用して、1536マルチウェルプレートの所望のウェルに希釈したgDNAの5 NL（ステップ1.3）を分注します。 <ol><li> ECHのため550 O、プレートの再フォーマットソフトウェアを使用するか、または代替的に転送をプログラムするために、カスタムのExcelスプレッドシートを提供しています。プログラムは、あなたが物理的にgDNAを（ステップ1.3）を分配しているだけでなくその中にソースに一致でのgDNAのためによく選択されたソースを確認してください。 384PP板内の液体は、界面活性剤を含まない緩衝液であることを示すソースプレートタイプ &#39;384PP_AQ_BP2&#39;を選択します。 </li></ol></li><li>プライマー、フォワードプレ混合し、例えば、エコー550のような音響液体移送システムを使用して1536マルチウェルプレートの所望のウェルに50μMのそれぞれの最終濃度に逆の10 NLを分注します。 <ol><li>液体転送システムでは、プレートの再フォーマットソフトウェアを使用するか、または代替的に転送をプログラムするために、カスタムのExcelスプレッドシートを提供しています。 注：ここでは、それは簡単ですので、1,536マルチウェルプレート上のレイアウトを視覚的にリアルタイムPCRの結果を検査するためのプライマーの染色体順に一致するようにプライマーを省くことが可能です後で（ステップ6）。 </li><li>音響液体ディスペンサーと互換性のある板にプライマーをプレミックス。エコー550は、Labcyte 384LDV（低デッドボリューム）プレートを使用し、ソースプレートタイプ &#39;384LDV_AQ_B」液体がないタンパク質との単純なバッファであることを示すためにエコーをプログラムを選択します。 </li></ol></li></ol> 4.シールと遠心1536マルチウェルプレート<ol><li>このようなPlatelocサーマルマイクロプレートシーラーなどのマイクロプレートシーラーシステムを使用して、すぐにヒートシーラー機器と互換性のある光学的に透明なシールを使用して、1,536マルチウェルプレートをシール。汚れマークを回避するために、シールの表面には触れないでください。 <ol><li> Platelocサーマルマイクロプレートシーラーを使用している場合は、次の設定を使用します。時間を2.0秒、シール温度162℃で、空気の圧力82 PSIをシール。この装置は、加熱するために〜5分かかりますので、事前にオンにする必要があります。 </li><li> Platelocサーマルマイクロプレートシーラーを使用している場合、adapterは良好なシールを確実にするために、機器の段階に1536マルチウェルプレートの高さを上昇させるために使用されなければなりません。 注：それはPlatelocサーマルマイクロプレートシーラー用のステージプレートを購入するのが好ましいが、別の解決策は、1,536マルチウェルプレートの高さを上げるために隅に任意のハードウェア店で入手可能な4〜2mmの厚さの標準的なワッシャを挿入することです。 </li></ol></li><li>すぐに、各ウェルの底にすべての試薬を収集するために、室温で3分間、2,000×gで密封された1,536マルチウェルプレートを遠心します。 </li></ol> 5.リアルタイムPCR <ol><li>プログラム融解曲線分析に続く二段階増幅プロトコルなどライトサイクラー1536として1536のqPCR器具。次のようにプログラムを設定、ライトサイクラー1536ソフトウェアを使用しました： <ol><li>プレインキュベーション：95℃、1分間保持、ランプ速度4.8℃/秒、ない取得。 </li><li>二段階の増幅：[95℃の30サイクル、ノーホールド、ランプ速度4.8℃/秒、ノー取得。 64℃、30秒のホールド、ランプ速度2.5℃/秒、単一の取得]。 </li><li>溶融曲線：95℃、10秒、ランプ速度4.8℃/秒、ノー取得。 60℃、1分、ランプ速度2.5℃/秒、ノー取得。 97°C、ランプ速度0.1℃/秒、5買収/°C（連続）。 </li><li>クール：40℃、30秒、ランプ速度2.5℃/秒、ない取得。 </li></ol></li><li>ファイル名を指定して実行定義]タブで「グリーンインターカレー色素 &#39;に検出形式を設定します。 </li><li>ファイル名を指定して実行定義]タブで「マスター·コントロール」にピペッティング制御を設定します。この機能は、内部対照として機能し、推定上の偽陰性を同定するのに有用である1,536マルチウェルプレートの各ウェル中のqPCRマスターミックスの存在を検出します。 </li><li> 1,536定量PCR機器にステップ2-4で製造した1536マルチウェルプレートを挿入し、プログラムを実行します。 </li></ol> 6.データ解析<ol><li> PERFqPCRのソフトウェア内のデータの目視検査をORM。 注：1,536ソフトウェアは、両方の増幅の可視化を可能にし、曲線、ならびにコール（正、負、無効、N / A; 図2）を示すヒートマップを溶融、交差点の値が（正またはグレーのカラースケールをスライディング図3）、またはエンドポイントの蛍光カラースケールをスライド（EPF）の値（）;負のため。 </li><li>生データや楽器からオフラインで処理するための計算されたデータのいずれかとの1536形式のソフトウェア.txtファイル（結果表）または.xmlファイルからデータをエクスポートします。 注：高い信頼性で正/負とCp値の呼び出しを決定しながら、1536ソフトウェアに組み込まれている独自の自動化されたクロスポイント（CP）を呼び出すアルゴリズムは比較的低いと低いサブマイクロリットルの反応容量で、アカウントに形状や増幅曲線の傾きをとります蛍光値。 </li><li>ライトサイクラーDNAグリーンマスターが使用した場合定量PCRのためのdは、すべてのウェルが「マスターコントロール」を渡されていることを確認します。失敗は、よくは定量PCRマスターミックスと欠落したデータポイントを受信しませんでした示し潜在的偽陰性とみなされるべきです。全てのウェルは、「マスターコントロール」を渡されたことを確認します。失敗は、よくは、DNAのマスターミックスを受信し、欠落したデータポイントの潜在的な偽陰性を考慮していないを示しています。 </li></ol>

<ol><li>Annaluru, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+of+a+functional+designer+eukaryotic+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Total synthesis of a functional designer eukaryotic chromosome.</a> Science. 344 (6179), 55-58 (2014).</li>
<li>Dymond, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+chromosome+arms+function+in+yeast+and+generate+phenotypic+diversity+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design.</a> Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).</li>
<li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+with+6000+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-547 (1996).</li>
<li>Dymond, J., Boeke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Saccharomyces+cerevisiae+SCRaMbLE+system+and+genome+minimization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization.</a> Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).</li>
<li>Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneDesign+3.0+is+an+updated+synthetic+biology+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).</li>
<li>Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design-A-Gene+with+GeneDesign%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Design-A-Gene with GeneDesign.</a> Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).</li>
<li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+limits+of+genetic+recoding+in+essential+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing the limits of genetic recoding in essential genes.</a> Science. 342 (6156), 361-363 (2013).</li>
<li>Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+of+a+eukaryotic+chromosome%3A+Redesigning+and+SCRaMbLE-ing+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast.</a> Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).</li>
<li>Dymond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+genomic+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).</li>
<li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C%3A+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li>
</ol>

LAM、NAP、JAMとJDBは開示することは何もありません。 RCとALは、ロシュ·ライフサイエンス社、米国を採用し、原理実験の証拠の一部としてLAMを使用してアプリケーションを開発する上で加工されます。

それが顕著に高いスループットを可能にするようPCRTagジェノタイピングアッセイにリアルタイムPCR検出の組み込みはSc2.0プロジェクトのための重要な開発です。前のワークフローでは、384ウェルPCRプレート、1.5時間、熱サイクルの実行時間、アガロースゲル電気泳動、およびゲルの手動注釈に2.5μlの反応を指定しました。 qPCRTag分析と呼ばれるここで紹介するワークフローは、いくつかの主要なボトルネックを克服しています。まず、qPCRTagランは約1時間で、（プレートのセットアッププラス時間を実行します）最初から最後まで、加工することができる単一の実験中に4×384ウェルプレートを凝縮します。それはqPCRTag分析用ウェルあたり試薬コストが低いスループットアガロースゲルベースの​​アプローチと同等のことに留意することが重要です。しかし、ゲル電気泳動および手動注釈を回避することによって、qPCRTagワークフローは大きな利点であり、時間と労力の大幅な節約を、提供します。重要なことqPCRTagワークフローは専用ですオートメーションとtirely互換性があります。 PCRTagアッセイの出力としてリアルタイム検出を用いて、主要な関心事は、偽陽性と偽陰性の割合です。 PCRTagプライマーが最初にリアルタイムPCRでの使用のために設計されていないので、全てのプライマー対は、この出力での使用のために適切であることが期待されます。このためには、フロントアップ、リアルタイムベースのアッセイでは動作しないサブセットを除外するために、すべてのPCRTagプライマー対の機能と特異性を検証することが重要です。例えば、染色体3 PCRTag偽陽性及び陰性のバイ及び大再現性のあるリアルタイムPCRデータ（ 図2および図3）、これらはさらなる分析から除外することができます。また、失敗することが知られているプライマー対（ゲル電気泳動によって評価し、 図 ら AnnaluruのS6及びS7に示す。1）も排除することができます。これは、簡単にexclu単純に達成されます音響伝達プロトコルを設定丁不良プライマー対。 ほとんどのハイスループットアッセイのように、私たちはさらに下流の検証に値する形質転換体を同定するために、一次スクリーニングとしてリアルタイムPCRTag検出を使用します。続いて、二次スクリーニングのためのゴールドスタンダードは、読み出しとしてゲル電気泳動でPCRTag解析のままになります。 Sc2.0ためPCRTag解析の適用を超えて、ハイスループットで最先端のナノスケールの液体ハンドリングシステムを組み合わせたリアルタイムPCR技術は、迅速で自動化された分析を可能にし、多くの分野に影響を与える可能性を有します。たとえば、このワークフローは、ハイスループットライブラリースクリーニング、伝染病の診断、microbiome分析し、同時に複数の遺伝子座を変更しようとする最先端のゲノム編集手法に適用することができます。

Sc2.0、または合成酵母ゲノムプロジェクト（ <a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">www.syntheticyeast.orgは</a> ）、完全に合成真核生物のゲノムを設計し、構築することを目標としています。出発点として、 サッカロミセス·セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）3の高キュレーションゲノム配列を使用して、16リニア染色体のそれぞれは、セルの適性を維持し、ゲノム安定性の向上、および遺伝的柔軟性を増大させる特定の設計原理のセットに適合するように再設計されています。例えば、このような繰り返しのような不安定化要素はSc2.0染色体から削除されます。 TAG停止コドンのすべてのインスタンスは、非遺伝的にコードされたアミノ酸の導入のための最終的な株でコドンを「解放」するTAAに再符号化されます。またのCre-lox系で有効に誘導進化システム、スクランブルは、新規な構造4を有する誘導体ゲノムを生成するために、これまでにない能力を可能にします。 <p class=「jove_contentは &quot;&gt; Sc2.0ゲノム中のもう一つの主要な設計要素は、合成および野生型DNAの追跡を可能にするために、DNAの透かしとして機能PCRTags、の紹介です。 PCRTagsは、合成染色体上のORFで短い、再符号化されたセグメントです。 PCRTag配列は、合成および野生型の染色体間DNAレベルで異なるが、コードされたタンパク質は、アミノ酸配列、従って、おそらく、機能的に同一です。 PCRTag配列は、具体的に選択的増幅（ 図1A）を容易にするためのプライマー結合部位として設計されています。 PCRTag設計は、典型的には58°Cと60°Cとの間の融解温度を有する天然配列（最小33％）よりも〜60％異なる合成配列を再符号得GeneDesign 5,6中で最も異なる」アルゴリズムを使用して行われます200〜500塩基対2との間のアンプリコンの長さ。これらの領域はに知られているように再符号化は、各ORFの最初の100塩基対の中に許可されていませんコドン使用頻度7の面で特別な好みを持っています。一緒に、これらの設計ルールは、合成および野生型PCRTagプライマー対は、排他的に（ 図1B）は、それぞれ、合成および天然のDNAに結合し、増幅することによりPCR条件の単一セットの下で、ほとんどすべてのPCRTagsの高性能化に有利に働きます。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" /> 図1：PCRTagの概略図（A）PCRTagsはSc2.0染色体上の遺伝子のオープンリーディングフレーム（ORF）内の配列を再符号化されます。 （B）の合成（SYN）と野生型（WT）PCRTagプライマーはもっぱら、それぞれ結合し、（のgDNA）を合成し、野生型ゲノムDNAを増幅します。ここに示されているテンプレートとしてWTまたは半synVIL2たgDNAのいずれかを使用して13 PCRTagプライマー対を試験、染色体6の左腕の約30 kbの断片の分析です。多くの場合、単一のORFは、複数のPを符号化しますCRTag。 PCRTagアンプリコンの存在/非存在は、アガロースゲル電気泳動によって評価します。 PCRTagアンプリコンは200 bpのから500塩基対のサイズの範囲。パネルの下部にあるより速く移動する種は、プライマー二量体です。 PCRTag分析はSc2.0染色体の組み立てにおいて重要なツールであることが証明されました。 20-30 PCRTagsをコードする合成DNAの典型的な実験30〜50キロバイトでは、対応する野生型DNA 1,2,8を置き換えるために酵母細胞に形質転換します。 PCRTag分析はその後DNAのセグメントにまたがる合成ではなく、野生型PCRTags、またはいわゆる「勝者」をコードする形質転換体を同定するために使用されます。これは、「勝者」を識別するために、複数の形質転換体を試験することが通常必要であるため、PCRTag分析のスループットおよびコストが重要な考慮事項です。現在、2 Sc2.0の染色体がSc2.0ゲノムの10％未満を表す、（synIII 1及びsynIXR 2）完了した、ALTハフより残りの染色体の半分以上は、現在、合成およびアセンブリを受けています。このプロジェクトに必要なPCRTag分析の規模は、高速合成DNAおよび野生型DNAの有無をゲルを実行して、手動で得点する能力を上回っています。 我々は、アガロースゲル電気泳動の使用を回避するために、リアルタイムPCRを使用してワークフローを開発したPCRTagアッセイのスループットを向上させます。ワークフローは、私たちはNL 500に反応を小型化することができ、1,536マルチウェルプレートの各ウェルにテンプレートDNAおよびプライマー、および1,536定量PCRサーマルサイクラーを転送するために、ナノスケール音響液体ディスペンサーを定量PCRマスターミックスを配布するバルク液体ディスペンサを利用し、スループットを最大化します。さらに分析を自動化することができます。ハイスループットジェノタイピングこのタイプのプロトコルは、複数の遺伝子座で多くのクローンの分析を必要とするプロジェクトに一般にする必要があります。

<table><tbody><tr><td colspan="4">Yeast gDNA prep</td></tr><tr><td>yeast gDNA</td><td>custom</td><td>custom</td><td>template for real time PCR</td></tr><tr><td>酸洗浄ガラスビーズ (0.5 mm)</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>酵母細胞溶解</td></tr><tr><td>超高純度フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール (25:24:1, v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>酵母細胞溶解</td></tr><tr><td>5432 ミキサー</td><td>Eppendorf</td><td>5432</td><td>酵母細胞溶解</td></tr><tr><td>微量遠心機 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td>酵母細胞溶解</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>Life Technologies</td><td>Q33216</td><td>gDNA 定量</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>gDNA 定量</td></tr><tr><td>Labcyte 384PP plate</td><td>Labcyte</td><td>P-05525</td><td>gDNA source plate</td></tr><tr><td colspan="4">DNA Green Mastermix prep分注</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 DNA Green</td><td>Roche</td><td>5573092001</td><td>リアルタイム PCR マスターミックス</td></tr><tr><td>1.5 ml マイクロフュージ チューブ ホルダー</td><td>ARI</td><td>EST BD060314-1</td><td>マイクロフュージ チューブ ホルダー Cobra のデッキ用</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 マルチウェル プレート</td><td>ロシュ</td><td>5358639001</td><td></td></tr><tr><td>コブラ リキッド ハンドリング システム</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>630-1000-10</td> ディス<td>ペンス qPCR マスター ミックス1536 プレート</td></tr><tr><td>PCR プレート スピナー</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>1536 プレート</td></tr><tr><td colspan="4">テンプレートとプライマー ディスペンス</td></tr><tr><td>PCRTag プライマー</td><td>IDT</td><td>カスタム</td><td>プレミックス フォワードとリバース、50 &mu;M</td></tr><tr><td>各 TempPlate ピアス可能なシーリング ホイル、滅菌</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0110</td><td>PCRTag プライマー プレート用一時シール</td></tr><tr><td>Labcyte LDV 384 ウェル プレート</td><td>Labcyte</td><td>LP-0200</td><td>プレミックス プライマー ソース プレート</td></tr><tr><td>エコー 550 リキッド ハンドラー</td><td>Labcyte</td><td></td><td>転写 プライマーとテンプレート DNA の 2.5 nl 滴を 1536 プレート</td></tr><tr><td>に Plateloc サーマル マイクロプレート シーラー</td><td>アジレント</td><td>1536 プレート用 G5402-90001</td><td>ヒートシール LC1536 実行前に</td></tr><tr><td>クリアパーマネントシール</td><td>Agilent</td><td>24212-001</td><td>LC1536 マルチウェルプレート用光学的にクリアヒートシール</td></tr><tr><td>PlateLoc Roche/LightCycler 1536 プレートステージ</td><td>Agilent</td><td>G5402-20008</td><td>は ~2 mm 厚のワッシャーを置き換えることができます</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR</td><td>Thermo Scientfic</td><td>75-004-521</td><td>遠心分離機ヒートシール 1536 プレート</td></tr><tr><td>産業用空気圧縮機</td><td>Jun</td><td>1795011Echo</td><td>and Heat Sealer</td></tr><tr><td colspan="4">Real Time PCR</td></tr><tr><td>LightCycler 1536</td><td>Roche</td><td></td><td>は220Vのコンセントが必要です</td></tr></tbody></table>

qpcrtag分析 - 高スループット、sc2.0ジェノタイピングのためのリアルタイムpcrアッセイ

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

合成酵母ゲノムプロジェクト（Sc2.0）は16デザイナー酵母染色体を構築し、単一の酵母細胞にそれらを組み合わせることを目指しています。 1合成染色体、synIII 1、および1つの合成染色体腕、synIXR 2とデートするには、構築し、それらのインビボ機能は、対応する野生型の染色体の不存在下で検証されています。 Sc2.0染色体の重要な設計上の特徴は、それらの野生型対応物から合成染色体の分化を可能にするオープンリーディングフレーム（ORF）内の短い、再符号化された配列であるPCRTags、の紹介です。 PCRTagは合成または野生型のいずれかの染色体に選択的にアニールするプライマーおよびDNAの各タイプの存在/非存在は、単純なPCRアッセイを用いて試験することができます。 PCRTagアッセイの標準読み出しは、アガロースゲル電気泳動により、アンプリコンの存在/非存在を評価することです。しかし、1.5キロバイトとAgあたり1の平均PCRTagアンプリコン密度〜12 Mbののenomeサイズは、完成したSc2.0ゲノムは、およそ8,000 PCRTagsをエンコードします。スループットを向上させるために、我々はqPCRTag分析呼び出すPCRTagジェノタイピングのためのリアルタイムPCRベースの検出アッセイを開発しました。ワークフローは、私たちは1回の実験で合成および野生型プライマー対の両方で768 PCRTagsまでテストすることができ、1,536マルチウェルプレートで500 nlの反応を指定します。

我々は、4つの異なる株から抽出した酵母ゲノムDNA（gDNAを）で合成し、野生型染色体3 PCRTagプライマー対1を試験しました。 3番染色体は、染色体の長さにまたがる186 PCRTagプライマー対（synIIIがある〜270キロバイトと野生型の3番染色体がある〜315キロバイト）を有しています。両方のプライマーセットと4つの株のそれぞれを試験するために、我々は、下半分に各象限と野生型の上半分に合成PCRTagプライマーを割り当て、4つの象限、gDNAをそれぞれのタイプごとに1つにマルチウェルプレートを分割しました。ゲノムDNAは、残りの二つのコードする合成染色体3（synIII 1、synIII synIXR）が、野生型染色体3（野生型、synIXR 2）をコードするそのうちの2つの酵母株から抽出しました。定量PCRマスターミックスはで同じ配列したエコー550のプライマーを用いてのgDNAとPCRTagプライマーが続くバルク液体ディスペンサーを使用して、1,536マルチウェルプレートの各ウェルに分注しました。簡単に視覚的に比較するためのマルチウェルプレートの各象限。マルチウェルプレートは、次に、光学的に透明なシールで密閉し、リアルタイムPCR分析に供熱ました。 期待どおりにこのqPCRTag実験では、合成プライマーは、排他的に合成DNAおよびその逆に増幅することにより、大部分が、増幅のために、観察された（ 図2、図3）。しかし、我々はまた、データセット内の偽陰性および偽陽性を示唆して、期待値パターンからいくつかの偏差を観察しました。この実験では、マスターコントロールが正常ウェルプレート上のすべてにマスターミックスを分配バルク液体ディスペンサを示すウェルの100％で検出された（データは示さず）。これは、偽陰性の潜在的な原因を除外する。さらに、いくつかの染色体3 PCRTagsは（ 図 ら AnnaluruのS6およびS7に示す。1）失敗することが知られている、少なくとも2 SYNと1 WTを含みますプライマー対;したがって、これらのウェルを、各象限に無視することができます。真偽陰性が記載されているように、正しいエコー550のキャリブレーションなどのgDNAおよびプライマーの調製を与え、しかし我々の経験では、テンプレートのgDNAまたはプライマーの移動の欠如から生じる可能性があり、これがエラーの主な原因ではなかったです。全体的に、この実験では偽陰性率は、WTテンプレート（〜2％）SYN DNA（〜8％）でのSYNプライマーについて若干高いもののとWTのプライマーのための非常に低かったです。 偽陽性は、SYNプライマーは、WTのgDNA（およびその逆）と混合し、ウェル中のシグナルの検出は、クロス増幅またはプライマーダイマーから生じ得ます。確かに、プライマー二量体は、ゲル電気泳動（ 図1B）によって、多くの場合、表示され、エラーの合理的なソースを表しています。定量PCRの適用のために、融解曲線の試験は、プライマーダイマーなどの異なる種が、信号に寄与することができるかどうかを決定するために有用であり得ます。また、PERFプライマーは、鋳型DNAの非存在下で分配されることにより、対照実験をormingすると二量体化する傾向を有するプライマーを特定するのに役立ちます。あまりにも多くのPCRサイクルが実行される場合は、アニール温度が低すぎるとクロス増幅は、特に、ゲル電気泳動によって観察することができます。我々はqPCRTagプロトコルの両方のパラメータを最適化することによって、クロス増幅に起因する偽陽性の数を最小限にしようとしました。最後に、各ウェルについて交差点（CP）の値を検査することは、リアルタイムベースの検出（ 図3、 例えば、BB22、Fb22、Bb46、Fb46）に適していないプライマーを特定するのに役立ちます。全体的に、この実験では、偽陽性率は、SYNテンプレート（〜10％）とWTプライマーのためのWTテンプレート（〜5％）と高いとSYNのプライマーについて低かったです。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" /> 図2：プレートヒートマップ表示するプレゼンス/ ABqPCRTag実験のためのローミングサービスコール。SYNを分離するために白い破線ゲノムDNA（象限は、固体白い線で区切られた）合成（SYN）を使用してPCRTag分析に供したおよび野生型（WT）3番染色体PCRTagプライマー（4つの異なるタイプ（トップ各象限内）とWT（下））。 WTとsynIXRのgDNAは、WT PCRTagプライマーで増幅を得、野生型染色体3をコードする。synIIIとsynIII synIXRのgDNAがSYN PCRTagプライマーで増幅を得、合成染色体3をコードします。プライマーは、その左から右への染色体の位置に応じて並べて比較のための4つの象限で同じ位置している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" /> 図3：プレート熱クロスポイント（CP）qPCRTag実験の値を表示するマップが、これは、図2と同一のデータセットであり、プレートレイアウトは、したがって、同一です。 N / A &#39;は増幅なし」を意味する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a>

Synthetic Yeast GenomeプロジェクトであるSc2.0のDesigner染色体は、PCRTaggingと呼ばれるPCRベースのジェノタイピングアッセイを使用して、ネイティブの染色体と区別することができます。ここでは、PCRTagジェノタイピングのためのハイスループットリアルタイムPCR検出法について説明します。

qPCRTag分析 - 高スループット、Sc2.0ジェノタイピングのためのリアルタイムPCRアッセイ

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

QPCR TAG分析の全体的な目的は、リアルタイムPCRベースの検出システムと反応の小型化を導入することにより、合成酵母ゲノムプロジェクトのPCR TAGジェノタイピングアッセイのスループットを向上させることです。これは、まずバルクリキッドディスペンサーを用いて、1536ウェルマルチウェルプレートの各ウェルにQPCRマスターミックスを分注することで達成されます。次に、ナノスケール音響液滴射出ロボットを用いて、テンプレートDNAとプライマーをマルチウェルプレートのウェルに転送します。次にプレートを密封し、A-Q-P-C-R サーモサイクラーで反応を行います。最後に、リアルタイム PCR データを解析し、各遺伝子座における合成 PCR タグまたは野生型 PCR タグの有無を判定します。最終的に、この QPCR タグワークフローによってスループットが向上します。この手法の現在のPCR TAGアッセイに対する主な利点は、ゲル電気泳動およびそれらのゲルの手動アノテーションを回避できることです。長い染色体に対するPCRタギングに多大な時間と労力がかかることに気づいたとき、私たちは最初にこの方法を考案しました。約200万個の酵母細胞を培養し回収した後、200 µLの酵母溶解バッファーを加え、ピペットで再懸濁します。ペレットに、細胞層から約1 mm下の位置まで300 µLの酸洗浄ガラスビーズを加えます。次に、ドラフトチャンバー内で200 µLのフェノール・クロロホルム・イソアミルアルコールを加え、チューブを3回反転させて混合し、キャップが密閉されていることを確認します。その後、ベンチトップミキサーを用いて室温で10分間チューブを振盪し、遠心分離後、水層75 µLを1 mLの100% ethanolを含む新しいマイクロ遠心チューブに移します。再度遠心分離した後、チューブを10回反転させて混ぜ、ペレットを剥離させないように注意しながら上清を吸引し、500 µLの70% ethanolを用いてペレットを洗浄します。上清を除去した後、75 µLの10 mM Tris pH 7.4を用いてペレットを再懸濁し、ボルテックスで混合します。DNAを10倍に希釈した後、希釈したgDNA 30 µLを、ナノスケール音響液体分注用のソースプレートの適切なウェルに分注します。1.5 mLマイクロチューブに850 µLのqPCRマスターミックスを準備し、ボルテックスで混合します。次に、20,800 G、室温で2分間遠心分離し、気泡を除去します。その後、バルクディスペンサーを用いて、1536ウェルプレートの各ウェルに500 nLずつ分注します。プレートを短時間遠心し、各ウェルの底にQPCRマスターミックスを集めます。次に、音響液体移送システムを用い、テキストプロトコルに記載された詳細に従って、希釈したGDNA 5 nLと、50 µMに調製済みの正方向および逆方向プライマー 10 nLを、マルチウェルプレートの目的のウェルに分注します。音響液滴技術は、音波を用いて少量の液体をソースプレートから反転させたデスティネーションプレートへ垂直に移送する技術です。ここで、テンプレート、DNA、およびプライマーを2.5 nanoliterのドロップレットの倍数分ずつ、1536ウェルプレートの各ウェルに分注し、QPCRタグ反応をセットアップします。次に、光学的に透明なシールとマイクロプレートシーラーシステムを使用して、1536ウェルプレートを直ちに密封します。密閉したプレートを直ちに室温で2000 Gで3分間遠心分離し、すべての試薬をウェルの底に集めます。その後、テキストプロトコルのガイドラインに従ってQPCR装置でリアルタイムPCRプログラムを実行し、完了後に「run」を押してください。すべてのウェルでマスターコントロールが合格していることを確認してください。これは、ウェル内でQPCRマスターミックスが検出されたことを示しています。合格しなかったウェルは、偽陰性のデータポイントとなる可能性があります。データを解析するため、QPCRソフトウェア内で視覚的に確認するか、または機器からデータをエクスポートしてオフラインで処理します。本実験では、4つの異なる菌株から抽出した酵母gDNAを用いて、野生型および合成3番染色体のPCRタグプライマーペアを試験しました。そのうち2つの菌株は野生型3番染色体を持ち、残りの2つの菌株は合成染色体をコードしていました。予想通り、3種類の合成プライマーは主に合成DNAを増幅し、野生型DNAは増幅しませんでした。同様に、野生型プライマーは野生型DNAからのみアンプリコンを生成しました。少数の偽陽性および偽陰性の発生は予想されることであり、これらのエラーの考えられる原因については、付随するテキストプロトコルに記載されています。この手法を習得すれば、最初から最後まで約1時間で完了させることができます。ご視聴ありがとうございました。皆さんの実験がうまくいくことを願っております。

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