Name: ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュ胚へのマイクロビーズ移植法。タングステン針を用いて組織環境を局所的に操作し、発生生物学における遺伝子発現や器官形成のメカニズムを研究するための技術です。

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この作品は、NIHのグラントDP2OD008470によってサポートされていました。

このプロトコールに記載ゼブラフィッシュの胚を操作するための手順は、ノートルダム大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 1.リンゲル溶液の調製<ol><li>任意の塩の析出を回避するために、継続的な攪拌を介して超純H 2 Oで116のNaCl、2.9のKCl、3.6 mMのCaCl 2を 、および5mMのHepesの溶液を作ります。 </li><li>塩を添加し、溶液が依然として撹拌している間した後、100単位/ mLのあたりペニシリンおよび1mlあたり100μgのストレプトマイシンを追加します。 </li><li>すべての抗生物質との塩を添加した後、滅菌容器内の溶液と店舗のろ過滅菌を行います。 注：N-フェニルチオ尿素（1-フェニル-2-チオ尿素）またはPTUは、胚の健康への悪影響なしにビーズ移植胚における色素の形成を阻止するためにリンゲル液に添加することができます。リンガー/色素ブロッキング溶液を調製し、concenを使用0.003％PTUのtration。原因追加するPTUの低濃度にはPTU粉末の微小量を加えることを避けるために、少なくとも1 L、リンゲル液の大容量がなされることをお勧めします。溶液は攪拌されながら、ステップ1.2の間にPTUを追加します。 </li></ol> 2.トリカイン溶液の調製<ol><li> 9.5のpHにバランスのとれた、超純H 2 Oで作られた1 Mストックから、溶液1L当たり3-アミノ安息香酸エチルメタンスルホン酸塩（トリカイン）の2グラムを加えた0.1Mトリスを追加 注：トリカインビーズ注入表現型をアッセイするために、所望の時点でのゼブラフィッシュ胚を安楽死させるために使用されます。 </li></ol> 3. E3溶液の調製<ol><li> E3の1 Lを作成するために、0.25MのNaCl、10mMの塩化カリウム、12.5ミリモルのCaCl 2、および16.6 mMの硫酸マグネシウムの超純水L 1の溶液を作ります。 </li><li>真菌の増殖を阻害するためにE3溶液にメチレンブルーの200μlを添加します。 </li></ol>マイクロビーズの転送のために針を引っ張る4 <ol><li> 1.0ミリメートル、ID：0.5ミリメートル、長さ10cmでのODでフィラメントと火災研磨ホウケイ酸ガラスを使用してください。 </li><li>細い針を準備するためにマイクロピペットプラーにborosilicatedガラスを置きます。 注：= 245、速度= 200、および時間= 125を引き出し、ヒート= 540：次の4つの寸法は、針を引っ張るための出発点として使用することができます。 </li><li>使用するまで、針の先端を壊す防止するために、粘土や粘着テープのストリップに位置し、針の適切な数、カバーされたプラスチック製のペトリ皿中の店を、引っ張りました。 </li><li>希望ボアサイズに針の先端をトリミングするには、針の端部を獲得するために微細な鉗子のペアを使用しています。 注意：針の穴の大きさは、利用されているマイクロビーズの大きさだけでなく、ユーザーの取り扱いの好みに応じて異なります。 50〜100μmでの範囲のマイクロビーズを利用する場合は良い出発点は、100〜200μmの範囲でクラフトボアサイズにあります。 </li><li>プリオ完成したマイクロビーズの転送装置を形作るために毛細管ホルダーにトリミングされた針を挿入し、使用するには、r。 </li></ol> 5.ウィスカ/ラッシュツールの準備<ol><li>ウィスカー、ラッシュ、または天然または人工毛フィラメントの他の小さなまだしっかり作品を入手します。 45°の角度で、フィラメントのベースの近くにカットします。恒久的に透明な接着剤の接着剤を使用して、P-1000マイクロピペットの先端にウィスカを接着。 </li></ol> 6.マイクロビーズ移植トレイの準備<ol><li> E3溶液100mlを2％E3アガロースゲルを作るためにアガロースを2gを混ぜます。 </li><li>以上バブリングからゲルを回避するために、フラスコを30秒ごとに旋回250mlの三角フラスコに1分30秒間、2％アガロース溶液を加熱します。 </li><li> 60ミリメートル×15ミリメートルペトリ皿の蓋を取り、上向きに内部と大きく150ミリメートル×15 mmディッシュに入れてください。 </li><li>ダウンアンカーに確認しながら、150ミリメートル×15ミリメートルペトリ皿に熱いアガロースゲルを注ぎます人差し指で小さい皿の蓋。 注：アガロースゲルを注ぐときに形成することになる結露を除去するために小さい皿の蓋以下の薄層を許可します。これは、解剖顕微鏡下で見てビーズが容易になります。 </li><li>アガロースが冷却されると、それが固化する前に、ゲルのウェル金型を配置します。これは、胚の容易な配置を可能にします。 </li><li>注：それはゲルの上に浮遊するまで、ウェル内の気泡を回避するために、角度でゆっくりと金型を配置します。 </li><li>ゲルが固化した後にミクロを使用して、慎重に井戸型を削除します。 4℃でE3のソリューションとストアを追加します。 </li></ol> 7.胚コレクション<ol><li>システム水でそれらを充填し、その後チャンバーO / Nで大人のゼブラフィッシュの雄（複数可）とメス（S）のペアを配置することにより、分周器によって分離された嵌合室を準備します。 </li><li>細かい金網ストレーナーを使用して受精卵を収集し（胚のステージは若干異なります）。 </li><li>そこに皿の中のE3溶液約25ミリリットルをストレーナーに残された卵がなくなるまで逆さまにストレーナを回すとE3の細い流れでそれをすすぐことによって、クリーン、直径10cmシャーレに受精卵を堆積し、。 </li><li>収集後、クラッチ内の発達非同期につながり、困難な所望の時間点を収集するかもしれない過密を回避するために、いくつかの皿（皿当たり約50〜60の卵）に卵を割ります。 </li><li>標準的なゼブラフィッシュステージングシリーズ40に従って発達評価を可能にするために28.5℃のE3溶液中で胚をインキュベートします。 注：胚は、古い段階での操作は、光学的透明度を必要とする場合は、顔料の開発を防ぐために、24時間後に受精（HPF）でE3 / PTUに転送する必要があります。 </li></ol> 8.ビーズ移植<ol><li>所望の試験分子濃度のマイクロビーズまたは対応する車両のインキュベート適切な量​​で必要な時間のためのolution。 注：研究者は、溶液内のマイクロビーズの可視化を可能にするどちらの無菌直径3〜6センチメートル範囲のペトリ皿、またはマルチウェルプレートを使用することができます。時間は、目的の分子の種類や量に応じて変えることができる、と研究者は、インキュベーションの持続時間と、光や温度に対する感度などの他の側面については、メーカーまたは公開勧告を参照してください。 </li><li>胚は、所望の発達の時点に到達した後、微細な鉗子を使用して、絨毛膜から胚を削除します。 </li><li>溶液に、それらを順応さ10分間の抗生物質でろ過リンゲル液中の胚を培養します。 </li><li>胚が順応している間、注入トレイに囲まビーズプレートにビーズを移し、10分間、リンゲル液でそれらを洗浄。 注：この時点に到達した後、50分以内にビーズを埋め込みます。このW病気の一つは目的の分子の小さい濃度のビーズを注入する可能性を減少させます。 </li><li>マイクロビーズが移植される関心領域がアクセス可能であるように、それらの向きに注意しながらマイクロビーズ注入トレイのウェルに配列胚を、。 </li><li>タングステン針を使用して胚に小さな切開を行います。 </li><li>静かにキャピラリカラムにマイクロビーズを引っ張る、ピペットの電球を押下し、目的の宛先にマイクロビーズを転送するために圧力を解放する：マイクロキャピラリートランスファーピペットを用いて、胚にマイクロビーズを転送します。 </li><li>胚の内部にマイクロビーズを配置するためにウィスカー/ラッシュツールを使用します。注：それが治癒するようにマイクロビーズは、胚から追放されることはありませんので、切開部位から離れた組織へのマイクロビーズを配置するようにしてください。 </li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

過去一世紀にわたり、ボディープランのパターニングおよび器官形成の理解は記念碑的な進歩を遂げています。組織操作技術は、これらの重要なプロセスに関する重要な情報を暴くで批判しました。遺伝子改変は、遺伝子機能を確認するための最も一般的に使用される方法の一つであり、そのような細胞移植などのモザイク分析方法は、遺伝子機能の自律性を理解するための有用なアプローチを提供します。マイクロビーズの注入は、この方法は、シグナル伝達分子または阻害剤を導入することにより、局所的な組織の環境を変更するために研究者を可能にするように、発達のダイナミクスを変更する方法を特定の分子尋問するために別の会場を提供しています。異なるマイクロビーズの範囲は、様々なサイズ及び他の物理的特性は、それらが目的の実験条件のために使用することができるように（ 例えば、電荷）が存在したので、市販されています。したがって、タンパク質またはケミに浸漬されたマイクロビーズを注入することにより生体内の関心の的、研究者が開発中に局所的な影響を調査し、関心と特定の生物学的表現型（複数可）の遺伝子または分子との間の関連を見つけることができます。 このようなゼブラフィッシュ23で前方脳頭蓋（ANC）における骨格パターニングにおける増加したヘッジホッグシグナル伝達の効果を評価するために、マイクロビーズの注入を使用和田らによって行われたものと研究。以前の研究でのShhは、ANC形成14に必要とされることを示しています。 Shhのコーティングされたマイクロビーズの研究を使用して、この信号はANCに軟骨形成を促進することを確認しました。マイクロビーズの注入工程はANCにおけるヘッジホッグシグナリングおよび軟骨形成の間に明確な関連性を実証するために使用されました。ゼブラフィッシュでは、この組織の操作技術のもう一つの重要な例は、科学者がErythroblastoma二十六（ETS）ドメインfの転写制御を調査した研究で観察されます初期のゼブラフィッシュの脳の発達19中のFGFシグナリングによる俳優ETS関連分子（ERM）およびポリオーマエンハンサー活性化因子3（PEA3）。マイクロビーズの移植実験を通じ、彼らはFGF8とFGF3は異所的にERMとPEA3の発現を活性化することができることを示すことができました。これらの例は、遺伝子発現を評価するための41の方法を使用することによって十分に特徴付けられる組織形成の発達の間に協力機構への洞察を提供するために、マイクロビーズの有用性を示しています。このように、マイクロビーズの移植は、腎臓を生じる中間中胚葉（IM）などの他の組織を、探検する実行可能な方法であることができます。具体的には、ネフロンにどのような影響を与えるか異なる分子を調査するために、腎臓の発達研究に役立つだろう、表面的にしか存在で理解されているプロセスを42と細管形成43,44セグメンテーション 。また、マイクロビーズの注入をスタッドに使用され始めていますY再生ゼブラフィッシュ29の処理]このようなネフロン45のような、または対応する成体構造に研究を実行するために策定されている方法と組み合わせて胚組織のレーザアブレーションを以下のように、臓器再生モデルの任意の数で使用するために適合させることができます46-49。最後に、マイクロビーズの注入は、癌50,51または組織変性52,53などのヒト疾患のモデルで使用される可能性を有します。 本プロトコルでは、我々はまた、同様に他の研究者によって記載されますが、ビデオプロトコル1を介して図示していないされたゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズ移植の方法を示しています。最小限の練習で、私たちは、研究者はいくつかの経験を持っていたら、この手順の実行可能性に関する8-10胚/時のおおよその速度でマイクロビーズを注入することができました。本明細書に示された結果は、様々なDのビーズを実証しますimensionsは初期段階で注入することができ、注意していることを、この組織操作技術は、胚への最小限の物理的破壊を用いて実施することができます。強調されるべきである1つの改良は、胚にマイクロビーズを配置するウィスカー/ラッシュツールの使用です。機器のこの比較的安価でシンプルな作品は、マイクロビーズと同じ直径程度で入手が容易で、注入プロセスをスピードアップするのに役立ちます。ウィスカー/ラッシュは、研究者の器用さや好みに応じて、まだ繊細なビーズハンドリングツール会社を生成するために所望の長さに切断することができます。我々は物理的に注入を行うマイクロビーズとゼブラフィッシュの胚を操作する方法をここで説明しながら最後に、このプロトコルは、異なる薬剤またはペプチドに特異的処理手順の概要を説明していません。一般に、化学的に処理されたマイクロビーズは、生物の他の領域における望ましくない効果を回避するために、便宜に動物に移植されるべきであり、研究者は、ウェル中にあるべきです彼らの研究を開始する前に、そのような化学物質に関連する可能安全性の懸念の周りに形成されました。 合計では、実験室で容易に入手可能な材料を使用してアプリケーションの広い範囲で比較的簡単かつ効率的なマイクロビーズの注入方法を実証しました。最終的には、このマニュアルでは、ゼブラフィッシュ組織操作の繊細な自然と研究者を支援することを願っています。

発生生物学の研究者は、生物がどのように形成されるか制御するメカニズムを解明するために、細胞の分子、および遺伝学的方法の広大な配列を利用します。これらのアプローチの中で、組織操作は、細胞の運命、セルラー移動、および組織の組織に関する複雑な問題の解読において重要なツールです。局所組織環境を変化させる一つの方法は、タンパク質または他のシグナル伝達分子1の焦点源を送達するために使用されるマイクロビーズの外科的適用によるものです。実験操作のこのタイプは、広くそのようなカエルとひよこ2のように、古典的な脊椎動物の発生学モデルに実装されています。 ゼブラフィッシュは、器官形成の研究のための重要な脊椎動物のモデル生物となり、また、彼らは人間6で高い遺伝的保存を共有するような疾患モデル3-5のために多くのユニークな利点を提供しています。特に、光学的透明性およびexゼブラフィッシュ胚のternal開発は、組織個体発生3-5の観察のための比類のない視点を提供しています。大規模フォワード遺伝子スクリーニングの実施は、さらなる研究7,8、および効率的に単一の研究室9,10に縮尺で行うことができる代替のスクリーニング技術を識別するためのゼブラフィッシュ変異株の強力なリポジトリを生成しました。ゼブラフィッシュを用いたさらなる実験作業は、トランスジェニックの方法論の進歩によって容易と遺伝的アプローチ11,12、並びに化学遺伝学13-15を逆転されています。 このようなマイクロビーズの実装などの組織操作技術は、広くはゼブラフィッシュで用い、それにもかかわらず、さらに開発中に細胞のシグナル伝達を理解するための有用なツールを提供していません。マイクロビーズの注入は、ゼブラフィッシュ網膜における器官形成の過程を調べるために使用されています16,17、心臓18、脳19-22、神経堤23、およびフィン24,25。これらおよび他の研究では、ビーズは、勾配は、細胞遊走27と軸28のパターニングにどのように影響するかのシグナル伝達分子26の拡散を理解するために開発中に適用されてきました。より最近では、マイクロビーズは、ゼブラフィッシュ、成人29に再生機構を評価するために利用されています。発達研究では、例えば、ゼブラフィッシュマイクロビーズワークは胸びれ25の研究を通じて肢形成のメカニズムへの洞察を提供してきました。ゼブラフィッシュの胸びれの芽は、マウス30とひよこ31で前肢芽に相同です。 ソニックヘッジホッグ（Shhの）の発現および下流のHox遺伝子標的を介して前方対後方軸を確立する偏光活性（ZPA）のゾーン、：脊椎動物の肢芽は、2つの重要なシグナル伝達ノードを持っていますおよび線維芽細胞増殖因子（FGF）の発現を介して四肢の先端アイデンティティの近位を確立するように作用する肢芽の先端に存在する外胚葉性頂堤（AER）。ゼブラフィッシュShhの遺伝的変異体の中にのFgf浸したマイクロビーズを注入することにより、研究者ら脊椎動物の肢25の細胞周期および成長の進行に必須であるとのFgfが同定されました。に加えて 位置アイデンティティを確立FGF およびShhのシグナル伝達カスケード、アイデンティティ32を後方より前方を確立するために、偏光領域の作用を模倣することができる分子としてレチノイン酸（RA）が同定ニワトリ肢芽を使用して先駆的な研究。ニワトリ肢にRA-浸したワットマン濾紙の小片を置く関与これらの実験は、桁のパターニング32を評価しました。さらに、研究者はマイクロビーズの使用を採用し、他のエレガントな研究を行っている、細胞移植、および外因性ゼブラフィッシュにおけるRAの治療は、RAは、ゼブラフィッシュ後脳および中胚葉28内に長距離の位置の手がかりを提供するために作用することを決定しました。しかし、現在では多くの疑問が脊椎動物の発生の多くの側面の間にFGFおよびRAのような要因をシグナリングの役割について残ります。 RAのシグナリング効果は、モルフォゲンとして作用し、そのようなRAは、近位腎細胞が運命35-39を入力指定開発心臓34および腎前駆細胞、など多くの臓器33を 、影響を与えます。そのような話題のさらなる理解は、組織操作およびマイクロビーズ注入技術を用いた実験的研究から大きく利益を得ることができます。 少数の研究は、ゼブラフィッシュでマイクロビーズを注入して行われてきたが、ニワトリなどのモデルと比較すると、実施されたものは非常に有益でした。ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植ベース - 研究の不足の1つの理由はlikelですY障害が正常にそのような操作を実行するために構成する胚の大きさに基づいて、困難な技術的課題が存在するという考え。しかし、ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの注入が実際に学び、技術の目視で支援し、したがって開発のメカニズムを調べるための手段として追求することができますすることができます。ここでは、組織形成および細胞形態形成に多種多様なアッセイを行うために利用することができるゼブラフィッシュ胚にマイクロビーズの正確な適用を実証します。

<table><tbody><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>アメリカのバイオアナリシス</td><td>AB01915</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>アメリカのバイオアナリシス</td><td>AB01652</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>アメリカのバイオアナリ</td><td>シスAB00366</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ ライフサイエンス</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P4333-20ML</td><td></td></tr><tr><td>N-フェニルチオ尿素 (PTU)</td><td>Aldrich Chemistry</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>3-アミノ安息香酸エチル (トリカイン)</td><td>Fluka Analytical</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>BF100-50-10</td><td></td></tr><tr><td>フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー</td><td>Sutter Instruments Co.</td><td>Mo. P097</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>メチレンブルー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td></td></tr><tr><td>250 ml 三角フラスコ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FB-500-250</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 使い捨てシャーレ、滅菌コー</td><td>ニング</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>60 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>100 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td></td></tr><tr><td>150 mm x 15 mm</td><td>VWR</td><td>25373-187</td><td></td></tr><tr><td>サンゴバンケムウェア マイクロスパチュラ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>21-401-50B</td><td></td></tr><tr><td>P-1000 マイクロピペットチップ</td><td>フィッシャーサイエンティ</td>フィック <td>2707402</td><td></td></tr><tr><td>低温インキュベーター</td><td>フィッシャーScientific</td><td>11 690 516DQ</td><td></td></tr><tr><td>二メトリースルホキシド</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435</td><td></td></tr><tr><td>Microビーズ (45-106 &micro;m)</td><td>Biorad</td><td>140-1454 AG1-X8</td><td></td></tr><tr><td>マイクロビーズ(45 &m)</td><td>Polysciences</td><td>7314</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ解剖ピンセット</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5010</td><td></td></tr><tr><td>タングステンニードル</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6065</td><td></td></tr><tr><td>キャピラリーチューブホルダー</td><td>Globe Scientific Inc.&nbsp;</td><td>51674</td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

ゼブラフィッシュは、発生生物学と疾患の研究のための貴重な遺伝モデル系として浮上しています。ゼブラフィッシュは、ヒトを含む他の脊椎動物で、高いゲノム保存の程度、ならびに、細胞の分子および生理学的プロセスの類似性を共有しています。初期の個体発生時には、ゼブラフィッシュの胚は、研究者は、単純な実体顕微鏡を用いて器官の動態を可視化することができ、光学的に透明です。マイクロビーズの注入は、ローカル環境での要因の変化を通じて組織操作を可能にする方法です。これは、研究者が胚内の特定の空間的および時間的ポイントでは、このような分泌ペプチドなどの目的の分子を、シグナル伝達の任意の数の影響を分析することができます。ここでは、詳細初期のゼブラフィッシュの開発中に操作し、インプラントのビーズの方法のためのプロトコル。

操作ツールのいくつかのタイプは、研究用途（ 図1）中にビーズを処理するために有用です。また、小さなウェルを有する単純なアガロースモールドをタイムリーかつ効率的にこれらの実験を行うことが重要であるゼブラフィッシュ胚（ 図1）を保持するために利用することができます。マイクロビーズの注入は、研究者は、目的の分子のための行動の特定のウィンドウを狭くすることを可能にする空間的な位置と目的の一時的な段階で実施することができます。 ここでは、単一のマイクロビーズを、尾芽の段階で、または体節形成の段階で後の時点（ 図3）で、ゼブラフィッシュの胚に移植しました。単独リンゲル液でリンス二つの異なるサイズのマイクロビーズは、このプロトコルのデモ（ 図3A、3Bおよび3C）で使用しました。任意のコンジュゲートの非存在下でのこのマイクロビーズ注入小分子は、ビーズの注入は、ゼブラフィッシュ胚（ 図4）の適切な発達の間に総形態学的影響を与えることなく達成することができることを示しています。 実験者は、胚の上にタングステン針で作られた穿刺孔内にマイクロビーズを操作すると問題が発生することができます。一度、マイクロニードルによって胚上に配置されたマイクロビーズのより良好な取り扱いを実現するために、ウィスカー/ラッシュツールを使用することができます。他の天然または合成ラッシュフィラメントが（ 図1）を利用することができるが、これは、自然にネコやイヌのウィスカーを当てると細工されたことができます。タングステン針またはウィスカーツールのどちらかとマイクロビーズの穏やかなプッシュがマイクロビーズは、金型のリンゲル液に沈む表示されるはずです。マイクロビーズは、タングステン針を使用して、必要であれば、それは大きな距離を移動する必要があり、金型の中に沈んでいるといったん胚の上に針又はウィスカーツールがpositioするために使用することができたら胚にマイクロビーズをn個。ビードが安定した組織内に配置されたままになりますようにマイクロビーズの移植の成功はすぐに、実体顕微鏡で可視化を介して測ることができます。経時ビード位置を評価するために、各胚サンプルを生経時撮影を通して画像化することができ、又は（ 図4に示されるように）ビーズの位置が内因性組織の実験期間にわたってシフトしていないことを確認するために定期的にチェック形態形成。時間をかけてビーズの位置を理解することは、そのような標的組織または発生過程での小分子の影響を評価するような結果、ほとんどの情報に解釈のために重要です。 これらの上記の手順を使用すると、所望の時間と位置にゼブラフィッシュ胚にマイクロビーズを埋め込むに理想的な環境を提供します。我々の経験では、このマイクロビーズ注入プロトコルの初心者ユーザーは、通常のスキルNEを獲得しました練習の約1週間後のゼブラフィッシュ胚にマイクロビーズの一貫した外科的移植を実行するためのcessary。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig1.jpg" /> 図1.ツールはマイクロビーズの注入を行うために使用される。（A）ビーズ注入トレイ（左、直径15cm）胚の型と（左側）とマイクロビーズのインキュベーショントレイ（右側の、直径6cm）。この作業トレイはマイクロビーズの移植のために所望の向きに胚を配置するために、顕微鏡ステーションで近接して移植のための準備マイクロビーズを持っている研究者を可能にします。マイクロビーズは、顕微鏡ステーションの下に配置されたビード注入トレイにそれらを配置する前に（右）小分子（単数または複数）および/またはビヒクル中でインキュベートした後、独立したマイクロビーズプレート中でリンスすべきです。 （B）微細鉗子2対の蝶理を除去するために使用されますマイクロキャピラリー針の端部を破壊するために、各ゼブラフィッシュ胚を取り囲み、上。 （C）タングステン針がマイクロビーズを配置するにはゼブラフィッシュ胚に非常に微細な穿刺を行うために使用されるであろう。 （D）マイクロキャピラリートランスファーピペットをピックアップし、穿 ​​刺部位付近のゼブラフィッシュ胚の上にマイクロビーズを配置するために使用されます。 （E）ウィスカー/ラッシュツールは、以前にタングステン針で作られた胚内の切開部位にマイクロビーズの穏やかな位置決めが可能になります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig2.jpg" /> マイクロビーズの移植手順の図2の回路図。（A）マイクロビーズsoakiとマイクロビーズ注入トレイ希望の洗浄溶液中にngのは、実体顕微鏡ステーションの下に設置し、胚組織が上向きに配置されています。 （B）、タングステン針を使用して、胎児への小さな切開は僅かにまだ力強い動きで行うことができます。 （C）マイクロキャピラリートランスファーピペットを用いて、所望のマイクロビーズが右側に位置し、トレイのマイクロビーズのインキュベーションチャンバーから取り出し、そして胚作業領域が位置する左区画にすることができます。マイクロビーズを静かにウィスカー/ラッシュツールを使用して、タングステン針で作られた切開部位に位置し、その後、切開部位の近くに堆積されるべきです。マイクロビーズは、切開部位に操縦されると、それは安定したマイクロビーズを配置し、開発が進むにつれて、胚から後続の動きを防ぐために（離れて切開）から組織内に押し込まれるべきである。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig2large.jpg" target="_blank">P</a>リースこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig3.jpg" /> 図3.マイクロビーズは、異なる発生段階の胚に移植することができる。（A）ゼブラフィッシュの胚を尾芽段階でトランクにマイクロビーズ（約50μmの直径）を移植しました。 24時間後のビーズインプラント（hpbi）で検査すると、胚が正常に発達したとマイクロビーズは、発生時間の経過の間に最小限の動きを示しました。 3体節期（SS）で卵黄嚢に（約50ミクロンの直径を有する）マイクロビーズを移植した（B）ゼブラフィッシュの胚は、時間の経過とともに、比較的マイナーなビーズの動きと正常な発達を示しました。 （C）拡大マイクロビーズ（約70ミクロンの直径）は、同様に通常のその後の発展だけでなく、ミニを示した7 SS胚に移植しましたMALは、移植部位からの動きが。場合は<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig3large.jpg" target="_blank">、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52943/52943fig4.jpg" /> ゼブラフィッシュ胚の図4.総開発は72 hpbi介してマイクロビーズの存在によって乱されていないです。ゼブラフィッシュ胚は7体節ステージ（SS）での（約50μmの直径を有する）リンゲル液に浸したマイクロビーズを移植しました。各マイクロビーズは、外科的に体節3と4の間に、トランクに挿入したビーズの存在は24時間後のビーズインプラントで明白な発達障害（hpbi）、48 hpbi、または72 hpbiと関連しなかった。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52943/52943fig4large.jpg" target="_blank">ご覧になるにはこちらをクリックしてくださいこの図の拡大版。</a>

ゼブラフィッシュは、遺伝学および発生研究のための優れたモデルシステムです。ビーズ移植は、局所的な細胞環境の変化を導入することにより、発生メカニズムを調査するために使用できる貴重な組織操作技術です。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュの胚にマイクロビーズ移植を行う方法について説明します。

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

本実験の全体的な目的は、マイクロビーズの埋植を用いて、ゼブラフィッシュの胚発生における特定の空間的および時間的な時点で局所的な組織環境に変化を導入することである。まず、マイクロビーズの精密な操作と埋植を容易にするためにビーズ埋植用トレイを準備する。次に、ゼブラフィッシュの卵を目的の発生段階まで培養する。次に、マイクロビーズを適切な実験用溶液で調製し、胚内の目的の場所へ慎重に移植します。最終的に、マイクロビーズの移植はゼブラフィッシュの正常な発生を妨げることなく行うことができ、これにより、目的の分子がゼブラフィッシュの胚発生に及ぼす影響を評価することが可能になります。この手法は、異なる分子が器官形成のプロセスにどのように影響するかなど、発生生物学分野における重要な疑問の解明に役立ちます。一般的に、この手法に不慣れな方は、マイクロビーズの操作に習熟するまで練習が必要なため、苦労することがあります。マイクロビーズ植え込み用トレイを準備するために、まず、調製したばかりの2%aro溶液を90秒間加熱します。250 milliliterのエルレンマイヤーフラスコを用い、ゲルの沸騰による溢れ出しを防ぐため、30秒ごとにフラスコを回してください。次に、60 × 15 mmのペトリ皿の蓋を、蓋の内側を上に向けて150 × 15 mmの皿の中に置きます。その後、小さなペトリ皿の蓋を人差し指で固定しながら、熱いアガロースゲルを大きな皿に注ぎます。凝結水の形成を防ぎ、agrosが冷却される際に顕微鏡下でビーズを確認しやすくするため、小さな蓋の下に薄いagrosの層を形成させます。ただし、ゲルが凝固する前に、胚を配置しやすくするため、ウェルモールドをゲルの上部にゆっくりと傾けて挿入します。ゲルが凝固したら、マイクロスパチュラを使用してウェルモールドを注意深く取り除きます。次に、E3溶液をディッシュに加え、4 °Cで保存します。ゼブラフィッシュの胚を回収するには、交配チャンバーにシステムウォーターを満たします。その後、チャンバーの中央に仕切りを置き、成体のオスとメスのゼブラフィッシュをチャンバーの適切な側にそれぞれ入れます。翌朝、目の細かいワイヤーメッシュストレーナーを使用して受精卵を回収します。ストレーナーを清潔な10 centimeterのシャーレ内で逆さまにし、ストレーナーの中に卵がなくなるまで、E threeを細い流れで注いでメッシュを洗浄し、シャーレ内に約25 millilitersのE three溶液が入った状態にします。その後、過密状態を避けるため、1皿あたり50から60個の割合で卵を複数のシャーレに分配し、マイクロビーズを植え込む前に、卵を28.5 degrees CelsiusのE three溶液中でインキュベートします。その後、目的のテスト分子またはコントロール溶媒を適切な量で加え、適切な期間インキュベートします。胚が目的の発達段階に達したら、微小ピンセットを用いて卵膜（chorion）を除去し、抗生物質を添加したろ過済みリンガー液中でゼブラフィッシュを10分間インキュベートして順化させます。マイクロビーズを、インプランテーショントレイ内に設置したあらかじめ準備済みのマイクロビーズプレートに移し、ビーズとリンガー液を10分間洗浄します。ビーズを洗浄してから50分以内に、マイクロビーズの移植部位にアクセスできるよう、インプランテーショントレーのウェル内で胚を1つずつ配列します。タングステン針を用いて胚に小さな切開を加え、次にマイクロキャピラリー転送ピペットのバルブを押し、マイクロビーズをキャピラリーカラム内にゆっくりと吸い込みます。その後、圧力を解放してマイクロビーズをインプランテーショントレーに送り出し、取り扱いやすくします。ビーズをそっと押し、モールド内のリンゲル液の中に沈めます。次に、マイクロニードルを使用して、マイクロビーズを胚の上、切開口の中へと移動させます。最後に、ウィスカーツールを用いてマイクロビーズを切開部位から遠ざけ、治癒過程でビーズが押し出されないようにします。これにより、ビーズが組織内に安定して配置されるため、ステレオ顕微鏡を用いてマイクロビーズの移植が成功したかどうかを直ちに判定できます。本実験では、リンゲル液のみで洗浄した2つの異なるサイズの単一マイクロビーズを、尾芽期または筋形成が進む後の時点のゼブラフィッシュ胚に移植し、内因性の組織形態形成によって実験期間中にビーズの位置がずれていないことを確認しました。胚サンプルは、タイムラプス写真による可視化、あるいは画像で示されるマイクロビーズ移植部位の定期的確認によって観察可能です。いかなる共役体も存在しない場合、通常の発生過程において、SPR魚胚に重大な形態学的影響を与えることなく低分子化を達成できます。本手順に続いて、Microbeadが遺伝子発現にどのような影響を与えるかを調べるために、Whole Mount In situ hybridizationなどの他の手法を実施することができます。全体として、時間の経過に伴うビーズの位置を把握することは、標的組織や発生過程に対する小分子の影響を評価するなど、結果を解釈する上で極めて重要です。

microbead-implantation-in-the-zebrafish-embryo

Research

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ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植

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