ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植

本実験の全体的な目的は、マイクロビーズの埋植を用いて、ゼブラフィッシュの胚発生における特定の空間的および時間的な時点で局所的な組織環境に変化を導入することである。まず、マイクロビーズの精密な操作と埋植を容易にするためにビーズ埋植用トレイを準備する。次に、ゼブラフィッシュの卵を目的の発生段階まで培養する。

次に、マイクロビーズを適切な実験用溶液で調製し、胚内の目的の場所へ慎重に移植します。最終的に、マイクロビーズの移植はゼブラフィッシュの正常な発生を妨げることなく行うことができ、これにより、目的の分子がゼブラフィッシュの胚発生に及ぼす影響を評価することが可能になります。この手法は、異なる分子が器官形成のプロセスにどのように影響するかなど、発生生物学分野における重要な疑問の解明に役立ちます。

一般的に、この手法に不慣れな方は、マイクロビーズの操作に習熟するまで練習が必要なため、苦労することがあります。マイクロビーズ植え込み用トレイを準備するために、まず、調製したばかりの2%aro溶液を90秒間加熱します。250 milliliterのエルレンマイヤーフラスコを用い、ゲルの沸騰による溢れ出しを防ぐため、30秒ごとにフラスコを回してください。

次に、60 × 15 mmのペトリ皿の蓋を、蓋の内側を上に向けて150 × 15 mmの皿の中に置きます。その後、小さなペトリ皿の蓋を人差し指で固定しながら、熱いアガロースゲルを大きな皿に注ぎます。

凝結水の形成を防ぎ、agrosが冷却される際に顕微鏡下でビーズを確認しやすくするため、小さな蓋の下に薄いagrosの層を形成させます。ただし、ゲルが凝固する前に、胚を配置しやすくするため、ウェルモールドをゲルの上部にゆっくりと傾けて挿入します。ゲルが凝固したら、マイクロスパチュラを使用してウェルモールドを注意深く取り除きます。

次に、E3溶液をディッシュに加え、4 °Cで保存します。ゼブラフィッシュの胚を回収するには、交配チャンバーにシステムウォーターを満たします。その後、チャンバーの中央に仕切りを置き、成体のオスとメスのゼブラフィッシュをチャンバーの適切な側にそれぞれ入れます。

翌朝、目の細かいワイヤーメッシュストレーナーを使用して受精卵を回収します。ストレーナーを清潔な10 centimeterのシャーレ内で逆さまにし、ストレーナーの中に卵がなくなるまで、E threeを細い流れで注いでメッシュを洗浄し、シャーレ内に約25 millilitersのE three溶液が入った状態にします。その後、過密状態を避けるため、1皿あたり50から60個の割合で卵を複数のシャーレに分配し、マイクロビーズを植え込む前に、卵を28.5 degrees CelsiusのE three溶液中でインキュベートします。その後、目的のテスト分子またはコントロール溶媒を適切な量で加え、適切な期間インキュベートします。

胚が目的の発達段階に達したら、微小ピンセットを用いて卵膜（chorion）を除去し、抗生物質を添加したろ過済みリンガー液中でゼブラフィッシュを10分間インキュベートして順化させます。マイクロビーズを、インプランテーショントレイ内に設置したあらかじめ準備済みのマイクロビーズプレートに移し、ビーズとリンガー液を10分間洗浄します。

ビーズを洗浄してから50分以内に、マイクロビーズの移植部位にアクセスできるよう、インプランテーショントレーのウェル内で胚を1つずつ配列します。タングステン針を用いて胚に小さな切開を加え、次にマイクロキャピラリー転送ピペットのバルブを押し、マイクロビーズをキャピラリーカラム内にゆっくりと吸い込みます。その後、圧力を解放してマイクロビーズをインプランテーショントレーに送り出し、取り扱いやすくします。ビーズをそっと押し、モールド内のリンゲル液の中に沈めます。

次に、マイクロニードルを使用して、マイクロビーズを胚の上、切開口の中へと移動させます。最後に、ウィスカーツールを用いてマイクロビーズを切開部位から遠ざけ、治癒過程でビーズが押し出されないようにします。これにより、ビーズが組織内に安定して配置されるため、ステレオ顕微鏡を用いてマイクロビーズの移植が成功したかどうかを直ちに判定できます。

本実験では、リンゲル液のみで洗浄した2つの異なるサイズの単一マイクロビーズを、尾芽期または筋形成が進む後の時点のゼブラフィッシュ胚に移植し、内因性の組織形態形成によって実験期間中にビーズの位置がずれていないことを確認しました。胚サンプルは、タイムラプス写真による可視化、あるいは画像で示されるマイクロビーズ移植部位の定期的確認によって観察可能です。いかなる共役体も存在しない場合、通常の発生過程において、SPR魚胚に重大な形態学的影響を与えることなく低分子化を達成できます。

本手順に続いて、Microbeadが遺伝子発現にどのような影響を与えるかを調べるために、Whole Mount In situ hybridizationなどの他の手法を実施することができます。全体として、時間の経過に伴うビーズの位置を把握することは、標的組織や発生過程に対する小分子の影響を評価するなど、結果を解釈する上で極めて重要です。