ゼブラフィッシュ胚におけるマイクロビーズの移植

ゼブラフィッシュは、遺伝学および発生研究のための優れたモデルシステムです。ビーズ移植は、局所的な細胞環境の変化を導入することにより、発生メカニズムを調査するために使用できる貴重な組織操作技術です。このプロトコルでは、ゼブラフィッシュの胚にマイクロビーズ移植を行う方法について説明します。

次の実験の全体的な目標は、マイクロビーズ移植を使用して、ゼブラフィッシュの胚発生中に特定の空間的および時間的ポイントで局所組織環境に変化を導入することです。これは、マイクロビーズの正確な取り扱いと埋め込みを容易にするために、最初にビーズ注入トレイを準備することによって達成されます。第2のステップとして、ゼブラフィッシュの卵を所望の発育段階まで孵化させます。

次に、マイクロビーズを適切な実験溶液で調製し、胚内の目的の場所に慎重に移します。最終的には、マイクロビーズ移植は、正常なゼブラフィッシュの発育を中断することなく行うことができ、目的の分子がゼブラフィッシュの胚形成に及ぼす影響を評価することができます。この方法は、さまざまな分子が器官形成のプロセスにどのように影響するかなど、発生生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

一般的に、この方法に不慣れな個人は、マイクロビーズの取り扱いに熟練するために練習が必要なため、苦労するでしょう。マイクロビーズ注入トレイを準備するには、まず、新たに調製した2%aro溶液を90秒間加熱します。250ミリリットルの三角フラスコで、30秒ごとにフラスコを渦巻かせ、ゲルが泡立つのを防ぎます。

次に、60 x 15 mmのシャーレの蓋を、蓋の内部を上に向けて150 x 15mmのシャーレに入れます。次に、小さい方のシャーレの蓋を人差し指で固定します。ホットアロスジェルを大きな皿に注ぎます。

小さい方の蓋の下にアグロスの薄い層を形成することで、結露の発生を防ぎ、アグロスが冷えるにつれて顕微鏡でビーズが見やすくなります。しかし、それが固まる前に、胚の配置を容易にするために、ゲルの上部に井戸型をゆっくりと傾けます。ゲルが固まったら、マイクロスパチュラを使用してウェル型を慎重に取り除きます。

次に、E 3溶液を皿に加え、摂氏4度で保存します。ゼブラフィッシュの胚を採取するには、交配室にシステム水を入れます。次に、チャンバーの中央に仕切りを置き、大人のオスとメスのゼブラフィッシュをチャンバーの適切な側面に追加します。

翌朝、細かい金網のストレーナーを使用して受精卵を収集します。きれいな10センチメートルのシャーレの中でストレーナーを逆さまにし、ストレーナーに卵が残らなくなるまで、Eスリーの細かい流れでメッシュをすすぎ、ディッシュに約25ミリリットルのEスリー溶液があります。次に、過密を避けるために皿ごとに50〜60個の卵で卵をいくつかの皿に分け、マイクロビーズを移植する前に摂氏28.5度のE 3溶液で卵をインキュベートし、適切な量のテスト、目的の分子、または適切な期間の制御ビヒクルでそれらをインキュベートします。

次に、胚が目的の発生時点に達したら、細い鉗子を使用して胚のコンを取り除き、ろ過されたリンガー溶液でゼブラフィッシュをインキュベートします。胚が順応している間、10分間抗生物質を補給します。マイクロビーズを、移植トレイ内に収まるように準備したマイクロビーズプレートに移し、ビーズとリンガー溶液を10分間すすぎます。

ビーズを洗浄してから50分以内に、マイクロビーズ移植のための領域にアクセスできるように、移植トレイのウェル内で一度に1つの胚を配列します。タングステン針を使用して胚に小さな切開を行い、次にマイクロキャピラリートランスファーピペットの球根を押し下げてマイクロビーズをキャピラリーカラムにそっと引き込み、圧力を解放してマイクロビーズを移植トレイに送達すると、マイクロビーズが扱いやすくなります。ビードをそっと押して、金型内のリンガー溶液に沈めます。

次に、マイクロニードルを使用して、マイクロビーズを胚上および切開部に移動します。最後に、ウィスカーツールを使用してマイクロビーズを切開部位から遠ざけ、ビーズが治癒するときに排出されないようにします。マイクロビーズの移植の成功は、ビーズが組織内に安定して配置されたままであるため、実体顕微鏡ですぐに測定できます。

この実験では、リンガー溶液のみですすいだ2つの異なるサイズの1つのマイクロビーズを、尾芽の段階、または筋形成の後の時点でゼブラフィッシュの胚に移植し、内因性組織のために実験期間中にビーズの位置がずれないようにしました。形態形成。胚サンプルは、生涯経過写真で視覚化したり、画像がマイクロビーズの着床を示すときに定期的に確認したりできます。任意の結合がない場合、小分子は、SPR魚が胚を胚する正常な発達中に全体的な形態学的影響なしに達成することができます。

この手順に続いて、Whole Mount Institute hyperなどの他の方法を実行して、Microbeadが遺伝子発現にどのように影響するかを研究することができます。全体として、時間の経過に伴うビーズの位置を理解することは、標的組織や発生プロセスに対する小分子の影響を評価するなど、結果を解釈する上で重要です。