Name: 骨様テンプレートでのマイクロチャネルによって独特の毛細管現象は大骨欠損の回復のために細胞の動員を強化することができます (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: 学ぶ骨様テンプレートの作製法。ポリウレタンスポンジをハイドロキシアパタイトで被覆し、マイクロチャネルを設計して毛細管現象を誘導し、細胞の吸着と保持を強化します。大骨欠損の再生医療に応用可能です。

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1.ポリウレタン（PU）を鋳型としてスポンジの準備<ol><li>相互接続孔を含むハイドロキシアパタイトのテンプレートを生成するためのPUスポンジを使用してください。テンプレートストラットの形成だけでなく、骨梁内のマイクロチャネルを形成するための主要な骨梁を提供するために、それぞれのスポンジを使用してください。 </li><li>切り取り、長さ幅×1.5 cm単位×5 cm高さ3.5cmの寸法で2ブリッジ形状に（1インチ当たりの細孔）スポンジを80 PPIをトリミング。 注：100 PPI、80 PPIおよびPPI 60：寸法及び形状は、所望の一次細孔サイズに応じて選択することができます。 </li><li> 150 mlのビーカーを使用してNaOH溶液（w / v）の4％の100ミリリットル作ります。準備されたスポンジが完全に浸漬するまで、浸すと絞ります。 </li><li>浸漬した後、超音波破砕（42キロヘルツ）でスポンジを入れたビーカーを置きます。 </li><li>超音波表面特性を変更するために熱することなく、15〜20分間のPUスポンジを前処理します。 </li><li>蒸留ですすいでください5〜10分間水。すすぎながら、スポンジを絞るとそれらをスポンジ内部の残留水酸化ナトリウムを除去するために5〜7回を拡大することができます。 </li><li>余分な水分を除去するためにペーパータオルでスポンジを絞ります。その後60〜80℃のオーブンでそれらを乾燥させます。 </li></ol>コー​​ティング2.ヒドロキシアパタイト（HA）スラリー調製<ol><li> HAスラリーを行う前に、磁気撹拌棒をビーカーの重量を測定します。この測定は、粉末/液体比を計算するために使用されます。 </li><li>ナノサイズのHA粉末10gを測定します。 </li><li> 50ミリリットルビーカーに20mlの蒸留水を追加します。 120〜140°Cと攪拌ホットプレートマグネチックスターラーを使用するための熱。 </li><li> 300-400 rpmで撹拌しながら蒸留水に粉末当たりポリビニルアルコール（PVA）（MW 89,000-98,000）を0.3g（w / wの3％）を加えます。 </li><li> PVAが完全に溶解するまで攪拌します。解決策は、PVAが完全に溶解した後に明確にする必要があります。 </li><li> O回し熱FFおよび400-500 rpmで撹拌しながら、粉末、ナトリウムカルボキシメチルセルロース（CMC）（超低粘度）を0.1g（1％重量/重量）を加えます。解決策は、PVAが完全に溶解した後に明確にする必要があります。 </li><li> CMCが完全に溶解するまで撹拌し、室温まで冷却します。 </li><li> 300〜400 rpmで攪拌​​しながら、粉末あたりのポリアクリル酸アンモニウム分散剤0.3グラム（10％w / wの）を追加します。完全に溶解するまで撹拌します。 </li><li> 300〜400 rpmで攪拌​​しながら、粉末あたりグリセリン0.2グラム（2％w / wの）を追加します。完全に溶解するまで撹拌します。 </li><li>ゆっくり600-900 rpmで撹拌しながら、溶液中にHA粉末を分散し、5分間撹拌し続けます。 </li><li> HA粉末のいずれかの凝集の分散を確実にするために超音波処理を用いて5分間超音波処理。 </li><li> 90〜100℃で600〜900回転数と熱で撹拌しながら混合物に蒸留水の余分な5ミリリットルを追加します。 </li><li> ORDで90〜100℃、600〜800 rpmでマグネチックスターラーを用いて混合物を攪拌し続けますERは、水分を蒸発させます。 </li><li> 1.75から1.8の粉末/液体比が得られるまでの時間までの時間からビーカーとの混合物を含む全体の重量を測定します。 </li><li>粉末/液体比をフォーマット、粉末、試薬、水、マイナスビーカーおよび攪拌機（2.1）の重量、およびマイナスHA粉末を含む混合物（2.14）の合計重量の粉末の重量を割ます（2.2）。 注：例：（粉末、試薬、および水を含む混合物全体）は49.05グラムである場合、B（攪拌機付きビーカー）は33.5 gであり、その後、C（HA粉末）は10 gです。 C /（ABC）= 10 /（49.05-33.5-10）= 1.80 </li><li>スラリーは、コーティングのために使用する前に室温まで冷却させます。 </li></ol> 3. HAコーティング、乾燥、及び焼結<ol><li>コー​​トスラリーを均一にガラス板上にPUスポンジ全体に分散されるまで、ステンレス製スパチュラを用いてHAコーティングスラリーを用いて調製PUスポンジ。 注意：過剰スラーを除去した後RY、細孔の一部は依然として高いため、スラリー粘度のスラリーで目詰まりすることができます。 </li><li>少し空気圧縮機を使用して、HAコーティングされたテンプレートを吹く、相互接続性、均一性、および開気孔を確保するために。このプロセスは、テンプレートが均一PUスポンジの内部及び外表面の両方にコーティングされることを保証します。 注：均質な被覆が達成されない場合は、HAコーティングしたテンプレートは、焼結プロセスの間に崩壊し、低い機械的強度のために処理している間にも亀裂もよいです。さらに、均質なコーティングは、骨梁内のマイクロチャネルを作成する上で重要です。 </li><li>穏やかな空気循環と冷却条件の下で5時間（20〜25℃）の最小のHAコーティングされたテンプレートを乾燥させます。しかし、テンプレートの大きさに基づいて、乾燥時間を延長します。 注意：乾燥した後、HAコーティングされたテンプレートは、典型的には、各次元で約8％〜10％縮小します。 </li><li>乾燥工程の後に、HAを配置アルミナ坩堝にコーティングされたテンプレート。そして、高温炉の中に置いて、次の8段階の焼成プロファイルを使用しています。 <ol><li> 230℃までのヒート2℃/分。 </li><li> 280℃までのヒート1℃/分。 </li><li> 400°Cまで0.5℃/分加熱します。 </li><li> 600°Cまでの加熱3℃/分。 1時間600℃で保管してください。 </li><li> 1230゜Cまで熱5℃/分。 3時間1230℃で保管してください。 </li><li> RTに冷却し、5℃/分。 注意：焼結は、さらに約22％のHAコーティングされたスポンジテンプレートを縮小します - 各次元で25％。 </li></ol></li></ol>テンプレートへの細胞の4入力および居住<ol><li> 5％のCO 2を含む加湿雰囲気中、37℃で、10％ウシ胎児血清（FBS）および1％抗生物質（ストレプトマイシン及びペニシリン）を補充したα-MEMからなる非骨形成培地での培養は、プレ骨芽細胞MC3T3細胞。 </li><li> 10ミリリットルを追加します。6ウェルプレート内の単一のウェルに2×10 6細胞密度で細胞懸濁液。 </li><li> 6ウェルプレートに垂直に3センチメートルX 4センチメートル×1センチブリッジ形のテンプレートを置きます。隣接する空のウェルに細胞懸濁液を含むプレートに、テンプレート、および他の脚部の一方の脚部を配置します。 </li><li>テンプレートを10分間、細胞懸濁液を吸収できるようにします。 </li><li>その後、もともと細胞懸濁液を充填したウェルにメディアの5ミリリットルを追加します。 </li><li> 7日が経過するまで2〜3日ごとに両方のウェルに培地を補充します。 </li><li>ヘマトキシリンおよびエオシン染色11によって細胞の移動の有効性を決定します。 <ol><li> 20〜30分間、100％エタノールに浸漬することによって、細胞と足場を固定してください。 </li><li> 1-2分間ヘマトキシリン​​で染色。 </li><li>二回のために1〜2分間蒸留水で洗い流してください。 </li><li> 1~2分毎に、次いで100％エタノール、95％、次いで、70％に浸漬することによって脱水します。 </li><li> 20〜30秒間エオシンで染色。 </li><li>二回、12分間蒸留水で洗い流してください。 </li><li> 1~2分ごとに70％、80％、90％、および100％エタノールに浸漬することによって脱水します。 </li><li>切片およびイメージング用のアクリル樹脂に足場を埋め込みます。 </li></ol></li><li>時点で、3- [4,5-ジメチルチアゾール-2-イル] -2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド（MTT）細胞生存率アッセイおよび生/死アッセイ（生/死細胞染色キットMPTP）での細胞生存率を決定します3日目の7 11。 注意：骨様テンプレート製造プロトコルのスキームは、「代表的な結果」のセッションで表されます。 </li></ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

細胞、成長因子、栄養素などを含む多成分テンプレートが成功した骨再生及び臨界サイズの大きな骨欠損の機能回復のために必要とされます。これらの要因の中で、解剖学的に適合生物学的特性が不可欠です。生物学的機能を達成するために、テンプレートは、生体適合性、骨伝導性、機械的完全性、十分な表面積、十分な表面テクスチャ、および酸素および栄養輸送のための手段を示さなければなりません。容易に浸透テンプレートに（アクティブ募集）、テンプレート（保持）全体に均一に分布し、加速増殖と高い生存性（居住）：細胞レベルでは、次の機能は、大規模な骨欠損の機能回復のために特に重要です。最後に、実質的に細胞外マトリックスの形成およびその後の遺伝子発現の誘発は、迅速な血管新生Aと本質的な生物学的プロセスにおいて重要ですND骨形成。 合成の代替の多くの異なるタイプの自動/同種骨移植片を置換するために提案されています。しかし、現在の足場組織は、マイクロチャネルおよびナノ細孔を含む内部微小環境を示さないので、積極的に深い10ミリメートルよりも大きい合成代替への細胞浸潤、分布、およびinhabitanceを容易にしません。彼らは効率的に、迅速に、かつ均一に骨テンプレートに深く移行する細胞を開拓するための物理的な手がかりを提供していません。代わりに、細胞の限られた受動的な動員は、足場の外側と内側の領域との間に不均等に分布する細胞集団を作成します。これは、テンプレートの内部コアに到達する細胞の最初の挑戦を悪化させるだけでなく、合成の代替の他端に栄養素の流れと、細胞の通信を妨げるだけでなく。セルDにおける不均衡な細胞動員と生息結果このタイプの足場後eathと不完全な骨の成長は、体14,15に移植されました。 そこで、これらの障害に対処するための主要な物理的な合図として、毛管作用の概念を導入しています。私たちは徹底的に積極的に深いBMTに細胞を募集するための責任を主要ドラッグ力を占めるようになる毛管作用を誘導するためにBMTでマイクロチャネルを設計しています。 PUスポンジコーティング技術は、いくつかのユニークな特性を示します。まず、それ自体が事前に定義されたテンプレートの構造（ すなわち、300〜400ミクロンのためのインチテンプレートごとに80の細孔）に依存して十分に制御された多孔質の骨梁構造の容易な調製を可能にします。これは、骨芽細胞の浸潤15孔径を最適化するために非常に重要です。第二に、この技術は、細胞の再配置11を初期化する重要な役割を占めて相互接続されたマイクロチャネルの構築を可能に。カスタムシェイプとテンプレートのサイズを作成するという点で、PUスポンジを使用した場合第三に、ほとんど制限があります。メーカーは、単純な形状または複雑な形状のためであっても計算されたレーザー切断用ハサミを使用することができます。これらの精密に制御技術を使用して、我々はBMTを作成しました。 HAは、その生体適合性および骨伝導容量17の出発材料として選ば ​​れました。 本研究では、強調表示される必要があるいくつかの重要なステップがあります。温度が高すぎると、攪拌速度が低すぎるHAスラリーの調製時に、HAスラリーをビーカーの底端部でスタックになり、アップ乾燥します。過剰HAスラリーを吹き付けコーティング処理の後、空気の圧力が高すぎるBMTの表面にクラックを誘導することができます。これは、適切にのみ過剰のHAスラリーを空気に比較的低い空気圧を保つことが重要です。焼結工程の最後に、第二および第三段階（400°Cまで280℃と熱0.5℃/分までヒート1℃/分）は最も重要です。 HAが密になりながら、この温度範囲では、PUスポンジが完全に燃焼します。このプロトコルは密接に従わない場合は、BMTは、焼結後に崩壊または崩れされます。 本研究で説明BMTはいくつかの利点を提供しています。まず、相互接続されたマクロ細孔（300〜400ミクロン）は、ヒト骨梁のものを模倣し、円滑な骨髄の流れを可能にします。次に、テンプレートは、毛管作用を介して、骨細胞の最初の進入を促進するために、各小柱隔膜内のマイクロチャネル（25-50ミクロン）で構成されています。テンプレートはわずか300ミクロンの孔（プライマリ毛穴）なしマイクロチャネルを持っていた場合、計算機シミュレーション13を用いて実証されているように、毛管作用は、骨髄とテンプレートが完全に飽和するのには不十分であろう。これは、特にリットルを必要とする大型の欠陥についても当てはまるだろうARGEサイズのテンプレート。マイクロメートルサイズのチャンネルを呈する非常に効果的な水分の吸収、とはこのように私たちは、マイクロチャネルは、私たちの研究では、毛管作用の主な原因であることが期待します。第三に、私たちのBMTsは戦略的にナノ空孔を配置しています。文献からのデータは、細胞は、ナノパターン18,19に特に敏感であることを示しています。従って、我々は、細胞付着を増加させる役割を果たして、マイクロチャネルの壁上のナノ細孔を期待しました。固定化された細胞は、固定することができ小柱隔膜の表面にナノサイズの細孔（100〜400ナノメートル）。全体として、これらの3つの内部構造の複合効果は、テンプレート全体で強化された細胞の動員および付着をもたらしました。しかし、プロトコルのいくつかの制限と完璧なBMTを製造する重要なステップがあります。例えば、コーティングしながら均質な粘度を維持する難しさのために調製したHAスラリーの多量がしばしば存在します。また、製造するのには限界がありますコーティングしながら、作業時間にボリュームが5cm 3より大きいテンプレート。コー​​ティング厚さは、メーカーの技術に依存して変化する重要です。 私たちの研究の結果は、足場の細胞を吸収し、保持することができるBMTは、従来のアロプラスト（または合成）上での潜在的な利点を提供することを示唆しています。前向き研究は、骨に関連する成長因子とともに骨形成および/または血管新生にBMTのメリットを検証するために検討されています。そのため、私たちは私たちのユニークな機能を備えたBMTの足場は大きな欠陥で合成構築物及び不完全骨再生に不十分な骨髄浸潤の主要な障壁に対処することができると主張しています。 本研究の究極の目標は、時間/労働集約型の骨髄間質の必要性を排除することによって、重要なサイズの骨欠損に骨再建と機能回復に生体工学の現在のパラダイムを簡素化することですL細胞の単離および拡張プロセス。最後に、我々は、骨の再構築のために迅速な細胞吸収、均質な分布、およびinhabitanceを誘発するマイクロチャネル及びナノ孔を有する3D構築物を準拠解剖学的に活用することを目指しています。

合成コンストラクトを用いた骨組織工学の最終的な目標は、コンストラクトを宿主骨に組み込み、コンストラクトを宿主細胞に再集合させ、正常な骨機能を回復するためのガスと体液交換の再構成です。過去10年間で、足場1,2を製造するための高分子およびセラミック生体材料の使用について、かなりの研究が報告されています。しかし、最適な骨組織再生のための理想的な材料と作製技術はまだ特定されていません。さらに、これらの技術を臨床に導入すること、特に大きな骨欠損の再建と修復には、全体的に成功していません。したがって、重要なサイズの骨欠損を修復することは、依然として臨床上の課題です1-5。
理想的には、骨組織再生のための足場は、炎症反応や異物/毒性反応を引き起こすことなく生体適合性を示し、天然の骨のそれらと比較すると密接に機械的特性を持ち、イオンと栄養素の拡散および/または輸送を可能にするメカニズムを持つべきです。宿主骨との強い結合、動的な骨の成長、血管の内部成長、および足場の生分解も同様に望ましいです。生分解性ポリマー足場の使用は、組織の内部成長の点で進歩を示していますが、骨再生への使用については論争があります。
これらの広範な努力にもかかわらず、高度に組織化された構造合成構築物は、受動的な細胞浸透の障害を克服する可能性がまだ限られています。これらのアプローチのほとんどは、外面から数μmから数mm未満の断面積を持つin vitro組織の内部成長、宿主骨との不完全な統合、およびin vivoでの部分的な骨再生のみをもたらしました6,7。先駆的な細胞は、細胞のコロニー形成が始まる前に内部に引き込む最初の力がないため、構築物に深く移動しません。その結果、細胞のコロニー形成は厳密に足場の周辺で起こり、足場の周辺から中心への障害物になります。したがって、テンプレートの内部への酸素と栄養素の拡散は制限される8。したがって、足場全体の物質の輸送と拡散に影響を与える足場の構造(細孔サイズ、多孔性、相互接続性、および透過性)が、適切に分布した細胞増殖と分化を達成するために重要であることは明らかです9,10。リン酸カルシウムは過去に足場の製造に使用されてきましたが、さまざまなプロセスや手順により、さまざまな構造のリン酸カルシウム足場が作られることがよくありました。したがって、製造プロセスの選択は、骨組織の再生を成功させるために必要な足場の構造を決定する上で重要になります。
結論として、骨組織工学にはまだ対処すべき2つの大きな欠点があります:細胞の接着とコロニー形成に先立つテンプレートへの最初の細胞動員と、テンプレートに出入りする物質の流れの質です。

<table><tbody><tr><td>ポリウレタンスポンジ</td><td>プラスチフォーム</td><td>PU-3215</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>167176</td><td></td></tr><tr><td>ハイドロキシアパタイト粉末</td><td>Ossgen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ポリビニルアルコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td></td></tr><tr><td>カルボキシメチルセルロースナトリウム塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>360384</td><td></td></tr><tr><td>ポリアクリル酸アンモニウム</td><td>ヴァンダービルト</td><td>DARVAN 821A</td><td></td></tr><tr><td>グリセリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2289</td><td></td></tr></tbody></table>

骨様テンプレートでのマイクロチャネルによって独特の毛細管現象は大骨欠損の回復のために細胞の動員を強化することができます

Distinctive Capillary Action by Micro-channels in Bone-like Templates can Enhance Recruitment of Cells for Restoration of Large Bony Defect

よく分散され、安定的に挿入されたテンプレートに固定されているアクティブな、繁栄細胞集団がなければ、例外的な骨再生は発生しません。従来のテンプレートでは、深いテンプレート内部の細胞浸潤、分布、およびinhabitanceの欠如で内部マイクロチャネル結果の欠如。したがって、マイクロチャネル（生体微小環境テンプレート; BMT）を有する高度に多孔質で均一に相互接続された小柱骨のようなテンプレートは、これらの障害に対処するために開発されました。新規BMTは、革新的なコンセプト（毛管作用）によって作成され、スポンジテンプレートコーティング技術を用いて作製しました。相互接続された一次細孔（300〜400ミクロン）に骨梁の細孔、各骨梁内のマイクロチャネル（25-70ミクロン）、およびナノ細孔（100〜400 nm）を模倣する：BMTは、いくつかの構造のコンポーネントで構成され細胞が固定できるように表面。また、BMTは、SIMを持っているために機械的試験研究によって立証されています人間の骨梁（〜3.8 MPa）と12のものとILAR機械的強度特性。 BMTは、ブリッジ状の（Π）テンプレート（3センチ、高さ4センチ長）を通じて、高吸収、保持、および細胞の居住を示しました。最初にあった細胞はすぐに細胞培地にBMTの毛管作用によってもう一方の端（10cmの距離）に動員テンプレートの一端に播種。 4時間後、細胞が均一に全体BMTを占領し、正常な細胞挙動を示しました。毛細管現象は、メディアとBMTを通じて配布（アクティブ移行）中に懸濁させた細胞の浸潤を占めました。 BMTのこれらの機能を観察したが、我々はBMTsは、生理学的条件下で周囲から骨髄細胞、成長因子、及び栄養素を吸収することが突出しています。 BMTは急速な浸透、均一な分布とinhabitaを介して電流制限を解決することがあります巨大な骨格欠損を修復するための大規模な、体積テンプレート内のセルのNCE。

BMTの全体的な構造は、海綿骨のような内部構造を持つユニークな3次元テンプレートを示します。 BMTは、マクロ細孔、マイクロチャネル、およびナノ細孔を含有。完全に相互接続されたマクロ孔の明確な構成（320ミクロンの平均サイズ）、マイクロチャネル（50ミクロンの平均直径）、及びナノ気孔（100nmの平均サイズ）EVO-40（走査型電子顕微鏡で確認しました。 ZEISS）ならびにマイクロトモグラフィーを通じ。 図1は 、BMTの作成 ​​に段階的に詳細なプロトコルを示しています。焼結工程へのPUスポンジ（P1 - P7;図1）の製造からプロトコルの正確な制御により、以下の機能を実現することができます：非常に緻密で滑らかな表面のHAコーティング、乾燥後、精密な形状の3次元テンプレートの大きさ。海綿骨と同様の完全に相互接続多孔質小柱網;そして、マイクロチャネルのウィットヒンなどハバース運河やフォルクマンの運河（ 図2＆3）などの骨内のチャンネルを模倣する各梁。さらに、ヒト海綿骨と同様の比較的高い機械的強度（〜3.8 MPa）を圧縮強度試験により測定しました。骨梁椎骨ヒト腰椎のものと非常に類似した組織形態計測パラメータは、マイクロCT分析12により確認されました。毛管作用の異なる大きさは、計算機シミュレーションを用いて、 図4で別の毛細管径を通じて実証されました。これらのシミュレーションを通じ、BMTは、一次細孔（300〜400ミクロン）と直径に基づいて、マイクロチャネル（25〜70ミクロン）内で変化の吸収率を示すであろうと予測。より小さな毛細血管が強い吸収能力を示しました。 図5に示すように、この仮定は、この実験で検証しました。 BMTは非常に効果的に発揮しましたマイクロチャネル構造の毛細管作用を通じた流体の吸収及び保持。 stevenelの青い汚れが簡単に流れます （図5）を追跡するために、流体媒体として使用しました。計算機シミュレーションに基づいて、これらの構成を持つBMTは吸収し、10秒以内に総距離8.5 cmの細胞懸濁液を保持するために見られました。原因内部構造により誘導される強い毛細管現象に、染色された媒体は、3センチメートル（高さ）の反対側の端に到達した4センチメートル（長さ）が1分40秒以内に1センチメートル（幅）ブリッジ形のテンプレートをX X。また、BMTへの活性細胞の動員および取り込みは（ 図6）が観察されました。その後、均質な細胞動員及びアタッチメントは、均一に分布形成の増強増殖及びマトリックス形成をもたらしました。また、BMTを通じて細胞の長距離（約10 cm）の移行は、BMTを細胞懸濁液で飽和させた直後に検証しました。セ<html> eded細胞は空気に曝露し、培養液中に浸漬されていなかったテンプレートセグメントに生存しました。この実験では、培地は、排他的にウェル中の足場の脚だけをタッチすることにより細胞に提供されました。マイクロチャネルによって示される毛管作用は、その後、足場の上、ブリッジ部に到達するために新鮮な培地を可能にしました。培養の3日後、テンプレートは急速に増殖する細胞で占められなりました。培養7日後に、各梁は、細胞外マトリックスによって包まれ、細胞13が埋め込 ​​まれました。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig1.jpg" /> 最終熱処理（P7）にPUスポンジ（P1）の前処理の全体の骨のようなテンプレートの製造プロトコル1.図。P7は、良好な機械的強度を達成する上で重要である焼結した後、正確なプロファイルを維持します。F =「https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig1large.jpg &quot;ターゲット=&quot; _空白 &quot;&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig2.jpg" /> 。 図2代表的実体顕微鏡、80 PPIの（AmScope SM-2TZ-M）の画像（×4）は、PUスポンジが（左）、HAコーティングし、BMT（中央）、焼結BMT（右）乾燥なサイズ （寸法：3。幅×1 cmの長さ×4センチ、高さセンチ）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig3.jpg" /> 生体テンプレートの図3 SEMマイクロCT画像（A）生体テンプレートの全体像、 <st<html>栄&gt;マイクロチャネルのために（B、C、D）の画像。小柱の明確なマイクロチャネルを強調するために、テンプレートを造粒した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig4.jpg" /> 図4.異なるチャネル径の毛細管現象の計算計算同じ期間（0.4秒）以内に、最大のキャピラリー（D = 300ミクロン：一次細孔を指す） している。中に0.16ミリメートルまでの培地（青）を吸収高さは、最小の毛細血管：高さ0.415ミリメートルまでのメディアを吸収（D =30μmのマイクロチャネルを指します）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> NT「FO：キープtogether.withinページ= &quot;常に&quot;&gt; <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig5.jpg" /> 470ミクロン、80 PPI≈320ミクロン、100のPPI≈≈60 PPI：図5.画像は、一次細孔及びマイクロチャネル（一次細孔径が平均直径を意味の異なるサイズに基づいて、毛管作用の吸収能力の差を示しました200ミクロン）。黄色の線は、一次細孔及びマイクロチャネルの組み合わせによって誘導される毛管作用を表します。赤い線は、各梁に展示主にマイクロチャネルによって誘発される毛管作用を表します。 （F）に示すように、100 PPIテンプレートは39秒以内に、テンプレートの完全な飽和を生じる、最も強い毛管作用を誘導しました。 80 PPIと60 PPIテンプレートは、その後試験しました。 （B）0秒、（C）0.5秒、（D）1.5秒、（E）17.0秒、（F）39.0秒、（G）50.0秒、及び（H）の浸漬後の1分18秒。 （テンプレートの寸法：1高さ立方cmで×1センチ×4センチ）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/52947/52947fig6.jpg" /> 毛管作用によって誘発される生体テンプレートを通じて播種していないウェル（パートV）に播種したウェル（パートI）からの細胞の侵入や移民6.図。最初に播種した細胞は、直後に播種していない足（パートV）の最後に到達完全な飽和。 3日後、細胞の合流はテンプレート全体を通して明らかになりました。 7日後、時空間コラーゲンマトリックスの形成は、細胞集団（H＆E染色）内で発生しました。 （テンプレートの寸法：幅X 1センチメートル長さは高さ×4 CMで3センチメートル<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52947/52947fig6large.jpg" target="_blank">）。CLください</a>この図の拡大版を表示するには、こちらICK。

設計されたマイクロチャネルを持つ骨のようなテンプレートを作成するための段階的な一般的なプロセスが提示されます。テンプレートの高い吸収能力と保持能力は、マイクロチャネルを介した毛細管現象によって実証されます。

Without an active, thriving cell population that is well-distributed and stably anchored to the inserted template, exceptional bone regeneration does not ...

この手順の全体的な目的は、欠損または損傷した骨を修復できる能力を持つ骨テンプレート微小環境を作製することです。まず、欠損領域に適合するようにポリウレタンスポンジを成形および加工します。次に、ポリウレタンスポンジに粘性のあるヒドロキシアパタイトスラリーを均一にコーティングし、乾燥させます。最終ステップは、ヒドロキシアパタイトコーティングを高温筋炉の中央に配置することです。最終的に、高い細胞吸収能と保持能を備え、設計されたマイクロチャネルを持つ骨様テンプレートが作製されます。ソルトリーチングや3Dプリンティングなどの既存の手法に対する本技術の主な利点は、毛細管現象を誘発するようにマイクロチャネルが設計されていることです。この手法は、頭蓋顎顔面および分節状骨欠損の再建など、再生医療分野における主要な課題の解決に寄与します。本技術の意義は、先天性奇形の治療にまで及びます。テンプレートの形状とサイズは完全にカスタマイズ可能であり、毛細管現象によって長距離の細胞遊走が促進されます。この手法は骨の再生に関する知見を提供しますが、3Dがん培養プラットフォームなどの他の培養システムにも適用可能です。まず、1インチあたり80孔のポリウレタンスポンジを、高さ3.5 cm、幅5 cm、奥行き1.5 cmのブリッジ形状に切り出します。次に、4%水酸化ナトリウム溶液を100 mL調製します。150 milliliterのビーカーを使用します。スポンジを水酸化ナトリウム溶液に浸し、空気が完全に抜けてスポンジが十分に浸されるまで絞ります。飽和させた後、スポンジを入れたビーカーを超音波洗浄機に入れ、加熱せずに42 kilohertzで15〜20分間処理します。完了後、蒸留水で5～10分間すすぎます。すすぎながらスポンジを絞り、内部の水酸化ナトリウム残渣を取り除くため、この動作を5～7回繰り返してスポンジを膨張させます。ペーパータオルでスポンジの余分な水分を取り除き、60～80 °Cのオーブンに入れて完全に乾燥させます。ヒドロキシアパタイトスラリーの作製を開始するために、まずマグネチックスターラーバーを入れた50 mLビーカーの重量を量ります。次に、ビーカーに蒸留水を20 milliliters加えます。ホットプレートを120から140 degrees Celsiusに設定して水を加熱し、マグネチックスターラーで撹拌します。水が沸騰し始めたら、300から400 RPMsで撹拌しながら、ポリビニルアルコール粉末を0.3 grams蒸留水に加えます。粉末が完全に溶解し、溶液が透明になるまで攪拌します。次に、加熱を停止し、400〜500 RPMで攪拌を継続しながら、超低粘度カルボキシメチルセルロースナトリウム粉末0.1 gを加え、溶液が透明になるまで待ちます。溶解後、再び混合物を室温まで冷却します。次に、300～400 RPMで攪拌しながら、ポリアクリル酸アンモニウム分散剤を0.3 grams加えます。完全に溶解するまで攪拌し、その後、再び300～400 RPMで攪拌しながらグリセリンを0.2 grams加えます。混合物が完全に溶解するまで攪拌してください。次に、ナノサイズのヒドロキシアパタイト粉末を10 grams量り取り、600から900 RPMsで撹拌しながらビーカーにゆっくりと加えます。そのまま5分間撹拌を続けます。次に、混合物を超音波洗浄機に入れ、ヒドロキシアパタイト粉末の凝集を分散させるため、5分間超音波処理を行います。その後、600から900 RPMsで撹拌しながら蒸留水をさらに5 milliliters加え、90から100 °Cで加熱します。マグネチックスターラーを用いて、90から100 °C、600から800 RPMsで混合物を撹拌し続けます。水分を蒸発させるため、粉末対液体の比率が1.75から1.80になるまで、ビーカーと混合物を含む全重量を随時測定します。付随するテキストプロトコルに記載されている通り、コーティングに使用する前にスラリーを室温まで冷却させます。ガラスプレート上で、ステンレス製スパチュラを用いて、準備したポリウレタンスポンジにヒドロキシアパタイトスラリーを、スポンジ全体に均一に分布するまで塗布します。その後、エアコンプレッサーを使用してスポンジに軽く吹き付け、相互接続性、均一性、およびオープンポアを確保します。均一なコーティングが得られない場合、INVプロセス中にハイドロゲルでコーティングされたテンプレートが崩壊し、また、拘束力が弱いため、取り扱い中にひび割れが生じる可能性があります。さらに、均一なコーティングは、マイクロチャネルを正確に形成するために不可欠です。HAでコーティングしたテンプレートを、緩やかな空気循環がある状態で、20から25 degrees Celsiusで最低5時間乾燥させます。テンプレートが大きい場合は、この時間を延長してください。乾燥後、HAコーティングしたテンプレートをIlluminaクルーシブルに配置します。次に、それらを高温炉に入れ、付属のテキストプロトコルに記載されている8段階の中心合わせプロファイルに従ってください。100万個の前骨芽細胞系MC3T3-E1細胞を含む10 mLの細胞懸濁液を、6ウェルプレートの1つのウェルに加えます。次に、3 cm × 4 cm × 1 cmのブリッジ型テンプレートを、6ウェルプレートに垂直に配置します。テンプレートの一方の脚を細胞懸濁液の入ったウェルに、もう一方の脚を隣接する空のウェルに配置します。バイオセーフティーキャビネット内で、テンプレートに細胞懸濁液を10分間吸収させます。次に、もともと細胞懸濁液を満たしていたウェルに、培地をさらに5 mL加えます。さらに5分後、もともと細胞懸濁液を満たしていなかったもう一方のウェルに、培地を5 mL加えます。その後、装置をインキュベーターに入れます。7日間にわたり、1日おきに培地を交換してください。実験終了後、100%エタノールを満たしたビーカーに浸し、細胞とスキャフォールドを20〜30分間固定します。洗浄したスキャフォールドをヘマトキシリン染色液で1〜2分間染色します。その後、蒸留水の入ったビーカーにスキャフォールドを2回浸して1〜2分間すすぎ、70% ethanolに1〜2分間浸してスキャフォールドを脱水します。次に、スキャフォールドを95% ethanolに移し、さらに1〜2分間保持します。最後に、スキャフォールドを100% ethanolに2分間浸します。次に、構築物をe、s、およびYで1〜2分間対比染色します。その後、スキャフォールドを蒸留水の入ったビーカーに再度2回浸し、1〜2分間すすぎます。洗浄後、樹脂埋包を行う前に、段階的な濃度のエタノール溶液に浸漬させてスキャフォールドを脱水します。最後に、切片作成およびイメージングのため、スキャフォールドをアクリル樹脂に埋包します。ここで作製プロセスの各段階で示されているバイオジェニック・マイクロエンバイロメント・テンプレートは、海綿骨に類似した、完全に相互連結した多孔性の骨格ネットワークで構成されています。このテンプレートは、直径 300 to 400 µm の相互接続された一次孔、直径 25 to 70 µm のマイクロチャネル、および細胞の定着を可能にする表面上の直径 100 to 400 nm のナノ孔を含む、いくつかの構造的コンポーネントで構成されています。このバイオジェニック・マイクロエンバイロメント・テンプレートは、毛細管現象により、スキャフォールドの全領域への細胞播種をサポートします。完全に飽和させた直後、スキャフォールドをヘマトキシリン・エオジン染色し切片を作成することで、細胞分布を明確に観察できます。テンプレートの各領域における細胞数を定量化し、培養3日後に追跡した。培養7日後には、テンプレートは急速に増殖する細胞で満たされ、各骨梁は細胞外マトリックスに包まれ、細胞が埋め込まれた状態となった。適切に実施されれば、この手法は時間を最適化することで3日間で完了させることが可能である。本手順を実施する際は、粉末と水の比率を適切に維持し、均一なコーティングを確保することが重要です。細胞応答に関するさらなる疑問を解消するためには、ダイナミックロッキングシステムや回転培養システムなどの他の手法を用いることも可能です。

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