Name: 3Dコラーゲンマトリックス中の走化性を調査するために、平面グラデーション拡散システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学ぶ 3Dコラーゲンマトリックス中の細胞走化性を調査する平面グラデーション拡散システムの構築法。シリコーンモールド製作と共焦点顕微鏡を用いた細胞動態追跡技術を解説し、3D環境における細胞移動メカニズムの理解に貢献します。

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著者は、細胞実験の洞察について、ジョナサン・ライヒナー博士とアングル・バード博士に感謝したいと思います。全米科学財団大学院研究フェローシッププログラム(GRFP)は、この研究を支援しました。

1. 3次元金型設計と部品<ol><li>モールド<ol><li>作業を始める前に、シリコーンエラストマーキット、ライブセルイメージング室、22ミリメートルのガラスカバースリップ、および寸法10.07ミリメートルX 3.95ミリメートルX 5.99ミリメートルで加工アルミニウム金属キューブを得ます。下のホルダーにカバースリップを配置し、ベンダーの指示どおりに、チャンバの残りの部分を組み立てることにより成形用ライブセルイメージング室を準備します。 </li><li>次に、ピンセットを用いて、生細胞イメージング室ハウジングの中央にし、カバースリップの上に機械加工されたアルミニウム金属キューブを配置し、その後、脇に置きます。 </li><li>エラストマーを5mlにする製造業者のプロトコルに従ってシリコーンエラストマー溶液を混合します。 </li><li>使い捨ての実験用へらを使用して、生細胞イメージング室セットアップにシリコーンエラストマー溶液を注ぎ、置か機械加工アルミニウム金属キューブを移動しないよう保証します。硬化させるための安全な場所のO / Nで、実験台の上にシステムを配置します。 </li><li>翌朝、解体ライブセルイメージング室、メーカーが推奨する鉗子を使用して金型を引き出しています。鉗子を使用して、慎重に金型から機械加工されたアルミニウム金属キューブを抽出します。シンクに移動し、脱イオン水で金型をすすぎます。乾燥するためにペーパータオルの上に金型を配置します。 </li><li>乾燥したら、金型を介してスリットをカットし、趣味のカッターナイフを使用して、シリコーン型の内側に、それぞれの長手方向の端部から離れて2.34ミリメートルの間隔を置いて配置。あなたは、実験のためのシステムを構築する準備が整うまで、安全で乾燥した場所で、金型の滞在を確認してください。 </li></ol></li><li>親水性および疎水性ガラスカバースリップの準備<ol><li>コラーゲンマトリックスは、表面に付着できるようにするには、親水性のカバーガラスを作成します。 <ol><li>使い捨てピペットを用いて、3-アミノプロピル - トリメトキシシラン150μlのを測定し、50mlチューブ内の溶液を注ぎます。第二の使い捨てピペットを用いて50 mlチューブに100％エタノール30mlを加え、蓋を閉じます。完全な混合を確実にする、2分間溶液をボルテックス。 Pガラスシャーレ内の当社のソリューション、脇に置きます。 </li><li>第シャーレに100％のエチルアルコール15mlのを注ぎ、脇に置きます（料理を標識することを確認してください）​​。 </li><li>新しい使い捨てピペットを用いて、脱イオン水30mlを測定し、50mlチューブに溶液を注ぎます。次に、グルタルアルデヒドの1,875μLを新しい使い捨てピペットの尺度を使用して、同じ50ミリリットルチューブに溶液を注ぎ、ふたを閉じます。完全な混合を確実にする、2分間溶液をボルテックス。第三のペトリ皿に混合物を注ぎ、脇に置き。 </li><li>鉗子を使用して、1 22ミリメートルラウンドカバーガラスを取り出し、使い捨てピペットを用いて100％エタノール混合物で両面をすすぎます。 </li><li> 100％エタノール溶液皿30mlで3-アミノプロピルトリメトキシシランにリンスガラスカバースリップを置き、5分間、溶液中に座ってすることができます。 </li><li>ピンセットで、カバーガラスを取り出し、使い捨てピペットと100％のエタノール溶液で再度洗い流します。 </li><li> 1,875にすすぎ、カバーガラスをドロップグルタルアルデヒドのμlの脱イオン水の混合物の30ミリリットルと30分のために確保さ。 </li><li> 30分後、ピンセットでカバーガラスを除去し、脱イオン水ですすぎ、室温で乾燥させるために、乾燥組織O / Nの上に置きます。 </li><li>カバーガラスの浸漬を繰り返し、同じ生成ソリューションを必要な数のカバースリップのために移動します。 </li></ol></li><li>指定されたプロトコルによって、疎水性カバースリップを行います。 <ol><li>トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル500μlの酢酸100μlの2分間、50mlのチューブ、ボルテックスでヘキサン19.4ミリリットルを追加します。ガラスシャーレ内の溶液を注ぎ、脇に置きます。 </li><li>きれいな鉗子を使用して、一方のガラスカバースリップを取り出し、2分間調製した混合溶液中にドロップします。 2分が経過した後、ピンセットでカバーガラスを取り出し、室温で乾燥させるために、乾燥組織O / N上に使い捨てピペットと場所カバースリップを使用して、脱イオン水ですすいでください。使用するまでプラスチックペトリ皿に保管してカバースリップ。 </li><li>繰り返しカバースリップDIPPると同じ生成ソリューションを必要な数のカバースリップのために移動します。 </li></ol></li></ol></li></ol> 2.金型アセンブリ<ol><li>金型を使用する前に、使い捨てピペットを用いて、化学廃棄物容器の上に90％のエチルアルコールで金型をすすぎます。次に、脱イオン水で満たされたペトリ皿に金型を配置し、O / Nに座ることを可能にします。 </li><li>ピンセットを用いて溶液から金型を取り、型アセンブリを開始する前に、空気乾燥したタオルの上に置きます。 </li><li>金型は、空気乾燥であるが、高精度ダイヤモンドスクライブツールを使用して3.95ミリメートルX 5.99ミリメートルよりも若干大きく2つの長方形の中に正方形の親水性のカバーガラスをカット。シリコーン型にカットスロットにそれぞれカット矩形カバースリップをスライドさせます。 </li><li>逆さまに金型を反転し、使い捨てピペットを用いて、シリコーン型の底部に沿って真空グリースを塗布してください。次に、バック右サイドアップ型を反転し、円形の親水性のガラスカバーの上に型の底を押してくださいシールを作成するために、リップ。 </li><li>使い捨て手袋を使用すると、組み立てられた金型をピックアップし、使い捨てペトリ皿にした後、バイオフード内に配置します。実験が発生する前に金型を滅菌するために1時間UVバイオフードランプをオンにします。 </li></ol> 3.コラーゲン混合物と3Dマトリックス<ol><li>コラーゲン混合物、汚れを調製し、標準的なプロトコル28による撮像のための細胞を調製する前に。 </li><li>バイオフード内で、標準的な実験技術およびプロトコル29,30を使用して、所望の化学誘引物質濃度の15mlチューブに細胞培地および化学誘引物質を混ぜます。ピペット5〜15 mlのチューブに特異的な細胞メディア化学誘引物質濃度の溶液のmlおよび加熱された水浴中にソリューションを移動します。 </li><li>ピペットを使用して、顕微鏡実験のために溶液を加熱するために加熱された水浴中に第15mlチューブと場所にだけ細胞培地を5mlを抽出します。 </li><li>バイオフードでは、ピペット10×リン酸緩衝液30μlマイクロ遠心チューブにED溶液（PBS）。 15秒間同じマイクロ遠心管と渦の中に1 N水酸化ナトリウム（NaOH）の6μlを添加します。 </li><li>冷蔵庫からコラーゲンIラット尾液を取得し、標準的な実験技術およびプロトコル29を使用して、バイオフードに移動します。コラーゲンはまだ寒いであることを確認してください。同じマイクロ遠心分離管にコラーゲンの168.3μLをピペット。 </li><li>次に、同じマイクロ遠心チューブにピペットを用いて、黄緑色の蛍光カルボン酸で修飾された微小球の18μlを添加します。ボルテックスで30秒間、すべてのソリューションをマイクロ遠心管。 </li><li>マイクロ遠心管に所望の細胞培地-細胞混合物（約2×10 6細胞/ mlの濃度）の77.7μlを添加して、20秒間ピペットチップを使用して混合します。必要に応じて、蛍光ビーズと細胞生存率の表 （ 表1）の添加のために適合カスタムコラーゲンの混合物を、以下によりマトリックス密度を変化させます。 </li><li>ピペット300＆＃181;準備金型組立体の中央ウェルにコラーゲン - 細胞混合物のL（ウェル＃2）。使い捨てペトリ皿の上に金型を置き、5％CO 2で37℃で20分間の標準的なインキュベーターに移動します。 </li><li>インキュベーターからシステムを削除し、バイオフード内に戻し入れます。鉗子を使用して、各カバースリップの上部にクランプして離れて型から引き上げるとの両方によって疎水性のカバーガラスを取り外します。 </li><li>コラーゲンモールド側が平面状の拡散勾配を可能にするためにまっすぐにまだあることを確認することが望ましい顕微鏡および画像に、システム全体を移動します。 </li><li>まだ顕微鏡システム、100μlのシングルチャンネルピペットを用いて、ウェル＃1に細胞培地の100μlを添加します。次に、100μlのシングルチャンネルピペットを使用することはよく＃3に所望の化学誘引物質濃度の細胞培地の100μlを添加します。 </li><li>すぐに両方のウェルにソリューションを追加した後、撮影を開始。 </li></ol> 4.イメージングと拡散モデリング<ol><li>一つは、特定の濃度を算出するための特定のコラーゲン密度のための拡散係数を検索したい場合は、以下の手順に従ってください。 <ol><li>代わりに、所望の化学誘引物質濃度で細胞培地を生成する、標準的な計算およびプロトコル30を使用して、15mlチューブに5μMローダミンを作る」、コラーゲン混合物と3Dマトリックス」というタイトルの上に特定のプロトコルに従ってください。 </li><li>共焦点画像システムを用いた3次元コラーゲンマトリックスは、蛍光を捕捉するために、アルゴンレーザー（488 nm）を用いて、倒立顕微鏡に取り付けられました。画像を最大7時間毎に2または3秒。 </li></ol></li><li>拡散モデルの場合：以下に示す数学的モデルを使用して、これらの一般的な手順で処理及び分析のための計算ソフトウェアのコードを記述します。 <img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq1.jpg" /><ol><li>最大INTENによる再スケーリングおよび正規化のための計算ソフトウェアにインポートするイメージsity。エッジを選択するには、画像のグレーカラーマップに画像を変換します。中央の右、中央の左側に、画像の中心に沿って軸をピックします。 </li><li>計算ソフトウェアコードを使用して、真の強さと両者の差とともに、規格化強度をプロットします。 </li><li>フィッティング（濃度、時間、及び長さ）のために必要な次に、入力パラメータ。 </li><li>時間に対する正規化濃度とデータへの多項式フィットを使用して、x軸の両端の濃度プロファイルをプロットします。 </li><li>計算ソフトウェアコードを使用して拡散係数を計算します。 </li></ol></li></ol> 5.実験測定<ol><li>拡散方程式に戻って、以下に示すように、システム内の任意の位置での特定の濃度を見つけるために方程式を書き換えます。 <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/52948/52948eq2.jpg" /> ここで、 目のL =長さEコラーゲンマトリックス 調査中のx =場所 拡散のD =係数 T =経過時間</li><li>走化性実験の間、瞬間ケモカインがシステムに追加された特定の時刻を記録するために確保します。細胞移動の動きが検出されると、共焦点タイムラプス撮影を記録し、撮影が発生したエッジから特定の時間と場所をメモすることを確認します。 </li><li>データ分析の間に、拡散や細胞実験の両方のためのコラーゲン内の任意の点での正規化された特定の濃度を見つけるために、式に特定のセルのために注目の経過時間、場所及び拡散係数を差し込みます。 </li></ol> TFMを利用6.追跡細胞の遊走<ol><li> TFM / DVC法は、以下のプロトコルに従う使用して細胞の移動を追跡します。 <ol><li>よく＃3への所望の化学誘引物質の濃度を添加した後、反転MICRに搭載された共焦点システムと3Dコラーゲンマトリックスを画像化開始調査するセルを見つけるoscope。 </li><li>移動する細胞が検出されると、視野の中央にセルを配置し、（z軸における画像）が、圧電モーターを利用し、画像毎に1または2分。 </li><li>細胞力発生と変形を計算するために、TFM / DVCプロトコル31次蛍光ビーズの変位を見つけるために、計算コードを生成します。 </li></ol></li></ol>

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</ol>

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

細胞の有無にかかわらず成功した拡散実験のための最も重要な手順は次のとおりです。正しくモールドアセンブリを設定します。疎水性のカバーガラスの抽出時の損傷を防止するために必要な手先の器用さを開発します。正しく拡散係数を算出するための非常に良好な直線スタートラインを見つけることを保証します。コラーゲンと化学誘引物質の両方の実験的な計算を修正。正しく乾燥しない行列を確保するために、ライブセルイメージングシステムの使用;と滅菌、健全な文化を維持します。 拡散実験を行う場合には、拡散プロットは線形拡散モデル（ 図4）の伝統的な形状と一致していることを確認することが不可欠です。 Taの中に報告されているように、各サンプルについて、いくつかの異なるX位置での解析を実行し、それは、コラーゲンの様々な濃度のローダミンための拡散係数の平均値を計算することが可能です<html> BLE 2。コラーゲンの濃度は、マトリックス中の気孔率の増加による減少としてこれらの結果は、コラーゲンゲ...

走化性として知られている濃度勾配に向かう細胞の好ましい運動は、体内の病理学的および生理学的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。このような例は、皮膚および粘膜創傷治癒1、形態形成2、3、炎症、および腫瘍増殖4,5です。また、癌細胞の両方の個々と集合細胞遊走戦略6を通って移動することができることが示されています。また、拡散不安定機構は腫瘍体/オブジェクトから単一またはクラスタ化された細胞の分離を誘導することができ、その後、栄養源に向かって移住し、したがって、より広い領域や組織7に侵入することができます。 また、多様な移動機構が原因で接着分子8の異なる役割に、2Dおよび3Dで活性であることが示されています。 measureablで細胞の運動性を調査するin vitroアッセイにおける生理学的に関連するので、移動e及び簡単な方法は、細胞運動現象9の理解に重要です。残念ながら、細胞の移動を分析することの困難は、総合的な定量化可能な走化性アッセイは、通常、公平な細胞の運動性と輸送現象モデルの測定に設立され、長い骨の折れる方法を、必要とします。 細胞走化性を調査する過去の実験的アプローチは、Boydenチャンバー10と下のアガロースアッセイ11を含みます。しかし、これらの初期のアッセイ内で、細胞遊走実験は、時間に対しての動きを監視していませんでした。もっと、重要なのは、実験に用いた濃度勾配が十分に定義されていないか、わずか数時間を超えないためのシグナリングを維持しつつ、完全に理解しました。また、初期の走化性チャンバーの試みは2次元に細胞移動を制限し、1つは、移行12の動態を監視することはできませんでした。 Boydenチャンバーを見ると、エンドポイントアッセイ研究者が視覚的に移行を観察することができず、直接ケモキネシス（ランダム移動）から走化性（方向性）を区別することができませんでした。また、孔径、厚さ、いくつかの変数の違いを容易に再現することは非常に困難チャンバ膜が製およびケモカイン13,14への細胞の移住反応を隠し。 マイクロフルイディクスの新しい理解して、新しいチャンバ及びマイクロデバイスは、間質流動条件または走化性15,16の下のセルの移動を調査する手段として研究されてきました。これらの新しいデバイスの下では、新しいセルのメトリクスを導入し、細胞17,18のせん断応力の影響のように、調査しました。残念ながら、過去と現在のマイクロ流体走化性チャンバー2D基板 - 腫瘍細胞の浸潤や転移を含む多くの生物学的プロセス、以来重要な後退に細胞移動の研究を制限され、イム胸細胞の移動は、3D移動を伴います。 直接観察室、化学誘引物質溶液が細胞を含む三次元ゲルと接触しても、また19,20が報告されています。これらのチャンバは、2つの区画、化学誘引物質および細胞を含むいずれかを含むものを持って、互いに水平方向に21または同心円状のリング22と横に結合されています。これらのシステムは、正しい方向に指摘されているが、長期間走化性システムを保持しません。 さらに、研究者はまた、透析細胞、ならびに静水圧23〜25にかけコラーゲンサンプルを介してトレーサー分子の拡散にコラーゲン膜を通した拡散性を検討しました。コラーゲンゲルの一部の拡散実験は、磁場および化学取込み26を用いたゲルの物理的および化学的修飾に依存しています。コー​​ラで拡散をモデル化するための一般的な方法genous組織が連続点光退色の蛍光イメージングに依存しています。この方法は、指向膠原組織における高分子の拡散係数に異方性を明らかにしました。しかし、光退色は、関節軟骨ではなく、コラーゲンマトリックス中で使用されています。類似の間、必要なモデリング実験は、具体的にコラーゲンゲルの拡散係数を理解することを通して実施しなければなりません。さらに重要なことに、システムは、セル力発生を測定するための方法を利用しません。 マトリックスを通して細胞トラッキング、走化性因子と拡散勾配の理解を可能にする、再現性の容易さと、比較的簡単なセットアップ、の最小化：残念ながら、ほとんどのシステムでは、理想的なシステム用に1つまたは2つの重要な要素が欠けているように見えます細胞-細胞相互作用、および定量化のための寸法の単位を測定する能力（ 例えば 、速度、力、特定の濃度）。 Moghe ら。 </eM&gt; 図27は 、細胞を最初にゲル全体に分散よりもむしろフィルタ表面に濃縮されたこれらの要件のほとんどを満たしシステムを提案したが、セルが生成する力を測定することは困難でした。 この目的のために、我々は細胞を測定するために、画像解析技術を用いて結合された1つは、タイムラプス顕微鏡検査に基づいて、既存のアッセイの現代の拡散室の制限を克服することを可能にする3次元コラーゲンマトリックスに走化性を調査する平面勾配拡散システムを提示します3D環境の力。このプロトコルは、異なるセル内の3D走化性を研究するために使用することができる単純な3D拡散室を作成するシンプルで革新的な方法を提供します。

<table><tbody><tr><td>シリコーンエラストマーキット</td><td>ダウ・コーニング社</td><td>182 SIL ELAST KIT .5KG</td><td>10:1ミックス</td></tr><tr><td>ライブセルイメージングチャンバー</td><td>ライブセルインスツルメント</td><td>CM-B18-1</td><td>CMB for 18&nbsp;mm丸型カバースリップ</td></tr><tr><td>22&nbsp;mm ガラスカバースリップ</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック・サイエンティフィ</td><td>ック・NC0180281</td><td>ノイビトロ社製カバースリップ 22&nbsp;mm 1.5</td></tr><tr><td>機械加工アルミニウム メタルキューブ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホビー ユーティリティ ナイフ</td><td>X-Acto</td><td>X3201</td><td></td></tr><tr><td>3-(アミノプロピル) トリメトキシシラン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778-5ML</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド</td><td>Polysciences, Inc</td><td>00216A-10</td><td>グルタルアルデヒド、EM グレード、8%</td></tr><tr><td>50 ml チューブ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>14-432-22</td><td>標準床モデルと卓上遠心分離機ガラス</td></tr>ペ<tr><td>トリ皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-747A</td><td>再利用可能なペトリ皿:コンプリート(60 x 15&nbsp;mm)</td></tr><tr><td>鉗子</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>22-327-379</td><td>ファインポイント鉗子</td></tr><tr><td>カバー グラス</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>12-518-105A</td><td>長方形; 30 x 22&nbsp;ミリメートル;厚さNo.1</td></tr><tr><td>トリデカフルオロ-1,1,2,2-テトラヒドロオクチル</td><td>Gelest</td><td>SIT8174.0</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>酢酸ACS試薬、&ge;99.7%</td></tr><tr><td>ヘキサン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>296090</td><td>無水、95%</td></tr><tr><td>エチルアルコール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 プルーフ、分子生物学用</td></tr><tr><td>高精度ダイヤモンドスクライビングツール</td><td>Lunzer</td><td>PV-081-3</td><td>ストレート拡張チップスクライブ、.020" (.50&nbsp;mm)直径.200インチ(5.0&nbsp;mm) 先端の長さ</td></tr><tr><td>真空グリース</td><td>ダウ コーニング</td><td>14-635-5C</td><td>高真空グリース</td></tr><tr><td>15 ml チューブ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>14-959-49D</td><td>15 ml 円錐形遠心分離チューブ、疎水性、生物学的に不活性な表面</td></tr><tr><td>10x リン酸緩衝液</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>BP399-500</td><td>1.37 M 塩化ナトリウム、0.027 M 塩化カリウム、0.119 M リン酸緩衝液</td></tr><tr><td>1&nbsp;N水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>38215</td>水<td>酸化ナトリウム濃縮物</td></tr>コラーゲン<tr><td>I、ラットテール</td><td>BDバイオサイエンス354236</td><td></td><td>ラットテール&nbsp;</td></tr><tr><td>マイクロ遠心チューブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>02-681-332</td><td>容量:2.0 ml; O.D. x L:13&nbsp;x&nbsp;40&nbsp;ミリメートル; 滅菌;single-wrapped</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>カルボキシレート修飾マイクロスフェア</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp;F-8813</td>カル<td>ボン酸修飾マイクロスフェア、0.5 &micro;m、黄緑色蛍光灯(505/515)、2%固形分</td></tr><tr><td>Rhodamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83689</td><td>蛍光用ローダミンB</td></tr></tbody></table>

3dコラーゲンマトリックス中の走化性を調査するために、平面グラデーション拡散システム

Planar Gradient Diffusion System to Investigate Chemotaxis in a 3D Collagen Matrix

細胞移動の重要性は、人間の生命の発達を通じて見ることができます。細胞が移動すると、力が生成され、その力が周囲に伝達されるため、細胞の移動と移動が起こります。細胞移動を変化させたり、影響を与えたりするメカニズムを理解するために、これらの力を研究することができます。理論的には、細胞移動の根底にある基本的なメカニズムと力を理解することは、疾患の治療と細胞移植の促進のための効果的なアプローチを約束します。残念ながら、開発された最新の走化性チャンバーは、通常、2次元(2D)に制限されており、複雑な拡散勾配があるため、実験の解釈が困難です。この目的のために、走化性研究のための直接観察チャンバーを開発し、この論文で説明することで、3D環境で細胞力とチャンバー内の特定の濃度を測定できる最新の走化性チャンバーの障害を克服して、細胞の3D移動を研究することができます。さらに魅力的なのは、このアプローチにより、3Dコラーゲンマトリックスによる拡散をうまくモデル化し、複数の異なる濃度のコラーゲンによる化学誘引剤の拡散係数を計算することができると同時に、牽引力顕微鏡(TFM)やデジタルボリューム相関(DVC)分析のためのシステムをシンプルでユーザーフレンドリーに保つことができることです。

正確に細胞の遊走を評価するために、このアッセイの能力は、システムの良いセットアップに依存しています。したがって、それは正確に拡散系の金型を設計し、 図1に示すように、疎水性および親水性の両方のカバーガラスを配置することに細心の注意を払うようにしてください非常に重要です。システムが適切に設計されており、非常に見つけることが確実に拡散モデリング段階でされている場合良好な直線スタートライン、一つは素晴らしい達成することができるシステムの普及を分析するために、 図2に示すように、画像を蛍光を発します。 成功した細胞走化性分析するための鍵は、拡散をモデル化し、計算ソフトウェア生成されたコードを介して拡散し、特定の濃度の方程式の係数を見つけるために、一般的な拡散方程式を解いています。計算ソフトウェアに画像をインポートし、分析（ 図3）を実行した後、拡散係数（ 表2）を評価することができる。 図4を 5試験したコラーゲン濃度を通...

細胞の移動は、人間の発達と生命の重要な部分です。細胞遊走を変化させるメカニズムを理解するために、3Dコラーゲンマトリックスの走化性を調査するための平面勾配拡散システムを提示します。

3Dコラーゲンマトリックス中の走化性を調査するために、平面グラデーション拡散システム

The importance of cell migration can be seen through the development of human life. When cells migrate, they generate forces and transfer these forces to ...

この手順の全体的な目的は、3Dコラーゲンマトリックスにおける走化性を調査するための平面勾配拡散チャンバーを作製することです。これは、まず生細胞イメージングチャンバーを用いて3Dシリコン型を作製することで達成されます。次のステップでは、親水性および疎水性のカバーガラスを作製し、それらを用いて3Dシリコン型を組み立てます。次に、コラーゲン細胞混合液を中央コンパートメントに加え、重合させます。最終ステップとして、インキュベーション後にモールドから疎水性カバーガラスを取り除き、一方のリザーバーに通常の培地を、もう一方のリザーバーに化学誘引物質を含む培地を加えます。最終的に、共焦点顕微鏡を用いて細胞の走化性を経時的に追跡し、コラーゲンマトリックス内での細胞の移動変位を可視化します。ボインチャンバーやマイクロアスレティクスなどの既存の手法に対する本手法の主な利点は、使い捨てピペットを用いて、単純な拡散勾配による3次元空間内の遊走を調査するための簡便なセットアップが可能であることです。150 µLのアミノセリン A-P-T-M-Sを量り取り、50 mLチューブに入れます。次に、別の使い捨てピペットを用いて100%エタノール30 mLをチューブに加え、蓋を閉めます。溶液を2分間ボルテックスし、完全に混合させます。次に、溶液をガラス製ペトリ皿に注ぎ、そのままにしておきます。続いて、別のペトリ皿に100%エタノール15 millilitersを注ぎ、新しい使い捨てピペットを用いて最初の皿から移します。脱イオン水を30 milliliters量り取り、50 milliliterチューブに注ぎます。次に、新しい使い捨てピペットを使用して、1.875 millilitersのグルタルアルデヒドをチューブに加え、蓋を閉めます。溶液を2分間ボルテックスし、その後、混合液を3枚目のペトリ皿に注ぎます。ピンセットを用いて、直径22 mmの円形ガラスカバーガラスを1枚取り出し、両面を100% ethanol混合液で洗浄します。使い捨てピペットを使用して、洗浄したカバーガラスをamino selineを含む最初のディッシュに入れ、ピンセットで固定して5分間溶液に浸します。カバーガラスを取り出し、再び100% ethanolで洗浄します。次に、洗浄したガラスカバースリップをグルタルアルデヒドの入ったディッシュに入れ、30分間静置します。30分後、ピンセットでガラスカバースリップを取り出し、脱イオン水で洗浄します。洗浄したカバースリップをティッシュの上に置き、室温で一晩乾燥させます。疎水性カバーガラスを調製するために、まず50 mLチューブにTTS 500 µL、酢酸 100 µL、ヘキサン 19.4 mLを加え、2分間ボルテックスします。次に、この溶液をガラス製ペトリ皿に注ぎ、清潔なピンセットを用いてガラスカバーガラスを調製した溶液の中に投入し、2分間静置します。2分後、ピンセットでガラスカバーガラスを取り出し、使い捨てピペットを用いて脱イオン水で洗浄し、カバーガラスをティッシュの上に置いて室温で一晩乾燥させます。乾燥させたカバーガラスは、使用するまでプラスチック製のペトリ皿に保存してください。付属のテキストプロトコルに従って、生細胞イメージングチャンバーを組み立てます。次に、メーカーの指示に従ってシリコンエラストマー溶液を混合し、5 mLのエラストマーを作成します。その後、使い捨てのラボ用スパチュラを用いて、金型コンポーネントを乱さないように、シリコンエラストマー溶液を生細胞イメージングチャンバーのセットアップにゆっくりと注ぎます。型を安全な場所に置き、一晩室温で静置します。翌朝、ピンセットで型を取り出し、加工済みのアルミニウム金属キューブを慎重に型から抽出します。次に、シンクで型を脱イオン水で洗浄し、ペーパータオルの上に置いて乾燥させます。乾燥後、ホビー用カッターナイフを使用して、シリコンモールド内の各長手方向の端から2.34 mm間隔でスリットを入れます。実験で使用するまで、モールドを安全で乾燥した場所に保管してください。モールドを90% ethanolで洗浄し、脱イオン水を満たしたペトリ皿に入れて一晩静置します。翌朝、型をペーパータオルに移し、空乾させます。高精度のダイヤモンドスクライビングツールを使用して、親水性カバーガラスを3.95 mm × 5.99 mmよりわずかに大きい2つの長方形に切り出します。次に、切り出した長方形のカバーガラスをシリコンモールドの切り込みにそれぞれ挿入し、モールドを裏返しにして、使い捨てピペットを用いてシリコンモールドの底面に真空グリースを塗布します。その後、モールドを再び正位置に戻し、モールドの底面を円形の親水性ガラスカバーガラスに押し付けます。シールを作成するために、所定の濃度の培地と化学誘引物質の混合液を15 milliliterチューブで調製し、その混合液5 millilitersを新しいmilliliterチューブに、プレーンな培地5 millilitersを別のチューブにそれぞれピペットで分注します。両方のチューブを37 °Cに加熱したウォーターバスに移します。次に、10 XPBS 30 µLをマイクロ遠心チューブにピペットで分注します。同じマイクロ遠心チューブに1 N 水酸化ナトリウム溶液 6 µLを加え、15秒間ボルテックスします。次に、黄色緑色蛍光カルボキシレート修飾マイクロスフィア 18 µLと、氷冷したタイプIラット尾コラーゲン 168.3 µLをマイクロ遠心チューブに加えます。混合物を30秒間ボルテックスします。次に、目的の細胞を77.7 µL加えます。培地中の細胞密度を2 × 10⁶ cells/mLとしてマイクロ遠心チューブに加え、混合します。ピペットチップを用いて20秒間、コラーゲン細胞混合液300 µLを準備したモールドアセンブリの中央ウェルにピペッティングします。次に、型を使い捨てペトリ皿に載せ、標準的なインキュベーターに入れ、37 °C、5% carbon dioxide の条件下で20分間培養します。培養期間後、ピンセットで各カバーガラスの上端を挟み、型から引き上げるようにして、両方の疎水性カバーガラスを取り除きます。システム全体を顕微鏡へ移動させ、コラーゲン型の側面が依然として直線的であることを確認し、顕微鏡下に置いた状態でより平面的な拡散勾配を確保します。最初のウェルに細胞培地を100 µL加えます。次に、目的の化学誘引物質濃度を含む細胞培地100 µLを、マトリックスの反対側のウェルに加えます。付属のテキストプロトコルに従い、蛍光標識されたマイクロスフィアを基準にして細胞の遊走を追跡します。ここに提示する一連の画像は、1 mg/mLのコラーゲンゲル中を拡散するルミンの移動を示しています。この例では、システムにおける真の平面拡散勾配を示しており、導入されるあらゆる化学誘引物質においても同様の結果が期待されます。ここに示す例では、赤色の正方形で示された位置において、ルミネス信号の強度を経時的に測定しました。これらの各位置における濃度はこのグラフに個別の線として示されており、定常状態で測定すると、ゲル内の位置に基づいた線形な濃度勾配が得られます。この関係は広範囲のコラーゲンマトリックス濃度において線形に保たれるため、このシステムは細胞実験に非常に有用です。この画像では、赤色に染色された好中球が、位置基準として使用される蛍光緑色のマイクロスフィアが分散したコラーゲンマトリックス内に示されています。続く3枚の画像は、白い矢印で示される化学誘引物質の濃度勾配に従って、好中球が方向性遊走を行う様子を示しています。このビデオを視聴することで、3Dコラーゲンマトリックス内での細胞遊走を調べるための簡易的な拡散チャンバーの作製方法について、十分に理解することができます。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

生細胞遊走試験のための顕微鏡検査室における接着剤および可溶性勾配のアセンブリのための方法が記載されている。エンジニアリング環境は、ソリューションの勾配と防汚表面と接着剤のトラックを結合し、したがって1つは、指導の手がかりの相対的な重要度を決定することができます。...

蛍光顕微鏡を用いたイメージング細胞遊走用接着剤及び可溶性グラデーションを作成する

細胞移動は、癌のような創傷治癒および免疫応答、および病態生理学的過程として、生理の茄多に関与している生物学的な現象である。 3次元コラーゲンマトリックス遊走アッセイは、3D生理的環境における内の異なる細胞型の遊走特性を分析するための多目的なツールである。...

三次元コラーゲンマトリックス内の細胞移動の解析

機械的性質と細胞外マトリックスの微細構造は強く、細胞の3D移行に影響。 インビトロ方法は、集団及び個々の細胞レベルの両方での生物物理学的に可変環境における時空間細胞移動の挙動を研究するために、記載されている。...

同心円状のゲルシステムは、3D細胞移動に対するマトリックスの微小環境の生物物理役割を研究する

コラーゲンは、ECMのコアコンポーネントであり、移行からの分化・増殖に至るまで、いくつかの細胞プロセスに不可欠な手がかりを提供します。 3Dコラーゲンハイドロゲル内の細胞を埋め込むためのプロトコル、およびPDMSマイクロチャネルを使用して、ランダム化または整列コラーゲンマトリックスを生成するための、より高度な技術がここに提供します。...

3D相互作用の研究のための3Dコラーゲンゲルおよびマイクロチャネルの作製<em&gt;インビボ</em

視覚走化性アッセイは、走化性因子媒介方向の細胞遊走を制御する方法、真核細胞のより良い理解のために不可欠です。 1）リアルタイム、複数の走化性アッセイの高解像度の監視、および2）を同時に化学誘引物質勾配を可視化し、好中球様HL60細胞内シグナル伝達事象の時空間ダイナミクス：ここで、我々はのための詳細な方法について説明します。...

イメージングGタンパク質共役型受容体媒介走化性及び好中球様HL60細胞におけるそのシグナル伝達のイベント

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血液滴からの迅速な好中球走化性解析のためのオールオンチップ法

このプロトコルでは、細胞の微小環境を維持しながら三次元の設定のセルの移行と侵略の機能を定量化に使用できる反転垂直浸潤能の測定法について説明します。この試金は稀および/または敏感な細胞に適しています。...

上に移動: シンプルかつ柔軟なIn Vitro三次元侵略試金のプロトコル

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化学誘引物質勾配に対するマルチセル応答の3D 解析

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神経系発達中の軸の成長と挙動を解析する3Dコラーゲンベースのヒドロゲルの生成

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ここでは、C5a勾配を化学戦術補体で画像マウス常駐腹膜マクロファージにタイムラプス、位相コントラスト顕微鏡を用いた方法について説明する。プロトコルは、他の免疫細胞に拡張することができます。...

マウスマクロファージ・ケモタクシスのタイムラプスイメージング

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3Dコラーゲンマトリックス中の走化性を調査するために、平面グラデーション拡散システム

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