3Dコラーゲンマトリックス中の走化性を調査するために、平面グラデーション拡散システム

この手順の全体的な目標は、3Dコラーゲンマトリックスの化学療法税を調査するためのプレーナーグラジエント拡散チャンバーを作成することです。これは、最初に生細胞イメージングチャンバーを使用して3Dシリコーンモールドを作製することによって達成されます。2番目のステップは、親水性と疎水性のカバースリップを作成し、それらを使用して3Dシリコーン型を組み立てることです。

次に、コラーゲン細胞混合物を中央コンパートメントに加え、重合させます。最後のステップは、インキュベーション後に疎水性カバースリップを型から取り除き、一方のリザーバーにプレーン培地を追加し、もう一方のリザーバーに化学療法剤を含む培地を追加することです。最終的に、共焦点顕微鏡法を使用して、細胞の走化性を経時的に追跡し、コラーゲンマトリックス内の細胞運動の変位を視覚化します。

この技術の主な利点は、boinチャンバーやマイクロアスレチックのような既存の技術よりも、それは単純な拡散勾配で3D空間での移動を調査するための簡単なセットアップを可能にすることです、使い捨てピペットを使用していません。150マイクロリットルのアミノセリーヌA-P-T-M-Sを測定し、50ミリリットルのチューブに注ぎます。次に、2番目の使い捨てピペットで30ミリリットルの100%エタノールをチューブに追加し、蓋を閉めます。

溶液を2分間ボルテックスして、完全に混合します。次に、溶液をガラスのペトリ皿に注ぎ、脇に置きます。次に、15ミリリットルの100%エチルアルコールを2番目のシャーレに注ぎ、新しい使い捨てピペットを使用して最初のディッシュに入れます。

30ミリリットルの脱イオン水を測定し、溶液を50ミリリットルのチューブに注ぎます。次に、新しい使い捨てピペットを使用して、1.875ミリリットルのグルアルデヒドをチューブに追加し、蓋を閉じます。溶液を2分間ボルテックスし、次に混合物を3番目のシャーレに注ぎます。

鉗子を使用して、22ミリメートルの丸いガラスカバースリップを1枚取り出し、両面を100%エタノール混合物ですすいでください。使い捨てピペットを使用して、すすぎガラスカバースリップをアミノセリーヌを含む最初の皿に入れ、鉗子を使用して溶液に5分間放置します。ガラスカバースリップを取り出し、再度エタノール100%ですすいでください。

次に、すすいだガラスカバースリップをグルタルアルデヒドで皿に落とし、30分間置いておきます。30分後、鉗子でガラスカバースリップを取り外し、脱イオン水ですすいでください。すすいだカバースリップをティッシュにのせ、室温で一晩乾かします。

疎水性カバースリップを準備するには、まず500ミリリットルのチューブに500マイクロリットルのTTS、100マイクロリットルの酢酸、19.4ミリリットルのヒーンを追加し、2分間ボルテックスします。次に、溶液をガラスのペトリ皿に注ぎ、きれいな鉗子を使用して、準備した溶液に1つのガラスカバースリップを落とし、2分間そのままにしておきます。2分後、鉗子を使用してガラスカバースリップを取り出し、使い捨てピペットを使用して脱イオン水ですすぎ、カバースリップをティッシュに置き、室温で一晩乾燥させます。

乾燥させたカバースリップをプラスチック製のペトリ皿に保管し、開始するまで、添付のテキストプロトコルに記載されているように生細胞イメージングチャンバーを組み立てます。次に、製造元の指示に従ってシリコーンエラストマー溶液を混合し、5ミリリットルのエラストマーを作ります。次に、使い捨てのラボ用スパチュラを使用して、シリコーンエラストマー溶液をライブセルイメージングチャンバーのセットアップにゆっくりと注ぎ、金型コンポーネントを乱さないようにします。

型を安全な場所に置いて、室温を一晩キュレーションします。翌朝、鉗子を使って型を抜き、削り出したアルミ金属キューブを丁寧に型から取り出します。次に、シンクに行き、型を脱イオン水ですすぎ、型をペーパータオルの上に置いて乾かします。

乾いたら、ホビーユーティリティナイフを使用して、シリコン型内の各縦方向の端から2.34ミリメートル離れてスリットスペースを切ります。実験に必要になるまで、金型が安全で乾燥した場所に留まることを確認してください。型を90%エタノールですすぎ、型を脱イオン水で満たされたシャーレに入れて一晩放置します。

翌朝、型をペーパータオルに移し、型が乾いている間に風乾させます。高精度のダイヤモンドスクライビングツールを使用して、正方形をカットします。親水性カバーは、3.95ミリメートル×5.99ミリメートルよりわずかに大きい2つの長方形に滑り込みます。

次に、カットした長方形のカバーをそれぞれスライドさせてスロットに滑り込ませ、シリコン型に切り込み、型を逆さまにして、使い捨てピペットを使用してシリコン型の底に沿って真空グリースを塗布します。次に、金型を右側を上に戻し、金型の底を円形の親水性ガラスカバースリップに押し付けます。シールを作成するには、15ミリリットルのチューブに培地と化学療法誘引剤の混合物を所望の濃度で調製し、5ミリリットルの混合物を新しいミリリットルのチューブにピペットで移し、5ミリリットルのプレーン培地を2番目のチューブにピペットで移します。

両方のチューブを摂氏37度に加熱された水浴に移します。次に、30マイクロリットルの10XPBSをマイクロ遠心チューブにピペットで移します。1つの通常の水酸化ナトリウム溶液の6マイクロリットルを同じマイクロ遠心チューブに加え、15秒間ボルテックスします。

次に、18マイクロリットルの黄緑色蛍光カルボン酸塩、修飾されたマイクロスフェアをマイクロ遠心分離チューブに加え、168.3マイクロリットルの氷冷を加えます。ラットテールコラーゲンを1種類。混合物を30秒間ボルテックスします。

次に、77.7マイクロリットルの目的のセルを追加します。培地中の1ミリリットルあたり6個の細胞を10倍に2回タイプし、マイクロ遠心チューブに混合します。ピペットチップを20秒間使用して、コラーゲン細胞混合物の300マイクロリットルを調製した金型アセンブリの中央ウェルにピペットで挿入します。

次に、型を使い捨てのペトリ皿に置き、摂氏37度で5%二酸化炭素で20分間標準的なインキュベーターに移動しますインキュベーション期間後、鉗子を使用して、各カバースリップの上部にクランプし、次に引き上げて型から離すことにより、両方の疎水性カバースリップを取り外します。システム全体を顕微鏡に移し、チャンバーを検査してコラーゲンモールドの側面がまだまっすぐであることを確認し、顕微鏡下でシステムを使用したままのプレーナー拡散勾配を可能にします。100マイクロリットルの細胞培地を最初のウェルに加えます。

次に、目的の化学療法誘引剤濃度の100マイクロリットルの細胞培地をマトリックスの反対側のウェルに加えます。付属のテキストプロトコルに記載されているように、蛍光標識されたマイクロスフェアを参照して細胞遊走を追跡します。ここで紹介する一連の画像は、1ミリグラムあたり1ミリグラムのコラーゲンゲルを通って移動する反芻の拡散を示しています。

この例では、システムの真の平面拡散勾配を示していますが、これは導入された化学療法誘引剤にも期待できます。ここに示す例では、反響信号の強度を、赤い四角で識別された位置で経時的に測定しました。これらの各位置での濃度は、このグラフに別の線で示されており、定常状態で測定すると、ゲル内の位置に基づいて線形の濃度勾配が生成されます。

この関係は、コラーゲンマトリックスの濃度範囲にわたって線形に保たれ、このシステムは細胞実験に非常に有用です。この画像では、位置基準として使用される蛍光緑色の微小球が散在するコラーゲンマトリックス内に、赤色の好中球が示されています。次の3つの画像は、好中球が化学療法誘引剤の勾配を上に移動するときの指向性移動を示しています(これは白い矢印で示されています)。

このビデオを見れば、3Dコラーゲンマトリックス中の細胞移動を調査するための簡単な拡散チャンバーの作り方を十分に理解できるはずです。