相図の特徴付け液体担体として磁気ビーズを使用しました

本実験の全体的な目的は、磁性ビーズを用いて、ラボ・アンド・チューブデバイス内の隣接する液体セグメント間のキャリーオーバー量を分析することである。これは、疎水性チューブを用いてデバイスを作製し、シリンジポンプで充填して、エアバルブで区切られた複数の液体セグメントを構成し、そのうちの一つの液体に磁性ビーズと蛍光染料の両方を組み込むことで達成される。第二のステップとして、外部磁石を用いて磁性ビーズの移動を行うたびに、顕微鏡を用いて隣接する液体セグメントの蛍光強度を測定する。

次に、磁性ビーズのキャリーオーバー量を算出するため、これらの蛍光強度測定値を用いて数値解析を行います。その結果、2種類の液体からなる多成分系における相変化の解析は、隣接するリザーバー間でマイクロリットルサイズの液量を転送する手法として磁性ビーズを利用することで実現可能であることが示されました。本日ご覧いただくように、私たちは、複雑な従来のマイクロ流体回路ではなく、単純なチューブ内で液体を転送するために磁性ビーズを用いるという、非常にエキサイティングでシンプルな手法を用いて研究に取り組んでいます。

私たちは、まずこの手法を許容流体間の界面調査に適用しましたが、現在は全血の診断分析、赤血球からのタンパク質分離、尿分析、免疫測定法など、他のアプリケーションへの展開を進めています。マイクロ流路を用いるなどの既存の他の手法に対する本手法の主な利点は、簡便であり、製造コストを抑えられることです。また、異なる実験タイプ間での高いユーザー汎用性を備えており、一貫した結果を得ることができます。

この手法は、極微量のピークボリュームの移動を必要とするアプリケーションへの知見を提供できるだけでなく、血液分離、ドラッグターゲティング、造影剤などの他のシステムにも適用可能です。チューブを準備するには、まずチューブを15 centimeterのセグメントに切り、テープを用いてチューブセグメントを垂直に吊るし、チューブの下にペーパータオルを置いて過剰なフルオロポリマー溶液を回収できるようにします。ピペットを用いて、各チューブセグメントの上部開口部からフルオロポリマー溶液を100 microliters注入し、内壁の全周に溶液が接触するようにします。

チューブセグメントを1時間そのまま吊るしておき、過剰なフルオロポリマー溶液を除去します。次に、チューブセグメントを100 °Cのオーブンに1時間入れ、フルオロポリマーコーティング層を焼き付けます。続いて、20 mLのサンプルバイアルをマイクロバランスに載せて風袋引きを行い、希釈磁気ビーズ溶液を調製します。

磁性ビーズ溶液の容器を撹拌し、マイクロピペットを用いて0.6 millilitersを分取します。分取した溶液を天秤上のサンプルバイアルに入れ、さらに蒸留水を0.4 milliliters分注します。また、色素を0.02 weight percentの濃度で脱イオン水に溶解させ、溶液を1分間ボルテックスして蛍光染料を調製します。

チューブデバイスを準備するには、チューブの一端にメス用ルアーロックコネクターを挿入します。3 mL容量で0.1 mL目盛りのルアーロックシリンジにチューブをセットします。シリンジをシリンジポンプに取り付け、注入速度を2 mL/hに設定します。

磁性ビーズ溶液が入った容器をボルテックスし、シリンジポンプを用いて20 µLをチューブ内に注入します。テストチャンバーへの液体注入が完了した後、6 µLの空気をチューブ内に吸入します。この量の空気は、後で2つの液体セグメントの間にバルブを形成します。

エアギャップの挿入が完了したら、蛍光染料を含む液体を180 µL採取し始めます。チューブのもう一方の端に2つ目のメス用ルアーロックコネクターを取り付け、シリンジからチューブデバイスを取り外します。その後、デバイスの両端にルアーロックキャップを装着します。

倒立顕微鏡を用いて、テストチャンバーとリザーバーの初期蛍光強度を測定します。デバイスをキューブマグネットの上に配置し、磁性ビーズがすべてテストチャンバー内の一箇所に集まるようにします。デバイスをマグネットの上で移動させ、ビーズをリザーバーへ転送します。

磁性ビーズのクラスターがエアギャップを通過してリザーバーに移動したら、デバイスをマグネットの上に置き、回転させてクラスター内に閉じ込められた液体を放出するように磁性ビーズを攪拌し、リザーバー内の均質化を完了させます。その後、デバイスをマグネットの上に配置し、リザーバー内の磁性ビーズがすべて1か所に分離するようにします。磁性ビーズのクラスターをテストチャンバーに戻します。

クラスターがテストチャンバーに到達したら、デバイスを磁石の上に置き、回転させて磁気ビーズを撹拌します。テストチャンバー内の均質化が完了するまで、捕捉された蛍光液体を放出させます。倒立顕微鏡を用いて、テストチャンバーとリザーバーの両方の蛍光強度を測定します。

両方の液相セグメントが同様の蛍光強度に収束するまで、これらの手順を繰り返します。チューブデバイスを準備するには、チューブの一端にメス用ルアーロックを挿入し、チューブをルアーロックシリンジにセットします。次に、シリンジをシリンジポンプにセットし、供給速度を 2 mL/h に設定します。

シリンジポンプの吸引を用いて、水に分散させた磁性ビーズとC 12 E 5の1:1混合溶液20 µLをチューブに注入します。テストチャンバーへの液体注入完了後、エアギャップ挿入のために空気を6 µLチューブ内に吸引します。光学系のセットアップを行うため、純粋なC 12 E 5界面活性剤180 µLの吸引を開始します。

まず、磁気ビーズが入ったテストチャンバーが実体顕微鏡の焦点に合うように、チューブデバイスを備えたシリンジポンプを移動させます。ここでは直交ニコル（クロスニコル）法を用います。沈殿した固相と液相のコントラストを高めるために、LED光源の上に偏光フィルムを配置してください。次に、LED光源をシリンジポンプに取り付けられたチューブの下にスライドさせて配置します。

もう一枚の偏光フィルムをテープで実体顕微鏡のレンズに取り付け、2枚の偏光フィルムが互いに90度のオフセットを持つように配置してください。スタンドに固定したキューブマグネットをテストチャンバーの横に配置します。磁気ビーズがクラスターを形成したら、供給速度 2 mL/h でチューブに液体をポンプ注入し、磁気ビーズクラスターをテストチャンバーからエアギャップを越えて界面活性剤リザーバーチャンバーへと移動させます。

磁性ビーズのクラスターがリザーバーチャンバーの中点に達したら、シリンジポンプのポンピングを停止します。磁性ビーズを分離させ、ビーズクラスター内に捕捉された液体の拡散時間を短縮するために、キューブマグネットをチューブから遠ざけます。液体の拡散と相変化が完了したら、磁性ビーズが再びクラスターを形成するように、マグネットをリザーバー側の元の位置に戻します。

シリンジポンプを使用して、磁気ビーズクラスターが界面活性剤リザーバーからエアギャップを越えてテストチャンバーへと移動するように液体を吸引します。磁気ビーズクラスターがテストチャンバーの中点に到達した後、シリンジポンプを停止させ、キューブマグネットをチューブから遠ざけます。液体の拡散と相変化が完了したら、磁石をリザーバー付近の元の位置に戻し、磁気ビーズをクラスター状に形成させます。

テストチャンバーに相変化が表示されるまで、これらの手順を繰り返します。ここに、疎水性チューブ内の磁性ビーズ水および非イオン性界面活性剤C 12 E 5の画像を示します。最初の磁性ビーズ転送プロセスでは、外部キューブ磁石を使用してビーズを固定します。

液体がこちら左側へポンプで送られている間、ビーズはテストチャンバーから出てC 12 E 5へと進入します。磁性ビーズが進入すると、界面活性剤水溶液が磁性ビーズ構造から拡散し始めます。磁性ビーズが界面活性剤チャンバー内に5秒間留まった後、10秒の時点でわずかな相変化のみが観察されます。

磁気ビーズが界面活性剤に完全に包まれています。相変化は4分の時点での92の目盛りまで続きます。9分で相変化が加速します。

構造が垂直方向に成長するにつれて、水平方向の相変化が減少하기始めます。17分時点では相変化が大幅に縮小しており、25分時点ではごく少量の相変化のみが残っていることが示されています。ここでは、界面活性剤を移送する前の、磁気ビーズを入れたwater C 12 V fiveテストチャンバーの初期状態を示します。

6回の往復移送後、相変化が起こりました。逆に、デバイス内に磁気ビーズがない場合は相変化が見られず、観察された結果が液体ではなく磁気ビーズのキャリーオーバーによるものであることが証明されました。この手順を試みる際、チューブの内壁に付着することがあります。

本手順に従って隣接するリザーバー間で液体を移送する際は、拡散プロセスが進むための十分な時間を確保することが重要です。また、拡散プロセスをどのように加速させ、手動操作をどのように最小限に抑えるかといった追加の課題に対処するため、電磁石などのオプションを本システムに組み込むことも可能です。背景を説明すると、プラスチックチューブ、磁気ビーズ、および外部磁石という極めてシンプルな構成のこの手法は、異なる流体の分離や、それらの相図空間の探索に応用されてきました。

しかしながら、この手法の汎用性と簡便さは、主にさまざまな体液の診断分析の分野をはじめとする多くの他のアプリケーションにおいて有用です。磁性ビーズを用いて少量の液体を直接的に、あるいは磁性ビーズの機能化を通じて輸送させることで、液体サンプルの成分を分析することが可能になります。そして、これはあらゆる分野に応用が可能です。

例えば、全血中の赤血球からのタンパク質の分離および分析、同様に尿やその他の多くの体液における分析が、従来のマイクロ流体デバイス作製に伴う複雑さやコストをかけず、簡便な手法を用いてこの方式で実施可能です。