絶対タンパク質定量のための質量分析法を選択反応モニタリング

この手順の全体的な目標は、液体クロマトグラフィー、選択反応モニタリング、またはL-C-S-R-Mを使用して、複雑な生体サンプル内の標的タンパク質の絶対存在量を定量することです。ペプチドターゲットの選択に続いて、粗外部ペプチドスタンダードを合成し、液体クロマトグラフィー、質量分析、またはLCM MSを使用したSRMアッセイの開発に使用します。得られたアッセイは、調製された生体サンプルの定性的なlc、SRM分析を行うために使用されます。

生物学的サンプル由来の標的ペプチドが検出された場合、生物学的サンプルは、安定同位体希釈シリーズの内部ペプチド標準を添加することにより、定量的lc SRMアッセイを使用して分析されます。最終的に、lc SRMは、さまざまな生体サンプルからタンパク質を正確に定量し、さまざまなタンパク質ターゲットの研究をサポートするために使用できます。イムノアッセイのような既存の方法と比較した場合、この手法の主な利点は、アッセイの開発が比較的迅速かつ安価であること、および結果として得られるアッセイがマルチプレックス化に適しており、抗体の交差反応性に対して脆弱ではないことです。

まず、テキストプロトコルに記載されている凍結乾燥ペプチド標準液を調製します。次に、凍結乾燥ペプチド標準試料の各Mに100マイクロリットルのギ酸アセトニトリル溶液を添加して、10マイクロモルのペプチド濃度を作製します。サンプルを2分間ボルテックスし、浴します。

ペプチドの溶解が完全であることを確認するために、それらを5分間超音波処理します。溶解したペプチドを引き出し、得られた混合物を真空濃縮器で最終容量80マイクロリットルまで濃縮します。20マイクロリットルのアセチルニトリルを加えて、沈殿したペプチドを溶解します。

サンプルには、各ペプチドの10マイクロモルと、体積に対する20%のアセチルニトリルが含まれており、内部および外部ペプチド標準を調製するために、トリプルクワッド質量分析計と組み合わせたナノフローHPLCシステムを使用したショットガン質量分析により、注入ごとに各ペプチドの約1〜10ピコモルで外部ペプチド標準の混合物を分析します。テキストプロトコルに詳述されているように、各 LCMS 分析に 60 分間の線形グラジエント、カラム再生成ステップ、およびカラムリース平衡化ステップが含まれていることを確認してください。得られたショットガンデータをデータベースを使用して解析し、外部ペプチド標準の配列と照らし合わせて検索します。

すべてのペプチド同定を手動で確認し、それらがすべて明確であり、あいまいなペプチド同定を破棄していることを確認します。ショットガン Ms ペプチド同定を使用して、Skyline Line などのソフトウェアプログラムを使用してスペクトルライブラリを構築します。プリカーサーイオンあたり3〜10の最も強いトランジションを使用して、lc SRMトランジションリストを調製します。

得られたトランジションリストを使用して、外部ペプチド標準試料の混合物のlc SRM分析を実施します。得られたL-C-S-R-Mデータを手動で確認し、パフォーマンスの低いアッセイを削除します。生物学的サンプルを調製するため。

まず、テキストプロトコルに記載されているように細胞を採取します。調製したばかりの尿素溶解バッファー400マイクロリットルを加え、穏やかなピペッティングを使用して各サンプルを混合します。0.1ミリメートルジルコニアシリカビーズ、サンプルをフルスピードバスで5分間ボルテックスすることにより、約100マイクロリットルのOリングを含むOリングを備えたスクリューキャップを備えた2ミリリットルチューブに各サンプルを移します。

サンプルを室温で10分間超音波処理して、均質化とタンパク質の脱成熟を支援します。次に、定性分析のためのビッシー酸アッセイなど、ライセートのタンパク質濃度アッセイを実施します。安定同位体希釈シリーズ用の200 μgアリコートの細胞溶解物を調製します。

内部ペプチド標準のエコーモル混合物の安定同位体希釈系列をサンプルに加えます。各サンプルに0.7マイクロリットルの1モルDTTを添加し、サンプルを摂氏60度で30分間インキュベートすることにより、タンパク質システイン残基を減らします。アルキル酸タンパク質シスチンは、各サンプルに7マイクロリットルの緩衝ITOアセトアミドを添加し、サンプルを室温で暗所で20分間インキュベートします。

各サンプルについて、水酸化ナトリウムで調整した482マイクロリットルの100ミリモルヒーを追加し、最終的な尿素濃度が1モルになるようにします。次に、タンパク質をペプチドに分解します。細胞溶解物を含む各サンプルに、マイクロリットルシーケンシンググレードのトリプシンあたり0.5マイクログラムの8マイクロリットルを追加します。

次に、サンプルを摂氏37度で18時間インキュベートします。インキュベーション後、容量2%の容量の440マイクロリットルを容量ギ酸に添加し、すべてのサンプルを室温で21, 000Gで20分間遠心分離し、C 18 SPEカートリッジ固相を詰まらせる沈殿物をペレット化します。ディスポーザブル C 18 SPE カートリッジバーストを使用して、各 SUP natin を抽出します。

1ミリリットルのバッファーBを適用してカラムを濡らし、1ミリリットルのバッファーaを2回塗布して平衡化します。移動相をC 18 SPEカートリッジに通し、平らな面からゴム球と抽出マニホールドを使用します。サンプルを適用し、続いて緩衝液Aの1ミリリットルでカートリッジを洗浄し、2回、緩衝液B.Slowly真空濃縮器内の各iluを100マイクロリットルの最終容量に濃縮して、アセチルニトリルを蒸発させます。

次に、各サンプルにアセチルニトリル中のギ酸の5%体積から体積までの2マイクロリットルを追加します。前回と同様に定性的なL-C-S-R-Mを使用してサンプルを分析します。定量L-C-S-R-M分析では、各生物学的サンプルショットガン質量分析の同位体希釈シリーズを実行し、外部ペプチド標準を分析しました。

前駆体あたりの最も強い遷移の上位10個がL-C-S-R-Mに選ばれました。次に、L-C-S-R-Mを使用して、外部ペプチド標準を分析しました。結果として得られるペプチドの同定は明確でなければなりません。

生物学的サンプルの定性的なL-C-S-R-M分析では、通常、より多くのバックグラウンドシグナルが得られましたが、ほとんどのペプチドターゲットは自信を持って同定されました。定量L-C-S-R-Mは、生体サンプルにスパイクした内部ペプチド標準を使用して行いました。得られたタンパク質存在量の値は、標的タンパク質あたりの生物学的複製と 2 つの標的ペプチド間で一貫していました。

このビデオを見れば、複雑な生体サンプル中の標的タンパク質の絶対存在量を定量するためのL-C-S-R-Mアッセイの開発方法と実施方法について十分に理解できるはずです。