Name: 液胞対細胞質の定量化サルモネラ差動透過化初代マクロファージで (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぶ差動ジギトニン透過化を用いて骨髄由来マクロファージ内のSalmonella typhimuriumの液胞対細胞質分布を定量化する方法。FACS解析により細菌の細胞内局在を明らかにし、宿主病原体相互作用の理解に貢献します。

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私たちは、議論のためのマティアス·S.ディック、ローランドF.ドライアとセバスチャンリュールを承認したいと思います。この作品は、PBにSNSF教授職PP00P3_139120 / 1と大学バーゼルのプロジェクトグラントID2153162によってサポートされていました

mCherryを発現するサルモネラ （FACSベースの分析）1.ジギトニンアッセイ<ol><li>細菌の準備 注：プラスミドからmCherryをを発現するサルモネラ野生型SL1344は（ストレプトマイシン耐性）（pFPVがrpsMプロモーター下mCherryををコードする）は、このアッセイで使用されています。 mCherryを（データは示していない）16の構成的発現によって改変されない細菌の食作用及び増殖。 <ol><li> 37°CO / Nでシェーカーにストレプトマイシン（90μgの/ ml）およびアンピシリン（100μgの/ mlの、mCherryを発現するベクター）を補充したLB培地3mlでの感染の前に歪み1日に接種。 </li></ol></li><li>感染のために細胞をプレーティングします。 <ol><li> 1.25×10 5細胞の密度で24ウェルプレート内での種子野生型BMDMs /ウェルの一次マクロファージ培地1ml中では（DMEM、10％ウシ胎児血清（FCS、熱不活性化、56℃、30分を補っ）、1％HEPES、1％非必須アミノ酸（NEAA）、1％L-グルタミン及び10％L929上清（マクロファージコロニー刺激因子（M-CSFからの馴化培地）L929細胞を産生します）。シードウェル個々の条件を考慮して、表1に記載の方法。コントロール（ 表1）として使用するウェルにカバースリップを追加します。 </li><li> 37℃のインキュベーター中で一晩細胞をインキュベートし、5％CO 2。 </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2">透過化</td><td colspan="3">染色</td></tr><tr><td></td><td>ガラスカバースリップ</td><td>サルモネラ</td><td>ジギトニン</td><td>サポニン</td><td>抗サルモネラ</td><td>抗カルネキシン</td><td>抗PDI </td></tr><tr><td> A1（サンプル） </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A2（サンプル） </td><td> - / + * </td><td> + </td&gt; <td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A3（サンプル） </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A4（無透過性制御） </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A5（完全透過性制御） </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> B1（カルネキシンについて染色） </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B2（カルネキシンについて染色） </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B3（カルネキシンについて染色） </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> C1（染色）PDIのため</td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C2（PDIについて染色） </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C3（PDIについて染色） </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td></tr></tbody></table> 表1：サルモネラ、透過性、および染色によるその後の感染の24ウェルフォーマットでの骨髄由来マクロファージ（BMDMs）用メッキ方式 *プロトコル1またはプロトコル2が行われているかどうかに応じ。 <ol start="3"><li>感染細菌の準備。 <ol><li>次の日、PBSで文化1:10に希釈し、PBSのみのコントロールに対するOD 600を測定することにより、一晩培養でサルモネラ菌の濃度を決定します。これは、OD 600が Lで測定されることを保証します分光光度計のinear範囲。 </li><li> 1ml当たりのサルモネラの濃度を計算します。 1のOD600は、1×10 9細菌に相当します。 </li><li> 1.25×10 6細胞/ mlのサルモネラ濃度に達するように、マクロファージ培地中で細菌を希釈します。 </li></ol></li><li> サルモネラ菌による細胞の感染。 <ol><li> BMDMsからメディアを取り出します。非感染対照ウェル（B1〜B3、C1〜C3）にマクロファージ培地1mlを加えます。ウェルA1にサルモネラ懸濁液1mlを加える- A5は、セル当たり10の細菌の感染（MOI）の多数に到達します。 </li><li>感染を同期させるために37℃、300×gで15分間プレートを遠心。 37℃のインキュベーター内でプレートを移し、5％CO 2。 </li></ol></li><li>ゲンタマイシンを有する細胞外サルモネラ菌を殺します。 <ol><li> 1時間の感染後に、インキュベーターからプレートを除去し、0.1 mg / mlのゲンタマイシンを含むマクロファージ培地の0.1ミリリットルを追加します細胞外細菌を殺すために。すべてのセルが同じように扱われることを保証するために、さらに非感染対照に、すべてのウェルにゲンタマイシンを追加します。 37℃のインキュベーター内でプレートを移し、5％CO 2。 </li></ol></li><li>細胞を洗浄。 <ol><li> （37℃に予め温めておいた）を10μg/ mlを含む2時間の感染後、インキュベーターからプレートを取り外し、すべてのウェルは、プレーン1mlのDMEMで2回（37℃に予熱した）およびマクロファージ培地と交換し洗う​​時&#160;残りの細胞外細菌の増殖を防止するためにゲンタマイシン。 37℃のインキュベーター内でプレートを移し、5％CO 2。 </li></ol></li><li>界面活性剤と抗体と、新鮮な緩衝液を調製しました。 <ol><li>ただ、分析の所望の時点の前に、KHMバッファー（110 mMの酢酸カリウム、20mMのHEPES、2mMのMgCl 2を 、pHが7.3）で1mg / mlとでジギトニンの新鮮なストック溶液を準備します。在庫を濾過し、作業濃度にKHMバッファに希釈しますジギトニンを50μg/ mlの。また、KHMに1/100で1/100または抗PDIで1/500、抗カルネキシンでKHM緩衝液中0.1％サポニンの溶液を調製し、抗FITCに結 ​​合されたサルモネラ抗体（CSA-1-FITC）バッファは、3％BSAを添加しました。 </li></ol></li><li>細胞透過。 <ol><li>インキュベーターからプレートを外し、ウェルをKHMバッファー（37℃に予め温めておいた）の0.5ミリリットルで3回洗浄します。 KHM緩衝液を除去し、ウェルA1に井戸A4およびB1 / C1、ジギトニンでKHMバッファにプレーンKHMバッファ0.25ミリリットルを追加-ウェルA5と（ 表1による）B3 / C3にサポニンとA3とB2 / C2またはKHMバッファ。全てのウェルは、KHMバッファの0.5ミリリットルで3回洗浄し、直ちに室温で正確に1分間インキュベートし、（37℃に予熱しました）。 </li></ol></li><li>一次抗体染色。 <ol><li>適切なウェルに一次抗体溶液（ヤギ抗サルモネラ -FITC、250μL/ウェル、0.1μgの/ ml）をKHMバッファを削除し、追加します（ 図1 </st栄&gt; 表1）。 37℃のインキュベーターで15分間、プレートをインキュベートし、5％CO 2。 </li><li> 1 mLのPBSで1×細胞を洗浄。 </li></ol></li><li>感染細胞（ウェルA1 - A5）：FACS分析<ol><li>洗浄細胞をPBSで3倍、0.1％トリトンを含む氷冷PBSの0.5 mLを加え。細胞凝集体を破壊するためにセルストレーナーキャップ付き5mlのFACSチューブに移します。氷上でサンプルを保管してください。 </li><li> FACSのサンプルを分析します。完全に透過性にコントロールを使用して、全前方に基づく細菌と第一側方散乱（FSC / SSC）のためのゲートを設定し、mCherryを信号（610 nmの±20 nmのフィルター）。 </li><li>次に、サイトゾル細菌（FITC +、mCherryを+）および液胞細菌（FITC-、mCherryを+）（ 図3）のためにゲートを設定するために、完全に透過処理し、透過性にないコントロールを使用して、全細菌集団におけるFITC信号を分析します。 </li><li>ゲートを設定すると、サンプルを分析し、サイトゾル対の割合を決定します製造業者のプロトコルに従ってFlowJoソフトソフトウェアを使用して液胞の細菌。 </li></ol></li><li>感染していない透過性のコントロール（ウェルB1 - B3、C1 - C3）：顕微鏡<ol><li>固定<ol><li> PBSを除去し、PBS中の4％PFAの250μlを添加します。 37℃で10分間インキュベートします。 </li><li>ウェルを1mlのPBSで2回洗浄し、固定液をクエンチし、10分間、PBS中の0.1 Mグリシンの250μlを添加します。洗浄ウェルを1mlのPBSで2回。 </li></ol></li><li>二次抗体染色。 <ol><li> PBS中のフルオロフォアに結合さ適切な二次抗体と室温で1時間染色透過コントロールは、0.1％サポニンおよび3％BSAを完全に透過性細胞を補充しました。 </li><li>洗浄は、1mlのPBSで3回カバースリップし、DAPI（1.5μgの/ ml）で培地を実装する際に、分析のためにカバースリップをマウントします。 </li></ol></li><li>顕微鏡分析。 <ol><li>共焦点FLUOを使用して、40Xや63X倍率でコントロールでカバースリップを分析rescence顕微鏡。透過性が働いている場合は、非透過性細胞、digitonin-だけサポニン透過処理した細胞（ 図4）のためのサポニン透過処理した細胞およびPDI染色の両方のためのカルネキシン染色のための染色があってはなりません。 </li></ol></li></ol></li></ol>非標識サルモネラ（顕微鏡ベースの分析）2.ジギトニンアッセイ<ol><li> O / N培養に細菌を準備。 <ol><li>非標識サルモネラ野生型SL1344を接種する（ストレプトマイシン耐性）37°CO / Nでシェーカーにストレプトマイシン（90μgの/ ml）を補充したLB培地3mlでの感染の前に1日。 </li><li>感染のために細胞をプレーティングします。 <ol><li> 1.25×10 5細胞の密度で滅菌ガラスカバースリップを含む24ウェルプレート中の種子BMDMs /ウェルマクロファージ培地1ml（DMEMを、10％ウシ胎児血清（FCSをデ補完、56°Cを補給して、30分）、1％HEPES、1％L-非必須アミノ酸（NEAA）、1％L-グルタミン及び10％L929上清）。シードウェル個々の条件を考慮して、表1に記載の方法。 </li><li> 37℃のインキュベーター中で細胞をO / Nインキュベートし、5％CO 2。 </li></ol></li><li>感染細菌の準備。 <ol><li>次の日、PBSで文化1:10に希釈し、PBSのみのコントロールに対するOD 600を測定することによって、O / N培養中のサルモネラ菌の濃度を決定します。これは、OD 600は 、分光光度計の直線範囲で測定されることを保証します。 </li><li>ミリリットル当たりサルモネラの濃度を決定します。 1のOD 600が 1×10 9細菌に相当します。 </li><li> 1.25×10 6細胞/ mlのサルモネラ濃度に達するように、マクロファージ培地中で細菌を希釈します。 </li></ol></li><li> サルモネラ菌による細胞の感染。 <oL&gt; <li>すべてのウェルから培地を除去します。非感染対照ウェルに平野マクロファージ培地1mlを加える（B1 - B3、C1 - C3）。ウェルA1にサルモネラ懸濁液1mlを加える- A5は、セル当たり10の細菌の感染（MOI）の多数に到達します。 </li><li>感染を同期させるために37℃、300×gで15分間プレートを遠心。 37℃のインキュベーター内でプレートを移し、5％CO 2。 </li></ol></li><li>ゲンタマイシンを有する細胞外サルモネラ菌を殺します。 <ol><li> 1時間感染後に、インキュベーターからプレートを除去し、全てのウェルに細胞外細菌を殺すために1 mg / mlのゲンタマイシンを含むマクロファージ培地の0.1ミリリットルを追加します。 37℃のインキュベーター内でプレートを移し、5％CO 2。 </li></ol></li><li>細胞を洗浄。 <ol><li> 2時間の感染後に、インキュベーターからプレートを取り外しおよび10μg/ mlを含む新鮮なマクロファージ培地1 mlを各ウェル3回洗います 防止するために、ゲンタマイシン残りの細胞外細菌の増殖。 37℃のインキュベーター内でプレートを移し、5％CO 2。 </li></ol></li><li>界面活性剤と抗体と、新鮮な緩衝液を調製しました。 <ol><li>ただ、分析の所望の時点の前に、KHMバッファー（110 mMの酢酸カリウム、20mMのHEPES、2mMのMgCl 2を 、pHが7.3）で1mg / mlとでジギトニンの新鮮なストック溶液を準備します。在庫を濾過し、50μg/ mlのの作業濃度にKHMバッファーに希釈 ジギトニン。 </li><li>また、KHMバッファー中で1/100 1/100または抗PDIでKHM緩衝液中の0.1％サポニンの溶液を調製し、抗サルモネラ -FITC（CSA-1、は0.1μg/ mlで）、抗カルネキシンを補っ3％BSA（抗体濃度のための材料の表を参照）。 </li></ol></li><li>細胞透過。 <ol><li>インキュベーターからプレートを外し、ウェルをKHMバッファー（37℃に予め温めておいた）の0.5ミリリットルで3回洗浄します。 KHM緩衝液を除去し、0.25ミリリットルプレーンKHMバッファを追加井戸A4およびB1 / C1、KHMバッファへのウェルA1にジギトニンで-ウェルA5と（ 表1による）B3 / C3にサポニンでA3とB2 / C2またはKHMバッファ。全てのウェルは、KHMバッファの0.5ミリリットルで3回洗浄し、直ちに室温で正確に1分間インキュベートし、（37℃に予熱しました）。 </li></ol></li><li>一次抗体染色。 <ol><li> KHM緩衝液を除去し、適切なウェル（ 図2、表1）に、一次抗体溶液（ヤギ抗サルモネラ CSA1-FITC、250μL/ウェル、0.1μgの/ ml）を追加します。 37℃のインキュベーターで15分間、プレートをインキュベートし、5％CO 2。 1mlのPBSで洗浄3回。 </li></ol></li><li>固定。 <ol><li> PBSを除去し、PBS中の4％PFAの250μlを添加します。 37℃で10分間インキュベートします。 </li><li>ウェルを1mlのPBSで2回洗浄し、固定液をクエンチし、10分間、PBS中の0.1 Mグリシンの250μlを添加します。洗浄ウェルを1mlのPBSで2回。 </li></ol></li><li>合計感染したサンプルのサルモネラ染色 。 <ol><li>洗浄は、0.1％サポニン/ 3％BSAを含むPBSで3回カバースリップ及び抗CSA1抗体とサンプルインキュベート（ヤギ抗CSA1、0.1μgの/ mlで、マウス抗LPS 0.1 / mlの、同様に動作）1時間0.1％サポニン/ 3％BSAを含むPBS中、室温で。 </li><li> 0.1％サポニン/ 3％BSAを含むPBSで洗浄3倍。暗所で室温で30分間、0.1％サポニン/ 3％BSAを含むPBS中の選択肢の蛍光団に結合された二次抗ヤギ抗体を使用してサンプルをインキュベートします。 </li><li>洗浄は、1mlのPBSで3回カバースリップし、DAPI（1.5μgの/ ml）で培地を実装する際に、分析のためにカバースリップをマウントします。 </li></ol></li><li>顕微鏡分析。 <ol><li>サイトゾルサルモネラ （正の抗サルモネラ -FITC）および全サルモネラ （二重陽性）（ 図5）をカウントすることにより、共焦点顕微鏡を使用してデータを取得します。透過性のコントロールは表示しない必要があります。非透過性細胞、カルネキシンのための染色をサポニン透過処理した細胞（ 図4）のためにジギトニン透過性細胞及びPDI染色にtaining。ウェルズA4とA5は、 サルモネラ染色のための内部コントロールとして機能します。 </li></ol></li></ol></li></ol>

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開示するものは何もありません。

差動透過性は、液胞コンパートメントと細胞質ゾルの間の細菌性病原体の細胞内分布を分析し、定量化するための簡単​​かつ堅牢な方法です。同じアッセイは、 フランシセラnovicida 2,4および赤痢菌 12のような細菌で正常に使用されています。多くの細胞内病原体が宿主細胞内膜構造を変更したり、変更するので、ジギトニン透過化の堅牢性は、個別に決定する必要があります。使用病原体または細胞株に対してでのアッセイの微調整が必​​要になる場合があります。アッセイは、単に感染生物に限定されず、細胞死が17,18シグナリングのような、他の細胞生物学的用途のために使用することができます。 このアッセイの鍵は、原形質膜および細胞内膜は、特に、細胞内膜があまり町を含む、異なる脂質組成を有することですlesterol。ジギトニンは、複雑なコレステロール、従って透過性を差動にリード、ジギトニン処理、界面活性剤の濃度の長さに依存するの効率および選択をすることができます。これを制御するには、そのようなカルネキシン...

細胞内細菌性病原体は、直接宿主細胞サイトゾル中、または特殊な液胞コンパートメント1のいずれかで複製します。感染の初期段階では、ほとんどの病原体は、（マクロファージなど）、または積極的に非食細胞に自分の取り込みを促進することにより、特殊化した細胞による食作用によっていずれかを内在化を受けます。食細胞は、ファゴソームは、通常、貪食粒子が消化される分解室を形成し、リソソームと融合します。このようなフランシセラnovicidaや赤痢菌などの専門サイトゾル細菌は、ファゴソームの破壊を誘導することにより、ファゴソームの劣化を脱出し、続いて細胞質ゾル2,3に逃げ込みます。これは、液胞破裂2-4を促進するエフェクタータンパク質を注入フランシセラ病原性アイランド（FPI）またはフレクスナー赤痢菌 T3SS、などの病原性に関連するメカニズムが必要です。宿主細胞の細胞質ゾルの機能通常、病原体の存在を認識し、5シグナリング自然免疫を誘導する保存されたパターン認識受容体の数。また、xenophagy、オートファジーの抗菌フォームは、細胞質ゾルに入る細菌を分解することができます。細胞質細菌は、通常、十分に平滑または異なる戦略を使用してこれらの応答を回避するように適合されています。例えば、 フランシセラ、ホスト認識を回避するために、そのLPSを変更し、 赤痢菌が分泌エフェクタータンパク質6,7を使用して、オートファジーの動員を防止します。 リソソーム分解をエスケープする別の戦略は、その後、 ネズミチフス菌と呼ばれるモデル液胞病原体サルモネラエンテリカ血清型のネズミチフス菌によって採用されている。 サルモネラ菌はサルモネラ含有液胞（SCV）、その細胞内ニッチに初期ファゴソームを改造エフェクターを注入するT3SSを使用しています8,9。ホスト経路の連続的な操作であります液胞に脂質および他の栄養素を補充することによって、この空胞を維持するために必要。実際、 サルモネラのSIFA変異体は液胞の安定性を維持するために失敗し、先天性免疫経路とオートファジーの動員8の活性化をもたらす感染後時間以内に宿主細胞の細胞質ゾルに入ります。 サルモネラの液胞エスケープ研究である細胞型に依存して変化し、いくつかの報告は、上皮細胞においてさえWT サルモネラ細胞質10にSCVとhyperreplicateを逃れることができることを示しています。最近の報告では、液胞の病原体の自然免疫検出はまた、認識し、病原体含有液胞（のPCV）11-14を不安定化するホストの能力に依存することを示しています。 ホストまたは細菌の遺伝子型の両方が液胞および細胞質コンパートメント間の細胞内細菌の分布に影響を与えることができることを考えると、それは液胞対の数を定量化することが必要ですサイトゾル細菌。以来、ほとんどの実験的な設定で、宿主細胞は、異なる細胞内区画内の複数の細菌を保有することができ、その後、複数の細菌に感染され、この技術は、単一の細菌のレベルで定量化を可能にすることが必要とされます。 （また、ファゴソーム保護アッセイとして知られている）は、差動透過性は、この解像度2,4,10,12を提供します。アッセイは、無傷の液胞の膜を残す洗剤ジギトニン、を有する宿主細胞の原形質膜の選択的透過性に基づいており、したがって、抗体と細胞質の細菌の選択的染色を可能にします。ここでは、差動透過性を使用して、サイトゾルおよび液胞ネズミチフス菌の定量化のための2つのプロトコルを提供します。この方法の原理を図1に記載されている：骨髄由来マクロファージ（BMDMs）は固定相mCherryを発現サルモネラ菌に感染しています。固定相サルモネラトンを必要とします彼らは活動さもなければNLRC4のソームによって認識され、BMDMs 15の急速な細胞死（pyroptosis）を誘発することになるSPI-1 T3SSの発現をダウンレギュレートするため、O使用すること。続いて感染細胞を洗浄し、1分間ジギトニンを50μg/ mlので処理します。細胞を直ちに再び洗浄し、細胞質ゾルへのアクセスを、細菌をマークするためにFITCに結 ​​合された抗サルモネラ抗体と共にインキュベートします。追加の洗浄工程の細胞を溶解しそしてmCherryを+（液胞型）およびFITC + / mCherryを+（サイトゾル）細菌の割合をFACSによって決定された後。また、何の蛍光タンパク質を発現する株は（ 図2）が利用できない場合に使用することができるこの方法の適応を報告しています。追加の手順は、細胞を固定し、完全に透過処理されたFITC標識後に導入されています。その後、全ての細菌は、抗サルモネラ抗体および対応する二次抗体で染色します。 DETectionは、代わりにFACS解析の顕微鏡検査によって行われます。

<table><tbody><tr><td>ジジトニン</td><td>シグマ</td><td>D5628</td><td>50 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>PFA</td><td>mpbio</td><td>219998380</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>酢酸カリウム</td><td>Σ</td><td>791733</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>抗サルモネラ菌 CSA-1-FITC</td><td>KPL</td><td>01-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>抗サルモネラ菌 CSA-1</td><td>KPL</td><td>02-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>抗カルネキシン</td><td>エンツォライフサイエンス</td><td>SPA-860D</td><td>1/100</td></tr><tr><td>抗PDI</td><td>エンツォライフサイエンス</td><td>SPA-890</td><td>1/100</td></tr><tr><td>サポニン</td><td>シグマ</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>ベクタシールド 実装媒体</td><td>ベクターラボ</td>ス <td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギ抗体-488</td><td>分子プローブ</td><td>A-11070</td><td>1/500</td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>ライフ テクノロジー</td>ズ <td>15710-49</td><td>100 &mu;g/ml および 10 &mu;g/ml</td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>プロメガ</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ギブコ</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>シグマ</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Amimed</td><td>5-13K00-H</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 共焦点顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td>イメージング 63X</td></tr><tr><td>FACS フォルテッサ</td><td>BD 技術</td><td></td><td>検出 mCherry 610 nm</td></tr><tr><td>FACS Fortessa</td><td>BDテクノロジー</td><td></td><td>検出FITC 530 nm</td></tr></tbody></table>

液胞対細胞質の定量化<em&gt;サルモネラ</em&gt;差動透過化初代マクロファージで

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

細胞内細菌性病原体は、細胞質ゾル中または特殊な病原体含有液胞（のPCV）で複製することができます。細胞質ゾルに到達するには、 フレクスナー赤痢菌とフランシセラnovicidaなどの細菌は、ファゴソームの破壊を誘導する必要があります。これとは対照的に、 ネズミチフス菌はサルモネラ含有液胞（SCV）として知られている液胞コンパートメントに複製されます。しかし、 サルモネラ菌の特定の変異体は、SCVの完全性を維持することができないので、細胞質ゾル中に放出されます。単一の細菌のレベルで液胞細菌対細胞質ゾルの割合は、ファゴソーム保護アッセイとして知られている、差動透過化することによって測定することができます。アプローチは、選択的にコレステロールを結合するための洗剤ジギトニンの性質を利用しています。細胞膜は、他の細胞膜よりもコレステロールを含んでいるので、ジギトニンが細胞内膜を残して選択的に細胞膜を透過するのに使用することができます無傷。簡潔には、蛍光マーカータンパク質（ 例えば mCherryをとりわけ）を発現する病原体による感染後、宿主細胞の原形質膜は、緩衝液を含むジギトニンで短いインキュベーションで透過されます。次いで、細胞を洗浄し、培養し、任意の細菌に対して向け（お好みの蛍光団に結合された）一次抗体（ 例えば抗サルモネラ -FITC）し、再び洗浄します。マークされていない細菌が使用される場合、追加のステップがあるすべての膜を透過処理され、すべての細菌は、対応する抗体で染色し、実施することができます。染色後、液胞および細胞質細菌の割合は、単一または二重陽性事象をカウントすることによって、FACSまたは顕微鏡により定量することができます。ここでは、菌、ネズミチフス菌でこの技術を使用するための実験の詳細を提供します。このアッセイの利点は、他のアッセイとは対照的に、それは、単一bacteのレベルで定量化を提供することですRIA、顕微鏡で分析した場合に、所定の細胞における細胞質ゾルおよび液胞細菌の正確な数を提供します。

図1と図2は、プロトコル1とプロトコル、得られた結果で重要なステップを示すプロトコル2で説明したジギトニンアッセイの概略図を示す。 図3は、典型的なFACSの結果を示しています。正および負の対照は、mCherryを+ / FITC-細菌（液胞サルモネラ ）とmCherryを+ / FITC +細菌（細胞質ゾルサルモネラ ）のためにゲートを設定するために使用されています。これらのゲートに基づいてサイトゾルおよび液胞細菌の割合は、実験試料で決定することができます。この例では、野生型とΔsifA サルモネラを比較した。 図3 mCherryを+ ネズミチフス菌野生型および骨髄由来のマウスマクロファージにおけるΔsifA変異体を用いて得られた代表的なデータを示している。 図4は、通常のカルネキシン（A）及びPDIを示しています（B）透過性を制御するTで得られ...

私たちは、骨髄由来マクロファージにおける細胞質および液胞性サルモネラ菌のチフス菌の定量化を、ディジタニン透過化を用いて記述します。

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

本実験の全体的な目的は、感染した骨髄由来マクロファージにおける細胞質および液胞内のSalmonella Typhiの割合を決定することです。これは、Mcherryを発現するSalmonella Typhiをマクロファージに感染させることで達成されます。第二のステップとして、細胞を界面活性剤であるTriton X-100で処理し、液胞膜ではなく細胞膜のみを透過性にします。次に、Fluorofor Ziが結合した抗サルモネラ抗体で細胞を染色します。細胞質内のSalmonella typhimuriumを標識し、蛍光活性化細胞選別法（FACS）に基づいて、全細菌数に対する細胞質内細菌の割合を算出します。これらの手法は、細胞内病原体が液胞（VA）内で複製されるのか、あるいは細胞質内で複製されるのかといった、病原体相互作用の分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。個別の条件を考慮し、感染の1日前に、ストレプトマイシンとアンピシリンを添加した3 mLのLuria-Bertani培地を用い、37 °Cのシェーカーで細菌株を一晩培養します。感染のために細胞を播種する24ウェルプレートのウェルに、コントロールとして使用するカバースリップを配置します。野生型骨髄由来マクロファージ（BMDMs）を、1ウェルあたり0.125 million cellsの密度で1 mLの一次マクロファージ培地に播種し、その後、37 °C、5% CO2のインキュベーターで一晩培養します。翌日。希釈した培養液の600ナノメートルにおける吸光度（OD 600）をリン酸緩衝生理食塩水を用いて測定し、オーバーナイト培養液中のsalmonellaの濃度を決定します。これにより、分光光度計の線形範囲内でOD 600を測定することができます。1 mLあたりのサルモネラ菌濃度を算出します。OD 600が1の場合、10億個に相当します。細胞にサルモネラ菌を感染させるため、マクロファージ培地を用いて細菌を希釈し、サルモネラ菌濃度を1 mLあたり125万個に調整します。B MDMから培地を除去します。非感染コントロールウェル（B1〜B3およびC1〜C3）に、マクロファージ培地を1 mLずつ加えます。次に、感染多重度を細胞あたり10個の細菌にするため、ウェルA1〜A5にサルモネラ懸濁液を1 mLずつ加えます。感染を同期させるため、プレートを300 ×g、37 °Cで15分間遠心分離し、その後、感染から1時間後まで37 °C、5% CO2条件下でインキュベートします。インキュベーターからプレートを取り出し、細胞外細菌を死滅させるためにジェンタマイシン含有マクロファージ培地を0.1 mL加えます。すべての細胞を同様に処理するため、非感染コントロールを含むすべてのウェルにgentamycinを添加します。その後、感染から2時間後に、プレートを37 °C、5% CO2のインキュベーターに移します。インキュベーターからプレートを取り出し、すべてのウェルを、あらかじめ加温した1 mLのDulbecco's Modified Eagle's Medium（DMEM）で2回洗浄します。分析予定の時刻の直前にプレートをインキュベーターに戻す前に、残存する細胞外細菌の増殖を防ぐため、DMEMをゲンタマイシン含有の予熱済みマクロファージ培地に交換します。digitonin含有KHMバッファーおよびsaponin含有KHMバッファーを含む、新鮮なKHMバッファー溶液を調製します。細胞透過性を高めるために本文のプロトコルに記載されている抗体溶液を準備し、プレートをインキュベーターから取り出して、ウェルを0.5 mLの予熱済みKHMバッファーで3回洗浄します。次にKHMバッファーを除去し、ウェルA4、B1、C1に0.25 mLのプレーンKHMバッファーを、ウェルA1〜A3、B2、C2にdigitonin含有KHMバッファーを、ウェルA5、B3、C3にsaponin含有KHMバッファーをそれぞれ添加します。室温で正確に1分間インキュベートした後、直ちにすべてのウェルを予熱した0.5 mLのKHMバッファーで3回洗浄します。最後に、KHMバッファーを除去し、適切なウェルに一次抗体溶液を添加して、プレートを37 °C、5% CO₂条件下で15分間インキュベートします。インキュベーション後、ウェルA1〜A5の感染細胞を1 mLのPBSで1回洗浄します。細胞をPBSで3回洗浄し、 FACS解析の準備を行います。次に、0.1% Tritonを含む氷冷したPBSを0.5 milliliters加えます。続いて、サンプルを氷上に保持したまま、細胞凝集塊を分散させるため、セルストレーナーキャップ付きの5 milliliter FACSチューブに細胞懸濁液を移します。完全透過性コントロールを用いて、フローサイトメーターでサンプルを解析します。前方散乱光、側方散乱光、およびmCherryシグナルに基づき、全細菌のゲートを設定します。次に、完全透過性コントロールおよび非透過性コントロールを用いて、全細菌集団におけるfitzシグナルを解析し、細胞質内細菌および液胞内細菌のゲートを設定します。FlowJoソフトウェアを用いてサンプルを解析し、細胞質内細菌と液胞内細菌の割合を決定します。ウェルB1〜B3およびC1〜C3の非感染透過性コントロールについて、メーカーのプロトコルに従い、PBSを除去して250 µLのPBS中4%パラホルムアルデヒドを加え、37 °Cで10分間インキュベートして顕微鏡観察の準備を行います。インキュベーション後、ウェルを1 mLのPBSで2回洗浄し、固定液をクエンチするために0.1 M glycine in PBS 250 µLを加え、10分間静置します。その後、ウェルを1 mLのPBSで2回洗浄し、二次抗体染色を行います。PBSに0.1%サポニンおよび3%BSAを添加し、蛍光色素が結合した適切な二次抗体を用いて、透過性コントロールを室温で1時間染色します。細胞を完全に透過させるため、カバーガラスを1 mLのPBSで3回洗浄し、DAPIを含む封入剤を用いて解析用にカバーガラスを封入します。共焦点蛍光顕微鏡を用い、40倍または63倍の倍率でコントロールを含むカバースリップを解析します。ここでは代表的な結果を示しています。ポジティブコントロールとネガティブコントロールの結果を用いて、細胞質に存在するm cherry陽性かつFITC陽性のサルモネラ菌、および液胞内に存在するm cherry陽性かつFITC陰性のサルモネラ菌のゲートを設定します。これらのゲートに基づき、実験サンプルの細胞質および液胞内の細菌の割合を決定します。この例では、mCherry陽性のSalmonella typhimurium野生株とCA欠損変異株を比較しています。ここに示されているのは、digitoninまたはsaponinで処理した透過コントロールで得られたcalnexinおよびPD-1の染色です。calnexinは小胞体膜タンパク質であるため、digitoninおよびsaponin透過細胞の両方において、細胞質全体および核の周囲にcalnexin染色が認められます。digitonin透過コントロールでは、PD-1染色は認められません。染色結果はsasinおよびperme細胞で観察可能です。ここでは、toninで透過処理を施した細胞における抗サルモネラ染色結果を示します。全細菌は赤色、細胞質内の細菌は緑色で表示されています。E陽性集団は、細胞質にアクセス可能なサルモネラ菌です。一方、fite陰性集団は、損傷のないサルモネラ含有液胞（SCV）内に留まっている細菌であり、そのためサルモネラFSE標識から保護されています。ここでは、野生型サルモネラ菌とCFE欠損変異株を比較しています。CAはサルモネラ菌がSCVの完全性を維持するために必要であるため、サルモネラ菌の割合が増加します。このビデオを視聴することで、液胞内および細胞質内の細菌の割合を決定する方法について十分に理解できるはずです。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーによるナノ粒子と細菌の細胞内在化を分析する

このビデオは、骨髄由来マクロファージ(BMM)の寄生虫の細胞内増殖を定量化するアッセイを示しています。マクロファージ細胞は、リーシュマニアの運動性侵襲期と非運動性の浸潤期にそれぞれ感染し、メタサイクリック前胸茎と無形成性に浸潤します。寄生虫はマクロファージに侵入し、寄生虫の液胞に内在化され、内部で増殖します。細胞内寄生虫の増殖は、マクロファージと寄生虫核を蛍光染色した上で顕微鏡を用いて定量化されます。...

マクロファージにおける寄生虫の細胞内増殖を定量化するためのIn vitroアッセイ

このビデオは、骨髄由来マクロファージ内の細胞質および液胞性サルモネラチフス菌を差動透過化を使用して定量するアッセイを示しています。マクロファージは、蛍光タンパク質を発現するサルモネラ菌に感染しており、サルモネラ菌含有液胞またはSCVと呼ばれる特殊な液胞構造内に取り込まれます。細菌の一部はSCVから逃れてサイトゾルに入ります。マクロファージのコレステロールが豊富な原形質膜は、ジギトニンを使用して透過処理され、SCVはそのまま残ります。細胞質細菌を蛍光標識抗体で標識すると、液胞細菌と細胞質細菌の割合が蛍光活性化細胞選別(FACS)を使用して定量されます。...

感染した初代マクロファージにおける細胞質および液胞性サルモネラ菌の定量化アッセイ

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細胞内病原体によって引き起こされる液胞破裂のシングルセル測定

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表現型のハイスループットアッセイサルモネラ菌ネズミチフス菌協会、侵略、およびマクロファージにおける複製

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細胞内細菌によって遠藤-リソソームシステムの再構築を検討するために、蛍光ナノ粒子の応用

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細胞内マクロファージの内部成長の定量化は高速とリーシュ マニア原虫の病原性を評価するための信頼性の高い方法です。

Efferocytosis、アポトーシス細胞の貪食除去は恒常性を維持するために必要な受容体と認識、キャニスター、アポトーシス細胞の内面化を可能にするシグナル伝達経路によって促進されます。ここで、efferocytosis の定量化と efferocytic シグナル伝達経路の活性の蛍光顕微鏡のプロトコルを提案する.

単一細胞の蛍光顕微鏡による Efferocytosis の定量化

ここでは、強化された緑色蛍光タンパク質発現大腸菌を用いたマウス腹腔マクロファージの貪食能を評価するためのプロトコルを提案する.

緑色蛍光タンパク質-表現する拡張を使用するマウス腹腔マクロファージの貪食能を評価するために大腸菌

サルモネラ菌は、サルモネラ菌特異的液胞と細胞質ゾル中の遊離の両方で腸上皮細胞内に侵入して複製します(過剰複製)。ここでは、ImageJを介した2つの相補的な画像分析によってサルモネラ菌の細胞内表現型を定量化し、単一細胞の分解能とスコアリングを達成するためのハイスループット蛍光顕微鏡ベースのプロトコルについて説明します。...

ImageJを用いた サルモネラ菌 の細胞内表現型自動解析

学ぶ差動ジギトニン透過化を用いて骨髄由来マクロファージ内のSalmonella typhimuriumの液胞対細胞質分布を定量化する方法。FACS解析により細菌の細胞内局在を明らかにし、宿主病原体相互作用の理解に貢献します。

液胞対細胞質の定量化

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